体腔积液抑制剂的制作方法

体腔积液抑制剂的制作方法
【专利摘要】本发明的目的是提供体腔积液抑制剂，其有效对抗施用利尿剂不能获得治疗效果的体腔积液，并且即使当全身施用时其也可以发挥治疗效果。本发明提供体腔积液抑制剂，其包含干扰素与聚亚烷基二醇的共价缀合物作为活性成分。
【专利说明】体腔积液抑制剂

【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及体腔积液抑制剂。

【背景技术】
[0002]动物体内存在大量的水，而主要充满在组织间或体腔、导管或循环系统内的空间的细胞外液(例如组织液、体腔液、血液或淋巴液)被称为“体液”。特别是，存在于体腔中的液体被称为“体腔液”(例如胸腔积液、腹水或心包积液)。虽然健康人中存在少量的体腔液，已知在患有例如肝脏疾病、肾脏疾病、心脏疾病、癌症或炎性疾病的患者的体内保持有大量的体腔液。随着体腔积液的发展，发生例如胸部疼痛、腹部疼痛、饱胀感和呼吸困难的症状。由于这些症状极大地降低患者的生活质量(QOL)，有必要在早期进行除去体腔液的治疗。
[0003]虽然体腔积液的主流治疗方法是施用利尿剂的药物治疗，在症状严重的情况将管子插入到体腔中，通过抽吸直接除去体腔液。在临床研究中，高剂量的干扰素_α或干扰素_β被局部施用到患有例如消化系统癌症或卵巢癌的患者的体腔中，力图抑制癌性(或恶性)胸腔积液或腹水的积聚(非专利文献1-3)。但是，还未获得可用于临床应用的抑制体腔积液的效果。
[0004]就被用作病毒介导的肝脏疾病、多发性硬化或癌症的治疗剂的干扰素而言，已经开发了干扰素制备物，其通过干扰素和聚乙二醇的共价结合获得提高的体内可持续性(专利文献1-6和非专利文献4和5)。
[0005]引用文献列表专利文献:
专利文献1:美国专利N0.4，917，888 专利文献2:国际公开WO 1987/00056 专利文献3:国际公开WO 1999/55377 专利文献4:国际公开WO 2000/23114 专利文献 5:JP Η9-25298 A (1997)
专利文献 6:JP Patent N0.4，850，514 非专利文献:
非专利文献 1:Gavin 等，Cancer, (1993) Vol.71，pp.2027-2030非专利文献 2:Wakui 等，B1therapy, (1988) Vol.2, pp.339-347非专利文献 3 =Gebbia 等，In Vivo, (1991) Vol.5，pp.579-582非专利文献 4:Pepinsky 等，The Journal of Pharmacology and ExperimentalTherapeutics, (2001) Vol.297, pp.1059-1066
非专利文献 5:Bailon 等，B1conjugate Chemistry, (2001) Vol.12, pp.195-202。
[0006]发明简述发明要解决的问题
然而，为治疗体腔积液的目的使用利尿剂具有引起被施用该利尿剂的患者电解质失衡，从而引起不舒服感的风险。在该情况下，存在的问题是如果排尿变得困难，则体腔积液加重。此外，在腹膜扩散或腹水的情况下，利尿剂对于体腔积液去除的效果是不够的，而且其治疗效果是有限的。尽管由于穿刺使巨大的负担被加诸于患者身上，通过直接抽吸去除体腔液仅具有暂时性的效果，而且另外还有个问题是由于白蛋白和球蛋白的丧失，它使营养状况或免疫状况恶化。
[0007]还有，在恶性胸腔积液和腹水的情况下，干扰素-β的单次施用(非专利文献3)、干扰素-α的间歇施用(非专利文献I)、或干扰素-α的腹腔内(即局部)施用都不会导致以临床显著的水平抑制体腔液量。在恶性腹水的情况下，进一步，每周三次局部施用6，000, 000单位的干扰素(这也被应用于其它适应症)，不产生任何实质的治疗效果。进一步，以18，000，000单位的剂量进行每天和局部施用仅导致低至少于50%的反应率(非专利文献2)。即使当干扰素被连续地局部施用到体腔中时，相应地，也不可能获得可用于临床应用的抑制体腔积液的效果。
[0008]相应地，本发明的目的是提供体腔积液抑制剂，其对抵抗利尿剂施用的体腔积液具有药效，并且能够通过全身施用发挥治疗效果。
[0009]解决问题的方法
本发明人进行了集中的研究以解决该问题。结果，他们发现干扰素与聚亚烷基二醇的共价缀合物对于体腔积液具有非常好的抑制效果，并完成了本发明。
[0010]特别地，本发明提供体腔积液抑制剂，其包含，作为活性成分的，干扰素与聚亚烷基二醇的共价缀合物。
[0011]聚亚烷基二醇优选为聚乙二醇。
[0012]干扰素优选为I型干扰素或干扰素-λ，并且在I型干扰素的各种类型中，干扰素-α或干扰素-β是特别优选的。
[0013]体腔积液抑制剂优选抑制胸腔积液或腹水的积聚，并且胸腔积液或腹水优选是难治性的由于癌症、肝硬化或肾衰竭而积聚的胸腔积液或腹水。
[0014]特别地，在大部分难治性胸腔积液或腹水的情况中，利尿剂施用的效果是无法预料的，因此认为使用体腔积液抑制剂进行的治疗具有显著的临床意义。
[0015]体腔积液抑制剂可以被局部施用到体腔中，但优选用于全身施用。在该情况下，全身施用更优选是选自由皮下施用、皮内施用、肌内施用、静脉施用和动脉施用组成的组中的一种。
[0016]通过全身施用，可以减少对体腔内的局部施用过程中对内脏器官的不正确穿刺、腔内感染、以及在体腔中存在癌细胞的情况下加速转移的风险。与腔内施用相比，可以进行全身施用的医疗设备和卫生保健专业人员的范围被扩大了。此外，肌内施用或皮下施用可以通过自我注射进行。
[0017]虽然体腔积液抑制剂可以以每天一次或两次的间隔每天施用，优选以每两天或更多天一次的间隔进行间歇施用，更优选以每两天至一个月一次的间隔进行间歇施用，进一步优选以每周一次或两次至每月一次的间隔进行间歇施用，以及特别优选的是以每周一次或两次的间隔进行间歇施用。
[0018]进一步，体腔积液抑制剂与抗肿瘤剂的组合使用是有效的。在该情况下，抗肿瘤剂优选是选自由5-FU、替加氟-尿嘧啶、替加氟-吉美拉西-奥特拉西和卡培他滨组成的组的至少一种抗肿瘤剂。
[0019]发明效果
根据本发明的体腔积液抑制剂能够抑制体腔积液并通过全身施用以及通过局部施用除去体腔液。因此，根据本发明的体腔积液抑制剂可以对体腔积液发挥治疗效果并减轻由于体腔积液导致的胸部疼痛、腹部疼痛、强烈的饱胀感和呼吸困难。
[0020]附图简述
图1显示了在胃癌腹膜转移小鼠模型中观察到的干扰素-β与聚乙二醇的共价缀合物的腹膜内施用用于抑制腹水积聚的效果。
[0021]图2显示了在胃癌腹膜转移小鼠模型中观察到的干扰素-β与聚乙二醇的共价缀合物的皮下施用用于抑制腹水积聚的效果。
[0022]图3显示了在胃癌腹膜转移小鼠模型中观察到的干扰素-α与聚乙二醇的共价缀合物的皮下施用用于抑制腹水积聚的效果。
[0023]图4显示了在胃癌腹膜转移小鼠模型中观察到的干扰素-β与聚乙二醇的共价缀合物的腹腔内施用用于抑制腹水积聚的复发(即腹水穿刺术后的再积聚)的效果。
[0024]图5显示了在胃癌腹膜转移小鼠模型中观察到的干扰素-β与聚乙二醇的共价缀合物的皮下施用用于抑制腹水积聚的复发(即腹水穿刺术后的再积聚)的效果。
[0025]图6显示了在卵巢癌腹膜转移小鼠模型中观察的干扰素-β与聚乙二醇的共价缀合物的皮下施用用于提高存活率的效果。
[0026]用于实施发明的实施方案
根据本发明的体腔积液抑制剂的特征在于它包含，作为活性成分的，干扰素与聚亚烷基二醇的共价缀合物。
[0027]—分子、两分子或更多分子的聚亚烷基二醇可以与一分子的干扰素结合。与一分子干扰素结合的聚亚烷基二醇分子的总分子量优选为5，000至240，000，更优选为10，000至80，000，且进一步优选为39，000至45，000。在本文中，当两分子聚亚烷基二醇(每个的分子量为20，000)与一分子干扰素共价结合时，这意味着具有40，000分子量的聚亚烷基二醇与一分子干扰素共价结合。
[0028]一分子、两分子或更多分子的干扰素可以与一分子聚亚烷基二醇结合。即使是在这种情况下，一个聚亚烷基二醇分子的分子量优选为5，000至520，000，更优选为10，000至200，000,且进一步优选为 39，000 至 45，000。
[0029]一个聚亚烷基二醇分子由很多重复单元组成，且聚亚烷基二醇的分子量通常随单个分子而不同。因此，聚亚烷基二醇的分子量被表示为平均分子量。在本说明书中，相应地，聚亚烷基二醇的分子量是指平均分子量。
[0030]作为聚亚烷基二醇，可优选使用可被接受作为药物载体的，无活性的或对于活体具有极低活性的以及无毒性的或者具有极低毒性的聚合物。
[0031]干扰素的实例包括与天然存在的干扰素具有相同氨基酸序列的蛋白质(以下称“天然存在的干扰素”)，具有来源于天然存在的干扰素的氨基酸序列并通过缺失、取代或添加一个或几个氨基酸获得的氨基酸序列并具有干扰素的生物学活性(以下称“干扰素活性”)的氨基酸突变干扰素，具有由天然存在的干扰素修饰的糖链部分的干扰素，以及没有糖链部分的干扰素。
[0032]干扰素的实例还包括通过在天然存在的干扰素的氨基酸序列或核苷酸序列的基础上通过基因工程方法制备的重组干扰素。
[0033]干扰素可以通过传统技术例如从组织中提取，通过基因工程方法进行蛋白质合成，或者用表达干扰素的天然或重组细胞进行生物学生产获得。可商业获得的干扰素也可以被用作干扰素。
[0034]干扰素优选是I型干扰素或干扰素-λ。I型干扰素的实例包括干扰素-α、干扰素-β、干扰素-ω、干扰素-ε和干扰素-K，并且干扰素-α或干扰素-β是更优选的。
[0035]术语“干扰素与聚亚烷基二醇的共价缀合物”指一分子、或两分子或更多分子的聚亚烷基二醇与一分子干扰素共价结合并具有干扰素活性的缀合物，或者一分子、或两分子或更多分子的干扰素与一分子聚亚烷基二醇共价结合并具有干扰素活性的缀合物。一分子、或两分子或更多分子聚亚烷基二醇与一分子干扰素共价结合并具有干扰素活性的缀合物是优选的。干扰素与聚亚烷基二醇的共价缀合物可以是干扰素与聚亚烷基二醇直接结合的缀合物，或者干扰素与聚亚烷基二醇通过接头等结合的缀合物。
[0036]干扰素与聚亚烷基二醇的共价缀合物的剂量可以用干扰素滴度(单位；以下显示为“U”)或质量(g)表示。相比与聚亚烷基二醇共价结合之前的干扰素，干扰素与聚亚烷基二醇的共价缀合物优选保留至少10%的干扰素比活性(即单位重量的干扰素活性)。
[0037]在本说明书中，聚合物与蛋白质的结合也被称为化学修饰或者用聚合物对蛋白质的修饰。干扰素与聚亚烷基二醇的共价缀合物也被称为用聚亚烷基二醇化学修饰的干扰素或者简单称为修饰的干扰素。特别地，干扰素与聚乙二醇(以下简称为“PEG”)的共价缀合物也被称为PEG-修饰的干扰素，聚乙二醇化干扰素或PEG-结合的干扰素。
[0038]干扰素在例如干扰素的氨基、硫醇基、N-末端、C-末端或糖链上与聚亚烷基二醇共价结合。或者，通过已知的基因工程技术被引入到干扰素中的非天然存在的氨基酸可以被用作共价结合的位点。
[0039]干扰素与聚亚烷基二醇的共价缀合物的干扰素活性可以通过已知的生物学测定技术测定。特别地，为确定干扰素活性，可以用包含干扰素的分析物处理对干扰素高度敏感的细胞(例如FL细胞)，可以向被处理的细胞加入给定量的感染性辛德毕斯病毒{Sindbisvirus)、水疱性口炎病毒{Vesicular stomatitis virus,缩写为“VSV”)等以感染细胞，并可以测定由干扰素诱导的对病毒的抗性程度(以下称为“抗病毒活性”)。使用病毒生长的抑制作为指标测定抗病毒活性，且它可以表示为干扰素滴度(U)，所述干扰素滴度基于抑制50%的病毒生长导致的破坏细胞的细胞病变作用(缩写为“CPE”)的分析物的稀释倍数(Shigeyasu Kobayashi 等，uMenneki Seikagaku Jikkenhou in Zoku Seikagaku JikkenKoza 5 (Successive Course on B1chemical Experiment 5: Experimental Approachesin Immunob1chemistry)), Japanese B1chemical Soc.ed., Tokyo Kagaku Dojin,(1986) p.245)。
[0040]干扰素与聚亚烷基二醇的共价缀合物可以通过已知的技术产生。例如，在美国专利N0.4，917，888和国际公布的WO 1987/00056中描述了聚亚烷基二醇与干扰素的氨基共价结合的方法。在国际公布的WO 1999/55377中描述了聚亚烷基二醇与干扰素的硫醇基共价结合的方法。在国际公布的WO 2000/23114和JP H09-25298 A (1997)中描述了聚合物与干扰素的N末端共价结合的方法。在Macromolecular Chemistry (1978) Vol.179,p.301和美国专利N0.4，101，380和4，179，337中描述了聚亚烷基二醇与干扰素的糖链共价结合的方法。在 B10rganic & Medicinal Chemistry Letters (2004) Vol.14, pp.5743-5745中描述了聚亚烷基二醇与被引入到干扰素中的非天然存在的氨基酸共价结合的方法。聚亚烷基二醇与干扰素C末端的共价结合可以通过将半胱氨酸或非天然存在的氨基酸引入到C末端或其附近来实现。
[0041]有必要使聚亚烷基二醇的末端活化以发生共价结合反应，该反应依赖于在干扰素和聚亚烷基二醇之间成键的方法。包含用羟基琥珀酰亚胺酯、硝基苯磺酸酯、马来酰亚胺、正吡啶基二硫化物、乙烯砜、马来酰亚胺、碘乙酰胺、羧酸、叠氮化物、膦或胺结构活化的末端的聚亚烷基二醇衍生物可以用于干扰素与聚亚烷基二醇的共价结合，并且这种聚亚烷基二醇衍生物可以用已知技术合成。
[0042]干扰素与聚亚烷基二醇的共价缀合物优选是干扰素与PEG的共价缀合物。在优选的干扰素与PEG的共价缀合物中，分子量为5，000至240，000，优选10，000至80，000，且更优选39，000至45，000的一个PEG分子与一个干扰素分子共价结合。
[0043]干扰素与PEG的共价缀合物的优选实例是人干扰素-β与PEG的共价缀合物，其可以通过例如日本专利N0.4，850，514中描述的方法制备。PEG优选在人干扰素-β的氨基酸序列的位置19或134的赖氨酸的氨基上与人干扰素-β结合，而且一个PEG分子在该位点上与人干扰素-β共价结合的共价缀合物是更优选的。一个特定的实例是分子量为40，000或更高(优选42，000)的一个PEG分子与人干扰素-β在其氨基酸序列的位置134的赖氨酸的氨基上共价结合的共价缀合物。
[0044]本文中所使用的术语“人干扰素-β的氨基酸序列的位置134的赖氨酸”指位于从人干扰素-β的氨基酸序列的N末端氨基酸(甲硫氨酸；指定为位置I)起的位置134的氨基酸赖氨酸，所述人干扰素-β由166个氨基酸组成(SEQ ID NO:1)。在本文中，干扰素中氨基酸残基的位置表示为相对于被指定为位置I的干扰素N末端氨基酸的位置编号。
[0045]干扰素与PEG的共价缀合物的另一个优选实例是人干扰素-α与PEG的共价缀合物。特定的实例包括干扰素- α与PEG的共价缀合物，其中分子量为大约40，000的一个分枝型PEG分子与人干扰素-a-2a在一个赖氨酸残基(主要位点:位置31，121, 131和134)上通过酰胺键共价结合的共价缀合物(通用名:聚乙二醇干扰素a-2a);以及干扰素- α与PEG的共价缀合物，其中分子量为大约12，000的一个甲氧基-PEG分子与人干扰素a -2b在一个氨基酸残基(位置I上的半胱氨酸，位置7上的组氨酸，位置31上的赖氨酸，位置34上的组氨酸，位置49上的赖氨酸，位置83上的赖氨酸，位置112上的赖氨酸，位置121上的赖氨酸，位置129上的酪氨酸，位置131上的赖氨酸，位置133上的赖氨酸，位置134上的赖氨酸，位置163上的丝氨酸或位置164上的赖氨酸)上通过羰基共价结合的共价缀合物(通用名:聚乙二醇干扰素a_2b)。
[0046]术语“体腔”指动物体中相对其外部以隔离状态形成的空间，其包括胸腔、腹腔和心包腔。术语“体腔液”指存在于体腔中的液体，存在于胸腔、腹腔或心包腔中的液体分别被称为胸腔积液、腹水或心包积液。
[0047]术语“体腔积液”指在体腔中存在大于正常量的体腔液。术语“体腔积液抑制剂”指具有抑制体腔液积聚并除去体腔液的效果的药物。
[0048]体腔积液抑制剂对于体腔积液的的体腔积液抑制效果可以使用引起体腔积液的基础疾病(例如癌症)的疾病模型来检测。这种疾病模型的实例包括胃癌腹膜转移小鼠模型(Cancer Science, (2003) Vol.94，pp.112-118)和卵巢癌腹膜转移小鼠模型(Molecular cancer therapeutics, (2007) Vol.6, pp.2959-2966)。
[0049]体腔积液抑制剂可用于预防或治疗体腔液的积聚，而且它还可以用于抑制体腔积液物理清除之后的其复发。体腔积液抑制剂优选可用于对抗胸腔积液和腹水的积聚。
[0050]引起体腔积液的基础疾病的实例包括癌症、传染病(例如细菌、结核、真菌、非典型性肺炎、病毒或寄生虫感染)、炎性疾病(例如胰腺炎、结节病或石棉肺)、结缔组织疾病(例如风湿病、系统性红斑狼疮、干燥综合症、韦格纳氏肉芽肿病或Churg-Strauss综合征)、内分泌性疾病(例如粘液性水肿)、肝脏疾病(例如肝硬化)、肾脏疾病(例如肾病综合征)和心脏疾病(例如充血性心力衰竭)。体腔积液抑制剂可以对由这些疾病引起的体腔积液发挥治疗效果。
[0051]此外，体腔积液抑制剂对于难治性体腔积液也可以发挥治疗效果，它特别优选用于对抗难治性胸腔积液和腹水的积聚。术语“难治性体腔积液”指通过例如利尿剂的治疗难以控制的体腔积液(即利尿剂-抵抗的或利尿剂-耐受的)，包括例如由癌症、肝硬化或肾衰竭引起的胸腔积液和腹水的积聚。
[0052]在难治性胸腔积液或腹水中，特别地，由于癌症引起的胸腔积液和腹水分别被称为癌性(恶性)胸腔积液和癌性(恶性)腹水，而且已知它们的症状是严重的。但是体腔积液抑制剂对于恶性胸腔积液或恶性腹水的积聚也具有治疗效果。恶性胸腔积液或恶性腹水是由于癌症的胸内转移或腹膜转移或癌症引起的胸膜炎或腹膜炎导致的。
[0053]体腔积液抑制剂特别优选用于治疗或预防难治性胸腔积液或难治性腹水中的恶性胸腔积液或恶性腹水。
[0054]为了补充或增强抑制体腔积液的效果或减少剂量，体腔积液抑制剂可以以足够的量与其它试剂混合使用，或者与其它试剂组合使用。
[0055]可以与体腔积液抑制剂组合使用的药物的实例包括那些通常用于治疗引起体腔积液的基础疾病的药物。当要抑制癌性体腔积液时，例如，抑制剂可以与抗肿瘤剂组合使用。优选的组合使用的抗肿瘤剂的实例包括分子靶向试剂、烷化剂、抗代谢物、微管抑制剂、拓扑异构酶抑制剂、钼药物和抗癌抗生素。抗肿瘤试剂的更优选的实例特别是顺钼、卡钼、盐酸伊立替康、5-FU、替加氟-尿嘧啶、替加氟-吉美拉西-奥特拉西、卡培他滨、紫杉醇、泰索帝、伊马替尼和舒尼替尼。替加氟-吉美拉西-奥特拉西钾(商品名:TS-D是特别优选的替加氟-吉美拉西-奥特拉西的形式。与抗肿瘤试剂组合使用的体腔积液抑制剂可以与抗肿瘤剂同时施用。为了增强抑制腹水的效果，可替代地，抑制剂还可以与抗肿瘤剂分别施用，在抗肿瘤剂治疗之前或之后施用。
[0056]根据本发明的体腔积液抑制剂可以与抗肿瘤剂以混合制备物的形式施用到单一部位。或者，这些试剂可以分别施用到相同的部位或不同的部位。
[0057]根据受试者的年龄、体重和症状，剂型，施用途径等充分地确定体腔积液抑制剂施用的剂量(滴度)和频率。试剂可以以10，000 U-18, 000, 000 U/剂量的剂量以每天一次或两次的间隔每天施用给人受试者。间歇施用优选以每两天或更多天一次的间隔，更优选以每两天至一个月一次的间隔，更优选以每周一次或两次至每月一次的间隔，以及特别优选以每周一次或两次的间隔进行。
[0058]体腔积液抑制剂可用作用于针对哺乳动物(例如小鼠、大鼠、仓鼠、兔、狗、猴、牛、羊或人)的体腔积液的治疗和预防的药物。
[0059]在临床环境中，干扰素与聚亚烷基二醇的共价缀合物可以直接使用，或者它可以与已知的药学可接受的载体、赋形剂等混合，以药物组合物的形式使用。
[0060]体腔积液抑制剂可以全身地或局部地施用。在本文中，局部施用指在希望产生直接效果的部位；即体腔液将要积聚或已经积聚的部位施用。例如，针对腹水积聚的体腔积液抑制剂的腹腔内施用属于局部施用的类别。全身施用指施用的方式允许药物通过消化系统或者除消化系统以外的途径吸收，并提供遍及全身的(非局部的)效果，在希望产生直接效果的部位以外的部位；即体腔液将要积聚或已经积聚的部位以外的部位。全身施用的实例包括口服施用、腹腔内施用(不包括腹水积聚的情况)、皮下施用、皮内施用、肌内施用、静脉施用和动脉施用。应当注意针对腹水积聚的体腔积液抑制剂的腹腔内施用对应局部施用。优选体腔积液抑制剂被全身施用，且更优选该抑制剂被皮下、皮内、肌内、静脉或动脉施用。
[0061]体腔积液抑制剂的优选实例包括包含作为活性成分的干扰素与PEG的共价缀合物的，并且其使用是以两天或更多天的间隔进行全身施用和间歇施用的体腔积液抑制剂。在更优选的实例中，体腔积液抑制剂包含，作为活性成分的，干扰素-α或干扰素与PEG的共价缀合物，并且其使用是以两天或更多天的间隔进行全身施用和间歇施用。在更优选的实例中，体腔积液抑制剂包含，作为活性成分的，干扰素-α或干扰素与PEG的共价缀合物，并且其使用是以两天或更多天的间隔进行皮下施用和间歇施用。在特别优选的实例中，体腔积液抑制剂包含，作为活性成分的，干扰素-α或干扰素与PEG的共价缀合物，并且其使用是以每周一次或两次的间隔进行皮下施用，而且用于抑制难治性胸腔积液或腹水的积聚。
[0062]用于口服施用的体腔积液抑制剂的剂型的实例包括片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、糖浆剂、乳剂和混悬剂。剂型可以根据已知技术生产，并包含药物领域通常使用的载体或赋形剂。用于片剂的载体和赋形剂的实例包括乳糖、麦芽糖、蔗糖、淀粉和硬脂酸镁。
[0063]用于肠胃外施用的体腔积液抑制剂的剂型的实例包括注射制剂、滴眼剂、软膏剂、泥敷剂、栓剂、经鼻吸收剂、经肺吸收剂、经皮吸收剂和控释局部试剂，它们可以根据已知技术生产。液体制剂可以通过，例如，将干扰素与聚亚烷基二醇的共价缀合物溶解于用于注射制剂的无菌水溶液中，或者将该缀合物悬浮于提取液中并乳化以使该缀合物镶嵌到脂质体中来制备。固体制剂可以通过例如将赋形剂如甘露醇、海藻糖、山梨醇、乳糖或葡萄糖加入到干扰素与聚亚烷基二醇的共价缀合物中并制备冻干产物来制备。进一步，该冻干产物可以被制成粉末并使用。或者，粉末可以与聚乳酸或乙醇酸混合，且得到的混合物可以被固化并使用。凝胶剂可以通过将干扰素与聚亚烷基二醇的共价缀合物溶解于增稠剂或多糖，例如甘油、PEG、甲基纤维素、羧甲基纤维素、透明质酸或硫酸软骨素中来制备。
[0064]稳定剂，例如人血清白蛋白、人免疫球蛋白、α 2巨球蛋白或氨基酸可以被添加到任何上述制剂中，并且可以添加分散剂或吸收促进剂，例如乙醇、糖醇、离子型表面活性剂或非离子型表面活性剂，条件是干扰素活性不被破坏。视情况还可以添加痕量的金属或有机酸盐。
实施例
[0065]本发明结合下述实施例进行更详细描述，虽然本发明的技术范围并不局限于这些实施例。
[0066][实施例1]干扰素与PEG的共价缀合物的制备
根据日本专利N0.4，850，514的实施例6中描述的方法，制备“干扰素-β与PEG的共价缀合物”，其中分子量为42，000的一个PEG分子与重组人干扰素-β (SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的位置134的赖氨酸的氨基共价结合。特别地，乙二醇(终浓度:20%)被加入到溶解于100 mM含有0.5 M氯化钠的乙酸盐缓冲液(pH 5.0)的重组人干扰素-β (终浓度:200 yg/ml)中，并用I M磷酸氢二钠溶液调节pH为7.6。羟基琥珀酰亚胺酯活化的PEG(分子量:42，000 ;产品编号61G99122B01 ；N0F Corporat1n)被加入到其中并混合，在4°C进行结合反应过夜。向该结合反应溶液中加入大于其体积5倍的量的10 mM乙酸盐缓冲液(pH 4.5)，生成物被应用于用10 mM乙酸盐缓冲液(pH 4.5)平衡的阳离子交换柱(ToyoPearl CM 650 (S) ; Tosoh Corporat1n)。用下述的展开剂对蛋白进行洗脱并分级。
[0067]<展开剂>
溶剂A: 10 mM乙酸盐缓冲液(pH 4.5)
溶剂B:含有I M氯化钠的10 mM乙酸盐缓冲液(pH 4.5)
当允许溶剂A和溶剂B的混合物以柱树脂量的40倍量通过阳离子交换柱时，用于液体递送的溶剂B的比例从0%连续增加到65%以进行洗脱。洗脱的级分被应用于SP-5PW柱(Tosoh Corporat1n)并分离“干扰素-β与PEG的共价缀合物”(以下称为“PEG-1FN-β ”)，其中分子量为42，000的一个PEG分子与重组人干扰素-β (SEQ ID NO:1)的氨基酸序列的位置134的赖氨酸的氨基共价结合。
[0068]用与PEG-1FN-β的制备方法同样的方式，制备“小鼠干扰素-β与PEG的共价缀合物”(以下称为“PEG-mIFN-β ”)，其中分子量为42，000的一个PEG分子与重组小鼠干扰素-β共价结合。
[0069]根据Nucleic Acid Research, 1980, Vol.8, pp.4057-4074 中描述的方法制备重组人干扰素-β，并根据 Journal of Interferon Research, 1986, Vol.6, pp.519-526中描述的方法制备重组小鼠干扰素-β。
[0070][实施例2]PEG-1FN-β通过局部施用抑制腹水积聚的效果
产生胃癌腹膜转移小鼠模型，并根据Nakanishi等(Cancer Science, 2003, Vol.94，pp.112-118)的方法评价PEG-1FN-β通过局部施用抑制腹水积聚的效果。
[0071]在37°C和5% CO2的培养箱中用含有10%胎牛血清的DMEM培养基培养并维持通过将 pEGFP-Cl 质粒(Clontech)引入到得自 Cell Bank, RIKEN B1Resource Center 的GCIY人胃癌细胞(N0.RCB0555)中制备获得的GCIY-EGFP细胞。用胰蛋白酶/EDTA收集GCIY-EGFP细胞并用Hank’ s平衡盐溶液(HBSS)洗涤以制备GCIY-EGFP细胞悬液。GCIY-EGFP细胞悬液(2.5 X 16个细胞/小鼠)腹膜内移植到雄性KSN裸鼠(得自ShizuokaLaboratory Animal Center),并在第二天根据 Ohashi 等(Internat1nal Journal ofOncology, (2005) Vol.27，pp.637-644)的方法确认 GCIY-EGFP 细胞是否被植入。确认植入GCIY-EGFP细胞的小鼠用作胃癌腹膜转移小鼠模型进行实验。
[0072]天然存在的人干扰素_β (Feron?; Toray Industries, Inc.)或实施例1中制备的PEG-1FN-β以5，000, 000 U/小鼠/剂量的量腹膜内(即局部地)施用给胃癌腹膜转移小鼠模型(η = 8)。在移植的第二天开始施用，并每周一次，进行4周。最后一次施用之后一周在麻醉条件下从胃癌腹膜转移小鼠模型收集腹水，并测量液体体积。
[0073]结果显示于图1。纵轴代表腹水的量(中值；mL)。在横轴上，“IFN-β ”代表天然存在的人干扰素-β局部施用组的结果，且“PEG-1FN-β ”代表PEG-1FN-β局部施用组的结果。
[0074]结果是，在天然存在的人干扰素局部施用组中，由胃癌细胞腹膜转移引起的腹水的积聚未被抑制，而在PEG-1FN-β局部施用组中，腹水的积聚被抑制至正常水平。这证明未修饰的干扰素-β每周一次间歇施用未显示出抑制腹水积聚的效果，即使是当其以5，000, 000 U/小鼠/剂量的高剂量被局部施用至胃癌细胞转移到的腹腔中时，而干扰素-β与PEG的共价缀合物进行同样的间歇施用日程安排时显示出显著的抑制腹水积聚的效果。
[0075]结果表明干扰素_β与聚亚烷基二醇的共价缀合物具有抑制腹水积聚的效果，并且能够通过局部施用显著抑制体腔积液。
[0076][实施例3]PEG-1FN-β通过全身施用抑制腹水积聚的效果
用与实施例2相同的方式，通过将人胃癌细胞，GCIY-EGFP细胞，腹膜内移植到雄性KSN裸鼠产生胃癌腹膜转移小鼠模型。
[0077]天然存在的人干扰素_β (Feron?; Toray Industries, Inc.),或实施例1中制备的PEG-1FN-β或PEG-mIFN-β以5，000 U/小鼠/剂量的量皮下施用到胃癌腹膜转移小鼠模型(η = 6)的背部区域(即通过全身施用)。在移植的第二天开始施用，每周两次，进行4周。磷酸盐缓冲液(PBS)以同样的方式施用给对照组。最后一次施用之后2周在麻醉条件下从胃癌腹膜转移小鼠模型收集腹水，并测量液体体积。
[0078]结果显示于图2。纵轴代表腹水的量(中值;mL)。在横轴上，“对照(PBS) ”代表磷酸盐缓冲液(PBS)全身施用组(对照组)的结果，“IFN-β ”代表天然存在的人干扰素-β全身施用组的结果，“PEG-1FN-β ”代表PEG-1FN-β全身施用组的结果，“PEG-mlFN-β ”代表PEG-mIFN-β全身施用组的结果。
[0079]结果是，在天然存在的人干扰素全身施用组中，发现腹水的量比磷酸盐缓冲液(PBS)全身施用组中的多，因此在前者组中，由胃癌细胞腹膜转移引起的腹水的积聚未被抑制，而在PEG-1FN-β全身施用组和PEG-mIFN-β全身施用组中，腹水积聚均被显著抑制。这证明未修饰的干扰素_β通过全身施用未显示出任何抑制腹水积聚的效果，而干扰素-β与PEG的共价缀合物通过全身施用显示出显著的抑制腹水积聚的效果。
[0080]该结果表明干扰素_β与聚亚烷基二醇的共价缀合物能够显著抑制体腔积液，甚至是当其以临床剂量以间歇性日程安排进行全身施用时。
[0081][实施例4]干扰素-α与PEG的共价缀合物通过全身施用抑制腹水积聚的效果用与实施例2相同的方式，通过将人胃癌细胞，GCIY-EGFP细胞，腹膜内移植到雄性KSN
裸鼠产生胃癌腹膜转移小鼠模型。
[0082]TS-1? Capsule (以下简称为 “TS-1 ”)(Taiho Pharmaceutical C0., LTD.)以0.5 mg替加氟/小鼠/天的剂量口服施用给胃癌腹膜转移小鼠模型。在移植的第二天开始施用，每天进行，共4周。
[0083]同时，聚乙二醇干扰素-a _2a (干扰素-α与PEG的共价缀合物，其中分子量为大约40，000的一个分支PEG分子与重组人干扰素-a -2a的一个赖氨酸残基位点通过酰胺键共价结合)(Pegasys? 用于皮下注射，Chugai Pharmaceutical C0.Ltd.)以 5，000 U/小鼠/剂量的量被皮下施用到胃癌腹膜转移小鼠模型(η = 6)的背部区域(即通过全身施用)。在移植的第二天开始施用，每周两次，进行4周。作为对照，磷酸盐缓冲液(PBS)被皮下施用(即全身地)到胃癌腹膜转移小鼠模型，每周两次，进行4周，从移植的第二天开始。
[0084]最后一次施用之后2周在麻醉条件下从胃癌腹膜转移小鼠模型收集腹水，并测量液体体积。
[0085]结果显示于图3。纵轴代表腹水的量(中值；mL)。在横轴上，“TS-1+PBS”代表TS-1和磷酸盐缓冲液(PBS)组合施用组(即TS-1+PBS组)的结果，且“TS-l+PEG-1FN-α 2a”代表TS-1和聚乙二醇干扰素-a -2a组合施用组(即TS_1+ PEG-1FN- a 2a组)的结果。
[0086]结果是，在TS-1+PBS组中，由胃癌细胞的腹膜转移引起的腹水的积聚被抑制，且在TS-l+PEG-1FN-a2a组中，腹水的积聚以更显著的程度被抑制。这证明抗肿瘤剂通过作用于已经转移到腹腔的胃癌细胞发挥对腹水积聚的抑制效果，且TS-1和干扰素-α与PEG的共价缀合物组合并同时施用具有显著的抑制腹水积聚的效果。
[0087]该结果表明干扰素-α与聚亚烷基二醇的共价缀合物能够显著抑制体腔积液，甚至是当其以间歇性日程安排进行全身施用时，且该缀合物与抗肿瘤剂组合并同时施用具有更显著程度的抑制腹水积聚的效果。
[0088][实施例5]PEG-1FN-β和PEG-mIFN-β通过局部施用获得的抑制腹水再积聚的效果
使用人胃癌细胞，GCIY细胞(RIKEN)，产生胃癌腹膜转移小鼠模型。在37°C和5% CO2的培养箱中用含有15%胎牛血清的MEM培养基培养并维持GCIY细胞。
[0089]与实施例2中以相同方式制备的GCIY细胞悬液(I x 17个细胞/小鼠)腹膜内移植到雄性KSN裸鼠以产生胃癌腹膜转移小鼠模型。GCIY细胞悬液移植后5周从单个小鼠收集腹水(“初次腹水穿刺术”)。通过在麻醉条件下用有翼的静脉针(18-规格)穿刺到腹腔中进行腹水穿刺术，并通过该针收集腹水。
[0090]将实施例1中制备的PEG-1FN- β和PEG_mIFN- β混合在一起，得到的混合物(以下称“PEG-1FN-β s”)进行腹腔内施用(局部)，其剂量使得PEG-1FN-β和PEG-mIFN-β每种以10，000 U/小鼠/剂量的量施用，且在初次腹水穿刺术的当天开始施用。以每隔一天的间隔进行施用，其等同于对人进行每周一次的施用，施用总共进行三次(η = 4)。在对照组中，用相同体积的含有150 mM氯化钠的20 mM乙酸盐缓冲液(pH 4.5)代替PEG-1FN-β s，以同样的方式施用(η = 5)。
[0091]在最后一次施用的第二天，在麻醉条件下通过腹水穿刺术从PEG-1FN- β s组和对照组的单个小鼠收集初次腹水穿刺术之后再积聚的腹水，并测量液体重量(第二次腹水穿刺术)。被收集腹水的单个小鼠在麻醉条件下进行剖腹手术，用钳子和剪刀移除已转移到腹腔的肿瘤物质，并测量肿瘤重量。
[0092]在两组，即对照组和PEG-1FN_i3s组之间进行统计学分析，在方差齐性检验(F-检验)的基础上选择和进行Student’s t_检验或Welch检验。根据统计学分析，当P值小于0.05时，确定结果有统计学意义。
[0093]结果显示于图4。图4A的纵轴代表第二次腹水穿刺术获得的腹水的重量(η =4-5 ;平均值土SE)，且图4Β的纵轴代表肿瘤重量(η = 4-5 ;平均值土SE)、在横轴上，“对照”代表含有150 mM氯化钠的20 mM乙酸盐缓冲液(pH 4.5)局部施用组(对照组)，且“PEG-1FN-Ps”代表PEG-1FN-β和PEG-mIFN-β混合物局部施用组。图中的星号表示PEG-1FN-β局部施用组的数据与对照组相比具有统计学意义(P < 0.05)。
[0094]结果是，在PEG-1FN- β s局部施用组和对照组之间没有观察到转移到腹腔的肿瘤重量有显著差别(图4B)，但在PEG-1FN-β s局部施用组中，与对照组相比，由腹膜转移引起的腹水的再积聚被显著抑制(图4A)。这表明干扰素-β与PEG的共价缀合物通过抑制腹水积聚的复发，也具有治疗效果，即使当其在胃癌细胞腹膜转移引起腹水积聚的晚期被局部施用时。
[0095]已知干扰素具有抑制癌细胞生长的效果(以下称“抗肿瘤效果”)。但是，在未观察到其有足够的抗肿瘤效果的情况下，观察到通过PEG-1FN-β s施用抑制腹水再积聚的效果。这强烈表明抑制腹水再积聚的效果并不是由于干扰素抗肿瘤效果的副效应，而是独立于抗肿瘤效果的。
[0096]该结果表明在除去体腔液之后，干扰素与聚亚烷基二醇的共价缀合物，通过局部施用，显示出抑制体腔液再积聚的效果，而且这种效果独立于抗肿瘤效果。
[0097][实施例6]PEG-1FN-β和PEG-mIFN-β通过全身施用抑制腹水再积聚和提高生存率的效果检查干扰素-β与PEG的共价缀合物通过全身施用对恶性腹水积聚和生存率的治疗效果O
[0098]根据Huynh 等(Molecular cancer therapeutics, (2007) Vol.6, pp.2959-2966)的方法，产生卵巢癌腹膜转移小鼠模型，并以此评价PEG-1FN-β通过全身施用抑制腹水再积聚的效果。
[0099]在37°C和5% CO2的培养箱中用含有15%胎牛血清的MEM培养基培养并维持人卵巢癌细胞0V-90 (CRL-11732 ;美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollect1n))。用胰蛋白酶/EDTA收集0V-90细胞并用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤以制备0V-90细胞悬液。得到的0V-90细胞悬液(5 X 16个细胞/小鼠)腹膜内移植到雌性SCID小鼠(C.B.-17/lcr-scid/scid-jcl; CLEA Japan Inc.)。
[0100]细胞悬液移植后46天从单个小鼠收集腹水(初次腹水穿刺术)。通过在清醒状态下用有翼的静脉针(18-规格)穿刺到腹腔中进行腹水穿刺术，并通过该针收集腹水。测量腹水重量(g)，且观察到腹水为0.1 g或更多的单个小鼠被用于进行下述实验。
[0101]将实施例1中制备的PEG-1FN- β和PEG_mIFN- β混合在一起，得到的混合物(以下称“PEG-1FN- β s”)进行皮下施用(全身性)，其剂量使得PEG-1FN- β和PEG-mlFN- β每种以50，000 U/小鼠/剂量的量施用，并在初次腹水穿刺术的当天开始施用。以每隔一天的间隔进行施用，其等同于对人进行每周一次的施用(η = 6)。在对照组中，用相同体积的含有150 mM氯化钠的20 mM乙酸盐缓冲液(pH 4.5)代替PEG-1FN-β s，以同样的方式施用(η = 7)。
[0102]在第三次施用结束的第二天(即初次施用后5天)，在清醒状态下通过腹水穿刺术从PEG-1FN-β s组和对照组的单个小鼠收集初次腹水穿刺术之后再积聚的腹水，并测量液体重量(第二次腹水穿刺术)。
[0103]第二次腹水穿刺术之后，进行后续施用，每隔一天皮下施用(即全身地)三次，且共施用六次。从开始施用当天开始至之后的12天检查每组的存活率。
[0104]结果显示于图5和图6。图5的纵轴代表第二次腹水穿刺术获得的腹水的重量(η=6-7 ;平均值土SE)，图6的纵轴代表存活率，并且横轴代表开始施用当天(第O天)之后经过的天数。图5和图6中横轴上的“对照”代表含有150 mM氯化钠的20 mM乙酸盐缓冲液(pH 4.5)皮下施用组(对照组)，且“PEG-1FN-β s”代表PEG-1FN-β和PEGiIFN-β混合物皮下施用组。
[0105]结果是，在PEG-1FN-β s全身施用组中，腹膜转移导致的腹水再积聚被抑制。这表明当干扰素-β与PEG的共价缀合物在卵巢癌细胞腹膜转移引起腹水积聚的晚期全身施用时，抑制腹水积聚的复发。
[0106]PEG-1FN-β s全身施用组中所有的小鼠存活到开始施用后12天。但在对照组中，在开始施用后8天首次观察到小鼠死亡，并且开始施用后12天存活率小于50%。这表明当干扰素-β与PEG的共价缀合物在由于卵巢癌细胞腹膜转移引起腹水积聚的晚期全身施用时，抑制全身状况的恶化并提高存活率。
[0107]这些结果表明干扰素与聚亚烷基二醇的共价缀合物，甚至是通过全身施用时，显示出抑制体腔液去除后的体腔液再积聚的效果。它们还表明当该共价缀合物在具有体腔积液的癌症晚期全身施用时，抑制全身状况的恶化并提高存活率。
[0108]上述实施例证明干扰素与聚亚烷基二醇的共价缀合物(优选干扰素-α或干扰素-β与PEG的共价缀合物)能够抑制难治性腹水积聚，而这用干扰素-α或干扰素无法实现。更特别地，其表明干扰素与聚亚烷基二醇的共价缀合物(优选干扰素-α或干扰素-β与PEG的共价缀合物)通过全身施用例如皮下施用或以每两天至更多天一次的间隔进行施用的间歇日程安排进行局部施用，具有抑制恶性腹水积聚的效果。进一步，其表明所述抑制效果不是抗肿瘤效果的副效应，而且这种效果的发挥与癌症类型无关。其还表明，与每天干扰素施用的传统治疗相比，将干扰素与聚亚烷基二醇的共价缀合物以间歇日程安排进行施用的治疗对于恶性腹水显示出增强的治疗效果。
[0109]工业实用性
本发明可在药物领域中用作体腔积液的抑制剂。
[0110]序列表
SEQ ID NO:1:人干扰素-β的氨基酸序列。
【权利要求】
1.体腔积液抑制剂，其包含，作为活性成分的，干扰素与聚亚烷基二醇的共价缀合物。
2.根据权利要求1的体腔积液抑制剂，其中所述聚亚烷基二醇是聚乙二醇。
3.根据权利要求1或2的体腔积液抑制剂，其中所述干扰素是I型干扰素或干扰素-λ。
4.根据权利要求3的体腔积液抑制剂，其中所述I型干扰素是干扰素-α或干扰素_β。
5.根据权利要求1-4任一项的体腔积液抑制剂，其抑制胸腔积液或腹水的积聚。
6.根据权利要求5的体腔积液抑制剂，其中所述胸腔积液或腹水是由于癌症、肝硬化或肾衰竭积聚的难治性胸腔积液或腹水。
7.根据权利要求1-6任一项的体腔积液抑制剂，其用于全身施用。
8.根据权利要求7的体腔积液抑制剂，其中所述全身施用选自皮下施用、皮内施用、肌内施用、静脉施用和动脉施用。
9.根据权利要求1-8任一项的体腔积液抑制剂，其与抗肿瘤剂组合使用。
10.根据权利要求9的体腔积液抑制剂，其中所述抗肿瘤剂是选自5-FU、替加氟-尿嘧啶、替加氟-吉美拉西-奥特拉西和卡培他滨的至少一种抗肿瘤剂。
【文档编号】A61P43/00GK104136038SQ201380011413
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2013年2月28日 优先权日:2012年2月29日
【发明者】成见英树, 池原早苗 申请人:东丽株式会社