专利名称：枯草芽孢杆菌降解细菌群体感应信号及作为抗菌剂的用途的制作方法
技术领域：
本发明属于卫生学领域，涉及枯草芽孢杆菌降解细菌群体感应信号及作为抗菌剂 的用途。
背景技术：
枯草芽孢杆菌(Bacillus stibillus)是一株从养殖环境中分离纯化的微生物。根 据伯杰氏手册进行菌株生理生化特征鉴定，枯草芽孢杆菌在普通培养基上近园形，不透明， 表面干燥，周围有皱峡，边缘不齐，显微镜下革兰氏染色阳性，菌体杆状。还具有以下生化特性甘露醇产酸+，阿拉伯糖产酸+，葡萄糖产气_，形成吲哚_， V. P试验+，苯丙氨酸脱氨-，V. P培养终PH值5. 8，葡萄糖产酸+，淀粉水解+，柠檬酸盐利 用+，接触酶+，硝酸盐还原+，NaCUKCl需要+，10 % NaCl生长+，7 % NaCl生长+，5 % NaCl 生长+，2% NaCl生长+等特性(注“ + ”代表阳性，“_”代表阴性)。目前枯草芽孢杆菌应用研究涉及1.抗菌和溶菌作用；2.提高机体免疫力；3.调 节机体肠道微生态；4.促进消化和机体生长；5.改善养殖环境。文献报道的药理作用有以 下几方面，但均没有涉及其对群体感应系统的抑制机制。药理研究的有关报道如下抗菌、 抗病毒、促进消化、提高抗病力、改善养殖环境等多种作用。在抗菌方面，已有的相关研究结果有(1)枯草芽孢杆菌T2发酵液中分离纯化出 一种蛋白酶(29. OkD)，其最适温度为65°C，最适pH为8.0，该酶对棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f sp. vasinfectum)的孢子萌发、菌丝生长有明显抑制作用。表明，枯草芽孢杆 菌有抗真菌作用(邢介帅，等.植物病理学报，2008，38 (4) 377-381) ； (2)枯草芽孢杆菌发 酵液抽提后得到的脂肽类抗生素对多种植物病原菌有抑制作用；其产生的挥发性抑菌物质 能够抑制灰霉病菌孢子的萌发和菌丝生长。表明，枯草芽孢杆菌具有生物防治作用(陈华， 等.微生物学通报，2008，35(1) 1-4)。这些抗菌研究都是将从枯草芽孢杆菌中提取的物质 作了抗菌效果的研究和证实，而未对枯草芽孢杆菌菌株的抗菌效果作出研究。另外对枯草 芽孢杆菌菌株的研究表明，其对禽舍分离的变形菌属细菌、金黄色葡萄球菌有不同程度的 抑制作用，但是，对大肠杆菌、肠球菌属细菌影响不大(王城，等.中国农学报，2010，26(3) 23-26)。由于作为菌株存在时，其作用机理并非简单的化学物质对细菌的抑制，而是一个复 杂的细菌间的相互影响的有机系统，因此，枯草芽孢杆菌菌株的抑菌机理，以及可以加以抑 制的细菌菌种，目前仍是一个未知的问题。这在一定程度上制约了枯草芽孢杆菌的抑菌应 用。群体感应(Quorum sensing,QS)是一种细菌细胞通讯机制，即细菌通过合成、分泌 称为自诱导物(autoinducehAI)的信号分子，当AI浓度随着细菌不断生长、群体密度达到 一定阈值时，启动特定基因的表达。革兰氏阴性细菌的群体感应系统由信号分子及其受体 蛋白构成。信号分子是一类高丝氨酸内酯分子，不同细菌的信号分子碳链长度不同。受体 蛋白属于LuxR家族蛋白成员相似性较高。当细菌的密度达到一定程度时，细菌周围存在的 信号分子浓度随之上升。信号分子浓度到达一定域值，就会与受体蛋白结合。结合了信号分子的受体蛋白的构象发生变化，成为转录激活因子，启动生物膜的形成和致病因子的释 放等群体感应相关基因的表达。铜绿假单胞菌、副溶血、哈维氏弧菌等人或动物的致病菌通 过群体感应来调节它们的群体行为，调控生物膜的形成、质粒转移和致病因子的表达等。而生物膜的形成可以使致病菌耐受更高浓度的抗生素的作用，抗药能力可以提高 数十倍，甚至数百倍。因此，通过抑制/降解细菌群体感应信号分子，抑制生物膜的合成，成 为目前抗菌领域的主要研发方向。通过干扰致病菌的群体感应系统来抑制生物膜的形成及 其他受该系统调控的生理活动从而达到抗菌目的被认为是一种新型的抗菌策略。更为重要 的是，由于群体感应抑制剂并不直接抑制致病菌的生长，致病菌不会对它产生耐药性。因 此，开发安全的群体感应系统抑制剂有着重要的应用价值。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的不足，提供了枯草芽孢杆菌的新应用——枯草 芽孢杆菌降解细菌群体感应信号上及作为抗菌剂的用涂。本发明首次发现，枯草芽孢杆菌可以降解细菌群体感应信号，及其抑制细菌生物 膜形成。枯草芽孢杆菌可以降降解革兰氏阴性细菌的群体感应信号，尤其是假单胞菌属 (Pseudomonas)(如铜绿假单胞菌)，土壤杆菌属(Agrobacterium)、弧菌科(Vibrionaceae) (如溶藻弧菌)等的微生物类群。这些革兰氏阴性类群的致病菌或有害菌均具有相似的群 体感应系统，信号分子的受体蛋白为LuxR或TraR，或者为结构和调控机制与此两种受体相 似的蛋白。在降解细菌群体感应信号的应用中，枯草芽孢杆菌存在的适宜浓度为5*102 5*104cfu/ml。经过试验发现枯草芽孢杆菌在5*103cfu/ml时即可抑制铜绿假单胞菌生物 膜的形成，在5*104cfu/ml时抑制效果更好；枯草芽孢杆菌在5*102cfu/ml时即可抑制溶藻 弧菌和鳗弧菌生物膜的形成；枯草芽孢杆菌可使群体感应受体蛋白TraR浓度降低，从而无 法有效启动群体感应相关基因的表达(如生物膜的形成和致病因子的表达)，因而降低了 致病菌的致病活性，并提高了宿主免疫系统和其他抗菌剂的杀菌效果。在这些实验的基础 上，研究者可通过现有的临床实验手段确定枯草芽孢杆菌的有效治疗量。由于枯草芽孢杆菌的这一特性，可以进一步将枯草芽孢杆菌作为抗菌剂。应用于 抑制假单胞菌属、土壤杆菌属、肠杆菌科或弧菌科的微生物类群。抗菌剂可以是外用药膏、 外用液体药剂、口服药片、口服液、消毒剂、清洁剂或水质改良剂。作为抗菌剂，枯草芽孢杆 菌的浓度为IO5 106cfu/g。发明发现，由于枯草芽孢杆菌的特性，枯草芽孢杆菌可作用于 环境中的菌群，达到有效的抑制作用，并且不会使这些细菌产生耐药性，是一种可以安全使 用并有效作用的杀菌剂。而制成该浓度的抗菌剂，其活性可以得到较好的保留，当稀释进入 环境时，枯草芽孢杆菌充分发挥其降解细菌群体感应信号，可以适用于多种场合的消毒，尤 其适用于在水体环境下通过加入抗菌剂进行消毒。由于试验表明枯草芽孢杆菌可降解具群体感应细菌的信号分子，干扰细菌的群体 感应系统，从而使细菌无法有效启动群体感应相关基因的表达和调控其生理生化特性(如 生物膜的形成和致病因子的表达)，因而降低了致病活性，并提高了宿主免疫系统。因此枯 草芽孢杆菌也可以作为抗菌药物，该药物包含有效菌含量的枯草芽孢杆菌和药学上可接受 的药物载体。药学上可接受的溶剂化物或者水合物的形式来提供的。例如，可把枯草芽孢杆菌从平板或斜面上活化，其发酵液或稀释后，再添加到其他载体或物料中。药物的剂型为 药剂学上允许的液体或固体剂型，用枯草芽孢杆菌制备的药物剂型可为外用药膏等；用枯 草芽孢杆菌制备的药物剂型还可为外用液体药剂。这些药物可以用于防治具群体感应细菌引起的动物的体内、外微生物感染，或者 对养殖水体相关细菌的抑制，或者对植物的相关病原菌的防治。用枯草芽孢杆菌制备的药 物用于防治细菌引起的各种健康问题，包括肠道细菌感染、人和动物的其它细菌感染、防治 植物的病原菌，还可以调节机体肠道微生态，促进消化和机体生长，改善水产养殖环境。为了验证本发明的效果，发明通过具群体感应细菌的信号降解实验和弧菌生物膜 实验等，验证了枯草芽孢杆菌是一株细菌信号降解菌，可用做一个有效的群体感应抑制剂。 通过降解细菌群体感应信号分子，干扰细菌的群体感应系统来抑制生物膜的形成和降解细 菌信号受体分子的活性，从而达到抗菌作用。群体感应抑制剂可以通过DOCK软件，运用计算机虚拟筛选获得，也可以通过构建 指示菌来筛选。已知有些群体感应抑制剂可以降解细菌群体感应的信号分子，干扰细菌的 群体感应系统而抑制细菌生物膜的形成。因此，可以通过检测细菌生物膜的形成情况来鉴 定该物质是否有群体感应抑制剂活性。与现有技术相比，本发明具有以下有益效果1.本发明首次应用了枯草芽孢杆菌抑制细菌群体感应的活性，利用它来降解细菌 群体感应信号，抑制细菌生物膜的生长。2.本发明所提供的枯草芽孢杆菌的应用及抗菌剂，通过干扰病原菌群体感应系统 达到抑制病原菌的效果，是一种新的控制病原菌的策略，而不是现有多数抗菌剂采用的利 用化合物来直接抗菌灭菌，由此避免了抗菌过程中的耐药性问题。3.本发明所提供的枯草芽孢杆菌的应用，在有效利用其群体感应抑制能力和抗菌 效果的同时，不会对环境造成负面影响，副作用小。4.本发明提供的抗菌剂，使用安全，且其生产成本非常低廉，适于推广使用。5.本发明将有利于研究具群体感应细菌的生物防控，探讨防治具群体感应细菌的 新技术。6.本发明有利于从机制方面解决具群体感应细菌由于大量使用抗生素而产生的 耐药性问题，发展非抗菌素类为主的致病菌生态防控新技术。
具体实施例方式以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案。实施例1枯草芽孢杆菌的筛选、分离和纯化2216E平板30度培养2_3天，多次划线分离和纯化，接种斜面，4度保存备用。实施例2枯草芽孢杆菌降解细菌信号分子的初筛实验初筛实验使用信号分子为OOHL分子，指示菌为WCF47。96孔板初筛1)从平板挑取待测菌，在96孔培养板A中用相应液体培养基200 μ 1培养至生长对数晚期，设立阴性对照(LB+AHL)和阳性对照(Bt+AHL)。2)向96孔培养板B的每个孔中加入100μ 1匪液体培养基，0. 2 μ 1信号分子 AHL (lmg/ml)，用移液枪从96孔培养板A取待测菌100 μ 1到96孔培养板B对应的孔中，混 勻。30°C共培养4hr。3)向96孔培养板C的每个孔中加入130 μ 1匪液体培养基，20 μ 1指示菌WCF47 菌液，1 μ 1 X-Gal。用移液枪从96孔培养板B取共培养物50 μ 1到96孔培养板C对应的 孔中，混勻。4)30°C过夜培养。在16hr左右可以观察结果。实验结果信号分子被降解后，指示菌落呈白色，否则呈蓝色。根据颜色反应，初步 筛出具有降解信号分子AHL的枯草芽孢杆菌微生物菌株。实施例3枯草芽孢杆菌降解细菌信号分子的复筛实验琼脂条复筛将涂有X-gal的MM培养基平板切成条状，在细条一测加入待测菌与AHLs抽提物 的混合物，在另一测依次加指示菌WCF47，30°C培养18h后观察实验结果。LB或ddH20和AHL 的混合物作为阴性对照，以AiiA活性菌B. thuringiensis培养物与AHL的混合物为阳性对 照。实验结果根据颜色反应，阴性对照呈蓝色，阳性对照和枯草芽孢杆菌呈白色，表 明枯草芽孢杆菌具有降解AHLs信号分子的活性。实施例4枯草芽孢杆菌的生化鉴定实验根据伯杰氏手册进行菌株生理生化特征鉴定。结果表明，枯草芽孢杆菌在普通培 养基上近园形，不透明，表面干燥，周围有皱峡，边缘不齐，显微镜下革兰氏染色阳性，菌体 杆状。还具有以下生化特性甘露醇产酸+，明胶水解+，卵磷脂酶_，阿拉伯糖产酸+，葡 萄糖产气_，酪氨酸水解_，形成吲哚_，V. P试验+，苯丙氨酸脱氨_，V. ρ培养终pH值5. 8， 葡萄糖产酸+，丙酸盐利用_，淀粉水解+，木糖产酸_，柠檬酸盐利用+，接触酶+，硝酸盐还 原 +，酪阮水解 +，NaCUKCl 需要 +，10 % NaCl 生长 +，7 % NaCl 生长 +，5 % NaCl 生长 +，2 % NaCl生长+(注“ + ”代表阳性，“_”代表阴性)。实验结果，根据菌落特点、染色特征和生化指标特性，初步确定菌株Zou 03为枯 草芽孢杆菌。实施例5枯草芽孢杆菌16S rRNA的分子鉴定实验以细菌总DNA为模板，以Taq DNA聚合酶进行PCR扩增菌株Zou 03的16SrDNA序 列，引物为 27f :5，-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，和 1492r :5，-GGTTACCTTGTTACGACTT-3，， PCR 反应条件94°C预变性 5min ；94°C lmin、45°C lmin、72°C lmin,30 个循环；72°C延长延 伸lOmin。PCR产物经胶回收柱纯化后与pMD_18T载体连接，转化E. coli DH5 D感受态细 胞，挑取阳性转化子测序。将测得的16S rDNA序列与Genbank中核酸数据进行Blast序 列相似性分析，选取同源性较高细菌的16S rDNA序列采用Clustalx 1.8进行序列比对，运用Phylip3. 65进行统计和聚类分析，Neighbor joining法构建系统发育树，通过Boostrap 1000次重复检验。实验结果1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，细菌Zou 03的16S rDNA序列长度约 1.45kb左右，接近于全长，与预期大小一致。通过NCBI BLAST分析，序列同源比对结果 显示细菌 Zou 03 的 16SrDNA 序列与 Bacillus subtilis 16S rDNA(GQ861468. 1)的序 列片段有99%的同源性，初步确定Y5为一株新的芽孢杆菌。选取同源性在95%以上 的12株细菌构建系统进化树，可知细菌Zou 03与已报道的地衣芽孢杆菌亚型Bacillus licheniformis (GenBank accession no. AB361368)的亲源关系较近。综合传统的细菌形态、生理生化特征，结合细菌的16S rDNA序列同源性分析和构 建细菌体统进化树，可以确定菌株Zou 03为枯草芽孢杆菌。实施例6枯草芽孢杆菌抑制溶藻弧菌和鳗弧菌生物膜形成的实验在2ml塑料离心管中分别加入975 μ 1过夜培养的溶藻弧菌和鳗弧菌菌液，25 μ 1 40%的甘油，lyl(105cfU/g)的枯草芽孢杆菌。以不加枯草芽孢杆菌的处理作为阴性对照。 37°C静置培养3天。小心倾去离心管中的液体，用灭菌的蒸馏水轻轻冲洗离心管数次，确保 冲洗掉离心管内游离的细菌。等离心管内壁的水珠蒸发后，加入Iml 0.5%的结晶紫溶液， 室温静置30分钟。将结晶紫倒掉，用灭菌的蒸馏水轻轻冲洗离心管数次，确保没有吸附在 生物膜上的结晶紫被冲掉。待离心管内壁水珠蒸发后，加入Iml 95%乙醇，室温静置15分 钟。最后将离心管内乙醇倒入比色皿内，在分光光度计中以570nm波长测OD值。OD值越 低，说明溶藻弧菌和鳗弧菌形成的生物膜越少。实验结果表明枯草芽孢杆菌在该浓度(5*102cfu/ml)下可抑制溶藻弧菌和鳗弧 菌生物膜的形成。但不直接抑制溶藻弧菌和鳗弧菌的生长，表明抑制作用可能是通过抑制 细菌的群体感应系统达到的。实施例7枯草芽孢杆菌抑制铜绿假单胞菌生物膜的实验在2ml塑料离心管中加入975 μ 1过夜培养的绿脓杆菌菌液，25 μ 1 40%的甘油， μ 107cfu/g的枯草芽孢杆菌。以不加枯草芽孢杆菌的处理作为阴性对照。37°C静置培 养3天。小心倾去离心管中的液体，用灭菌的蒸馏水轻轻冲洗离心管数次，确保冲洗掉离心 管内游离的细菌。等离心管内壁的水珠蒸发后，加入Iml 0.5%的结晶紫溶液，室温静置30 分钟。将结晶紫倒掉，用灭菌的蒸馏水轻轻冲洗离心管数次，确保没有吸附在生物膜上的结 晶紫被冲掉。待离心管内壁水珠蒸发后，加入Iml 95%乙醇，室温静置15分钟。最后将离 心管内乙醇倒入比色皿内，在分光光度计中以570nm波长测OD值。OD值越低，说明铜绿假 单胞菌形成的生物膜越少。实验结果表明枯草芽孢杆菌在该浓度(5*104cfu/ml)下可抑制铜绿假单胞菌生 物膜的形成，但不直接抑制铜绿假单胞菌的生长，表明枯草芽孢杆菌可能干扰了细菌的群 体感应系统而抑制生物膜的形成。实施例8枯草芽孢杆菌降解群体感应受体蛋白TraR的实验TraR蛋白是根农杆菌群体感应系统信号分子的受体蛋白，与绿脓杆菌的LasR蛋性位点区域的同源性高达70%，因此，对TraR蛋白起作用的 抑制剂往往也会对LasR蛋白有抑制作用。LuxR蛋白在群体感应抑制剂如卤化呋喃酮的作 用下，变得极不稳定，会在短时间(约30分钟)内被细菌自身的蛋白酶迅速水解掉，导致 LuxR蛋白的浓度下降。因此，通过检测LuxR蛋白与抑制剂作用后的浓度是否下降，可知抑 制剂是否有抑制活性，以及抑制活性的高低。用PCR的方法获得TraR蛋白的基因trar。将该基因片断用双酶切的方法插入表 达载体PET-17b中构建pETtrar质粒，再将该质粒用钙转方法转化到大肠杆菌BL21中，最 后获得高效表达TraR蛋白的工程菌。该工程菌用IPTG诱导4个小时后，离心收集菌体，再 用无菌水重悬细菌，加入枯草芽孢杆菌培养的粗提抗菌液，37°C培养35分钟。最后用SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳检测菌体TraR蛋白浓度。实验结果表明，枯草芽孢杆菌在35分钟内即可明显降低群体感应受体蛋白TraR 的浓度。TraR浓度降低后，将无法有效启动群体感应相关基因的表达(如生物膜的形成和 致病因子的表达)，因而降低了致病活性。该实验从分子水平证明了枯草芽孢杆菌是一个有 效潜在的群体感应抑制剂。实施例9以枯草芽孢杆菌为有效成分制备的外用药膏参照药剂学手册，将适量枯草芽孢杆菌培养液加入适量液体石蜡或黄凡士林，制 成外用药膏。实施例10以枯草芽孢杆菌为有效成分制备的外用液体药剂参照药剂学手册，将适量枯草芽孢杆菌培养液加水溶解，制成外用液体药剂。实施例11以枯草芽孢杆菌为有效成分制备的口服药片参照药剂学手册，将适量枯草芽孢杆菌培养液加入适量润滑剂制成软材，用10目 筛制粒，干燥，干粒加入硬脂酸镁，混勻，压片机压片成片剂，薄膜包衣，分装，即得包衣片 剂。实施例12以枯草芽孢杆菌为有效成分制备的口服液参照药剂学手册，将适量枯草芽孢杆菌培养液加水溶解，加入矫味剂，加水调节容 量，制成口服液。
8
权利要求
枯草芽孢杆菌在降解细菌群体感应信号上的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于所述的细菌为革兰氏阴性细菌。
3.如权利要求2所述的用途，其特征在于所述的细菌为假单胞菌属、土壤杆菌属、肠杆 菌科或弧菌科的微生物类群。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于所述的枯草芽孢杆菌的应用浓度为 5*102-5*104cfu/ml。
5.枯草芽孢杆菌作为抗菌剂的用途。
6.如权利要求5所述的用途，其特征在于所述的用途是应用于假单胞菌属、土壤杆菌 属、肠杆菌科或弧菌科的微生物类群。
7.如权利要求5所述的用途，其特征在于所述的抗菌剂是外用药膏、外用液体药剂、口 服药片、口服液、消毒剂、清洁剂或水质改良剂。
8.如权利要求5所述的用途，其特征在于所述的枯草芽孢杆菌的浓度为IO5 IO6Cfu/
全文摘要
本发明属于卫生学领域，涉及枯草芽孢杆菌降解细菌群体感应信号及作为抗菌剂的用途。发明枯草芽孢杆菌降解革兰氏阴性细菌的群体感应信号，及其细菌生物膜形成。在降解细菌群体感应信号的应用中，枯草芽孢杆菌的适宜浓度为5*102～5*104cfu/ml。进一步将枯草芽孢杆菌作为抗菌剂。应用于抑制假单胞菌属、土壤杆菌属、肠杆菌科或弧菌科的细菌。抗菌剂可以是外用药膏、外用液体药剂、口服药片、口服液、消毒剂、清洁剂或水质改良剂。作为抗菌剂，枯草芽孢杆菌的浓度为105～106cfu/g。本发明提供的枯草芽孢杆菌的应用及抗菌剂，利用了微生物群体感应抑制来抑制致病菌的生物膜生成及细菌的生长，而不是现有多数抗菌剂采用的利用化合物来抗菌灭菌，由此避免了抗菌过程中的耐药性问题。
文档编号C11D3/48GK101926829SQ20101025040
公开日2010年12月29日 申请日期2010年8月10日 优先权日2010年8月10日
发明者丁贤, 周世宁, 殷波, 江世贵 申请人:中国水产科学研究院南海水产研究所