一种暗纹东方鲀群体—家系—分子综合遗传育种的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及水产养殖品种良种选育的方法，具体来说是一种暗纹东方飩群体一家系一分子综合遗传育种的方式。
技术背景
[0002]暗纹东方純属純形目{Tetraodontiformes),純亚科(7?traodontoidei),純科(Tetraodontidae),东方飩属(Jakifugii)。目前,全国已有上海、江苏、浙江、安徽、广东、福建、四川、河南、湖北、海南等省市开展了淡水暗纹东方飩的养殖，暗纹东方飩日渐成为一种养殖名优品种，是一种经济和营养价值都比较高的水产品之一。但一般的养殖品种随着养殖的不断进行都不可避免的出现种质资源退化、近交衰退等现象，故要想从根本上提高水产品的数量和质量，必须培育出优良的新品种。目前，水产动物中常用的选育方法主要有群体选育、家系选育、分子标记辅助育种等。
[0003]群体选育是生产单位进行选育常用的方法，具有快速分离出较为理想个体的优点，但该方法选育出的个体可能是杂合体，长期采用此法可能会带来种质资源分化、遗传纯度降低等问题且大规模的群体选育会消耗大量的人力物力。家系选育是当今水产育种中培育新品种的重要方法之一，该法具有遗传背景清晰、系谱明了、选育后代纯合度高、选育效果显著等优点。然而家系选育是选择一对亲本自交产生后代，基因库会不断地减小，且家系养殖群体内规模不够大时，优良性状基因不能得到充分的表达，影响选育效果。分子标记辅助育种具有以下优点:可同时以多个基因为目标进行材料的筛选，将多个基因聚合到同一个育种材料中，使其品质得到改良；可提前对目标性状进行筛选；可反映DNA水平上的遗传变异，因此，能够在生长的各个时期进行选择，不会受到环境的影响，大大提高了目的基因选择的效率和准确性，拓宽了育种的方法和途径，然而分子标记的开发工作较为繁琐，工作量较大，且很多基因的功能尚未明确，对选育有一定的阻碍。
[0004]中洋集团是世界上最大的河豚鱼养殖基地，规模化养殖条件优势突出，拥有足够数量的育种群体和生产单元，本发明利用群体选育快速筛选出具有优良性状的亲本，再利用家系选育保留优良性状，纯化优良基因，保证子代遗传背景清晰且高的纯合度。同时，在育种过程中配合分子育种的方法挑选遗传距离较远的亲本，从而解决了近交衰退的问题。由此依据此综合遗传育种的方法能高效培育出性状优良、遗传背景清晰、基因库较大、遗传稳定的群体。
【发明内容】
[0005]技术目的:经过历代养殖与选育发现，最初的暗纹东方飩体呈棕褐色，养殖过程中暗纹东方飩现已出现两种性状优良、抗病力强的群体，其中一类为保留引种群体体色和花纹的个体称为野生型个体，另一类体色加深、花纹特征不明显但生长速度较快的称之为黑色个体，本发明中进一步将这两种优良性状的群体作为基础群体进行家系遗传选育，由此，我们开发了一种新的育种方法，首先以分子标记为指导构建家系，每个家系亲本所产后代单独养殖在大水体中，将每个大水体看作一个生产单元继续进行家系内的群体选育，结合暗纹东方飩的生产一从鱼苗到成熟一共进行6次筛选，该育种方法采用家系育种的理念，融合了分子标记技术和群体选育技术，充分发挥环境对基因的影响，克服了家系选育中因家系个体少而不具代表性的弊病，使得基因充分表达，达到生产与科研相结合的目的。
[0006]技术内容:本发明所揭示的一种暗纹东方飩群体一家系一分子综合遗传育种的方法，其具体步骤为:
a.基础亲鱼选择
从群体中挑选体格健壮、色泽好、性腺发育良好的暗纹东方飩作为繁殖的亲鱼进行连续四代群体选育，在群体选育后出现两种性状分离明显的群体，分别是野生暗纹东方飩及黑色暗纹东方飩；
b.建立家系
以野生暗纹东方飩和黑色暗纹东方飩作为基础选育群体，利用分子标记技术对亲本DNA进行检测，统计分析并计算出亲本个体之间的相似度和遗传距离等遗传参数，并根据个体间的遗传距离指导亲本I对I的配组繁殖，结合遗传距离以及形态特征构建了 80个家系，其中分为20个黑色自交家系，40个黑色与野生正反交配对家系及20个野生型自交家系;
c.以生产单元为基础的群体选育
将每个家系作为一个生产单元，从鱼苗到亲鱼分别在孵化后、50日龄、210日龄、370日龄、530日龄和690日龄进行筛选，最终选择出存活率高，体格健壮、无外伤、色泽好、条纹清晰、活力强、性腺发育良好及生长速度快的家系作为配种亲本，在整个选育的过程中，为了减少环境条件的差异，确保每个家系在各阶段的养殖空间的大小、水温、盐度、光照、溶氧和饵料条件保持一致，同时在不同的养殖阶段，保证各家系的养殖数量一致；
d.第二代家系选育亲鱼配种
通过Populat1ns软件对步骤c中选育出的配种亲本进行计算,得到雌雄个体间的遗传距离矩阵，根据雌雄个体间的遗传距离和形态特征指导上述亲本进行I对I配对繁殖，选取遗传距离排名前80的雌雄个体作为待配对的亲本，建立第二代选育家系80个；取遗传距离较小的雌雄个体建立对照家系20个，人工催产授精，受精后每个家系的受精卵分别放入不同的孵化桶中分别进行孵化，孵化水温20-24 °C，溶氧6 mg/L以上，盐度小于1%。，孵化时间4-5天，得到第二代家系选育的鱼苗；
e.对80组第二代选育家系和20组第二代对照组家系重复步骤b~d的选育步骤，得到第三代鱼，开展新一轮的家系选育。
[0007]所述步骤c中六次筛选的具体步骤分别为:
第一次筛选:80个家系的鱼苗孵化后统计各家系鱼苗的孵化率和成活率，在产卵量为12-18万粒卵的个体中选择孵化率在90%以上的家系中选择68个作为要保留的家系,在每个家系中选择10万尾孵化仔鱼转移至温室苗种培育池进行强化培育；
第二次筛选:待鱼苗培育至3-4 cm后，挑选成活率高、活力强、趋光性好的家系转移至野化驯养池中，观察统计各家系鱼苗生长、抗病、摄食的情况，其中选择的家系数量为50个，每个家系保留5万尾；
第三次筛选:同年放置的鱼苗养至10月底时要再一次转移至温室越冬，转移时选择标准为活力强，生长速度快，选择生长和抗逆性排在前40的家系继续单独养殖，每个家系保留I万尾，在温室养殖时不断对养殖条件进行优化，采用海水养殖并逐渐增加盐度模拟河豚鱼天然海水养殖环境，保证各家系的养殖环境一致；
第四次筛选:越冬结束后还需将鱼转移至野外露天池中育肥，在转池的过程中进行第四次筛选，选择目标有三:一是生长速度，即选择鱼群中生长最快的个体；二是形态特征，凡是形态特征不明显的个体均予以淘汰，三是遗传纯度，选留排名靠前30的家系继续单独养殖，每个家系保留5000尾转至野外露天池单独养殖；
第五次筛选:此时暗纹东方飩已基本达到商品鱼的规格，统计商品鱼的体重、体长、花纹、均匀度的生物学和商品指标，按照体重和花纹指标选择20个家系，每个家系保留500尾鱼单独养殖并使其接近性成熟；
第六次筛选:亲鱼成熟前，要对其进行强化培育，将第五次筛选后的鱼转移至亲鱼培育池，转移时选留体格健壮、无外伤、色泽好、条纹清晰、活力强、性腺发育良好的家系10个，每个家系保留备用亲本50尾，统计备用亲本的表型性状和遗传学特性。
[0008]所述第六次筛选中，表型性状包括体重、全长、体长、体宽、体厚的指标，遗传学特性包括个体的遗传距离、遗传相似度、育种值。
[0009]有益效果:本发明所述的暗纹东方飩群体一家系一分子综合遗传育种的方法，具有以下优点
1.本发明采用了群体一家系一分子的育种模式，首先利用群体选育扩大育种亲本的基因库，使后面家系选育的候选基因更多更全，然后结合分子标记进行家系育种，既提高了遗传纯度，又确保了遗传多样性，改善了家系选育中近亲交配基因库快速缩小的弊病。
[0010]2.本发明采用大水体养殖选育，在生产养殖的环境条件下直接进行选育，这样选育的结果更具有代表性，更能发挥环境基因对鱼类生长的影响，使选育的基因充分表达，与此同时还达到科研和生产相结合的目的，在进行选育工作的同时还可以对生产进行优化从而取到双赢的效果。
[0011]3.采用分子标记技术指导亲本配对，计算个体间的遗传距离、近交系数