一种新型群体感应抑制剂的分离提取、结构鉴定及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物制药领域，具体涉及一种由海洋污泥来源的水莱茵海默氏菌 QSI02 (油eiflAeiazeraa识/iazarisQSI02)的发酵培养、具有细菌群体感应抑制活性化合物 的分离纯化、结构鉴定及其应用。
【背景技术】
[0002] 传统的抗生素都是以细菌的细胞壁合成、蛋白质合成、叶酸合成、DNA的超螺旋等 细菌的重要生命过程为靶点，直接杀死或者抑制微生物的生长来实现抗感染的目的，在这 种生存压力下，细菌通过改变自身机制，很容易产生耐药性。解决细菌耐药性已成为人类面 临的重大卫生挑战之一。近些年来研究发现，细菌群体感应（quorumsensing，QS)系统使 作为单细胞生物的细菌，具备了部分类似于多细胞生物的功能，让细菌在应对环境挑战时， 能协调一致，使细菌形成一种群体行为来有效的抵御外界环境压力、攻击宿主等。以细菌QS 系统为靶标筛选的抗菌药物，与传统抗生素的作用机制完全不同，它不杀死细菌或抑制单 个细菌的生长，只抑制细菌QS调控的致病行为，不易诱导耐药突变。
[0003] 据统计，海洋微生物是天然活性物质的重要来源。海洋相对独特的高盐、高压、寡 营养、低光照等复杂生态环境造就了海洋微生物独特的代谢机制，产生了众多的结构多样 性和生物活性多样性的先导化合物。目前，已从海洋微生物中发现了大量的具有化学结构 新颖、生物活性特异的化合物，其中有些已经作为药物广泛应用于临床。此外，海洋微生物 资源丰富、易于培养，可通过人工发酵培养提供稳定的代谢产物，已成为一种重要的环境友 好的微生物资源。
[0004] 有关环（L-色氨酸-L-丝氨酸)化合物的文献报道较多，但是该化合物从水莱茵海 默氏菌中分离得到未见有报道。本发明人研究得知，水莱茵海默氏菌QSI02(油 叫QSI02)(保藏编号为CCTCCN0:M2015245)液体发酵产物的甲醇提取物具有降 低紫色杆菌紫色素产生的作用，进而对其化学成分进行了研究。研究发现所得化合物环 (L-色氨酸-L-丝氨酸）在一定浓度范围内对紫色杆菌和铜绿假单胞菌都具有群体感应抑 制活性，目前尚未见对该化合物的群体感应抑制活性的报道，因此市场上也尚未有与此相 关的药物。
【发明内容】
[0005] 本发明旨在提供一种由海洋污泥来源的水莱茵海默氏菌QSI02 (油 QSI02)发酵提取物中分离纯化得到的具有抑制紫色杆菌和铜绿假单胞菌群体 感应系统的活性化合物，该化合物在不抑制致病菌菌体生长的范围内能够显著的降低相关 致病因子的表达，减弱致病菌的耐药性。
[0006] 本发明所提供的活性化合物来源于海洋细菌水莱茵海默氏菌QSI02 (油ei/zAeiazeraa识/iazarisQSI02)，该菌株于2015年04月23日保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCN0:M2015245 ;海洋污泥来 源水莱茵海默氏菌QS10 2经液体发酵、分离纯化得到具有细菌群体感应抑制活性 的化合物环（L-色氨酸-L-丝氨酸)，英文名称为：（3S，6S)-3-((lH-ind〇l-3-yl) methyl) _6_ (hydroxymethyl)piperazine-2, 5-dione，分子式为C14H15N303,化学结构式如式 i:。
[0007] 本发明所述的活性化合物环（L-色氨酸-L-丝氨酸)的制备方法包括：海洋细菌水 莱茵海默氏菌QSI02 (油ei/zAeiazeraa识/iazarisQSI02)发酵培养与化合物的分离纯化两 个步骤。将活化的菌种接种到海水培养基中进行摇床培养。发酵结束后，离心、真空低温浓 缩至膏状，用甲醇浸提得甲醇提取物；将甲醇提取物用〇. 22ym有机相滤膜过滤，采用紫 外检测器（UV-900)与凝胶柱层析（SephadexLH20)串联，以甲醇作为洗脱剂，分离为5个流 份，对流份采用筛选模型进行活性检测，其中第4个活性洗脱流份再经过薄层层析制备，展 开剂为水：正丁醇：乙酸乙酯=1:3:1，分离纯化得到具有抑制紫色杆菌和铜绿假单胞菌群 体感应的单体化合物。
[0008] 本发明涉及的活性化合物环（L-色氨酸-L-丝氨酸）具有抑制紫色杆菌和铜绿假 单胞菌感染的作用；该化合物在〇 ~ 〇. 3mg/ml浓度范围内不抑制紫色杆菌CV026的菌体 生长，但能显著的降低紫色杆菌紫色素的生成；并且随着浓度的逐渐增加，其抑制紫色素产 生的作用越强；该化合物在〇 ~ 0.4mg/ml浓度范围内对铜绿假单胞菌PA01的菌体生长不 产生影响，但能显著的降低铜绿假单胞菌群体感应调控的群集运动。
[0009] 本发明所涉及的水莱茵海默氏菌QSI02 (油ei/zAeiazeraa识/i胤risQSI02)菌株 具有发酵培养条件可控，代谢产物产量稳定，化合物制备工艺过程简便的优点，同时所得化 合物对群体感应抑制作用明显，并且环境友好。
【附图说明】
[0010] 图1为本发明的活性化合物的活性筛选图。
[0011]图2为本发明不同含量的化合物对紫色杆菌CV026菌体生长的测定图。
[0012] 图3为本发明不同含量的化合物对紫色杆菌紫色素产量的测定图。
[0013] 图4为本发明化合物对铜绿假单胞菌PA01群集运动（swarming)现象的影响图。
【具体实施方式】
[0014] 实施例1化合物环（L-色氨酸-L-丝氨酸）的发酵生产及分离纯化。
[0015] 1、发酵生产：海洋污泥来源水莱茵海默氏菌QSI02 (油eiflAeiazeraa识/iazaris QSI02)的发酵培养：按培养微生物的常规方法，取水莱茵海默氏菌QSI02 (保藏编号是： CCTCCN0:M2015245)适量，接种到LB液体培养基(蛋白胨10g/L;酵母提取物5g/L;NaCl 10g/L，去离子水1L，121°C，灭菌20分钟）中，震荡培养12h，温度28 °C、转速160rmp。
[0016] 取上述培养12h的水莱茵海默氏菌QSI02接种到装有2. 5L海水培养基(蛋白胨 5g/L;酵母提取物2g/L;磷酸高铁0. 1g/L，0. 22ym微孔滤膜过滤的海水1L，121°C， 灭菌20分钟）的5L锥形瓶中，接种量为4%，震荡培养24h，温度28°C、转速160rmp，获 得发酵培养物。
[0017] 2、浸膏的获得：上述发酵培养物用大型离心机将菌体离掉，并收集发酵液；然后 将发酵液真空低温浓缩至膏状，用甲醇从膏状发酵物中浸提，真空浓缩得到粗提物浸膏， -4 °C保存备用。
[0018] 3、化合物的分离纯化：将上述获得的粗提物浸膏用甲醇溶解，再用0. 22ym有机 相滤膜过滤，采用紫外检测器（UV-900)与凝胶柱层析（SephadexLH20)串联，以甲醇作为洗 脱剂，根据254nm处紫外检测器检测结果洗脱分离为5个流份，对流份采用群体感应筛选 模型进行活性检测，其中第4个活性洗脱流份再经过薄层层析制备，展开剂为水：正丁醇： 乙酸乙酯=1:3:1，分离纯化得到单体化合物环（L-色氨酸-L-丝氨酸)。
[0019] 4、化合物结构鉴定：综合利用紫外（UV)、红外（IR)、质谱（MS)、核磁共振谱 (iH-NMR^C-NMKDEPT)等技术对化合物进行结构鉴定。紫外谱图在354nm、220nm左右 出现苯的特征吸收峰，推测该化合物可能含有苯环；红外谱图中给出羟基（3422cm1)，氨基 (3220cm1)，羰基（1638cm1)的官能团吸收；阳离子低分辨质谱在274处给出[M+H]+峰， 提不化合物的分子量为273,结合氢谱和碳谱分析，化合物的分子式为C14H15N303;iH-NMR、 13C-NMR和DEPT谱数据提示该化合物中存在一个吲哚基团、一个羟基、两个酰胺基、两个亚 甲基。综合上述所有数据，并与文献（J.Comb.Chem.，2006，8(6): 915-922)比较，确定 该化合物为环（L-色氨酸-L-丝氨酸)。
[0020] 化合物4-匪1?数据： iH-NMR (600MHz，DMS0-4，TMS，8)^H：l〇. 88 (br s, 1H, 1-NH), 7.88 (d, 2H, 9-NH, 12-NH), 7.53 (d, 1H, H-4), 7.32 (d, 1H, H-7), 7.11 (d, 1H, H-2), 7.04(m, 1H, H-6), 6.95(m,1H, H-5), 4.90(m,1H, 15-OH), 4.00 (s, 1H, H-ll), 3.67 (s, 1H, H-8), 3. 29-3. 33 (m, 1H, H-15a), 3. 16-3. 18 (m, 2H, 14-CH2) , 3. 03-3. 05 (m, 1H, H-15b)。
[0021] 化合物13C_NMR数据： 13