专利名称：群体感应信号分子抑制剂产生菌的鉴别方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种鉴别产生群体感应信号分子抑制剂的微生物 的方法，本发明还涉及该方法在制备预防人和畜禽等动物疾病的益生素(微生态制剂)中 的应用。
背景技术：
群体感应(Quorum Sensing，QS)是细菌根据自身细胞密度变化进行自我协调的 一种群体行为。许多细菌能产生并释放一种被称为自诱导物(Auto Inducer，Al)的信号 分子，随着细菌密度的增加，信号分子积累到一定浓度时则会与胞浆受体蛋白结合，调控细 菌相关基因的表达，使细菌形成一种群体行为来有效地抵御环境压力、攻击宿主等。在一些 致病菌(如铜绿假单胞菌、粘质沙雷氏菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、嗜水气单胞菌等)中，群 体感应系统调控相关致病因子的产生，如促进毒素、蛋白酶的产生、黏附、生物膜(Biofilm) 的形成等。大量文献表明缺失了群体感应系统的菌株其致病能力大大降低，因此细菌群体 感应系统可作为抗感染药物研发的新靶标。益生素(Probiotic)又称微生态制剂或活菌制剂，是一类活性微生物添加剂。一 方面，益生素被动物采食后能在消化道特别是肠道内发育、繁殖并起有益作用，能促进动物 生长发育，提高饲料利用率，降低幼畜幼禽死亡率，防止消化道疾病，提高机体免疫力；另一 方面，相对使用抗生素引起的药物残留、耐药菌株产生等问题，作为新型绿色添加剂的益生 素，由于其无残留、无污染以及不产生耐药性等特点，有其独特的优越之处，因而益生素已 成为在畜禽饲料中很有前途的新型饲料添加剂。通过筛选能产生群体感应抑制剂的微生物作为微生态制剂的出发菌是一个既发 挥了群体感应信号分子抑制剂的作用，抑制病原菌产生群体感应信号分子，抑制其致病因 子的产生，又能发挥微生态制剂特性的途径，从而为人及动物疾病的预防提供更好的方法。
发明内容
本发明的目的是针对上述技术问题提供一种鉴别产生群体感应分子抑制剂的微 生物的方法。本发明的另一个目的是提供采用上述方法得到的微生物所制备的微生物在制备 预防人或动物疾病的益生素中的应用。本发明的目的是通过下列技术措施实现的一种鉴别产生群体感应信号分子抑制剂的微生物的方法，包括下列步骤a、将含微生物的样品用无菌生理盐水稀释，取100 μ 1接种于IOml含有500 μ g/L 群体感应信号分子(acyl-homoserine lact0ne，AHLs，N-酰基高丝氨酸内酯)的KG液体培 养基中，28-37°C，200rpm摇床培养24h，转接到相同培养基中，连续3次后将获得的增菌液 稀释涂布于LB琼脂平板上，获得单个菌落；b、挑取获得的单个菌落做一字型接种于LB琼脂平板中央，28-37°C培养12_24h ；
C、将 5ml 含有 106CFU/ml 指示菌紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum) ATCC12472 或者农杆菌(Agrobacterium tumfaciens) KYC6 的 45_50°C保温的 0. 5% LB 琼脂 倾倒于步骤b所获得的平板上，24-48h培养，在平板中央分离菌周围未产生紫色或者蓝色 色素的，说明该菌能产生群体感应信号分子抑制剂。所述的方法，其中步骤a所用KG液体培养基每升含有氯化钠l.Og，氯化 钾0. 5g，氯化镁0. 4，氯化钙0. Ig,硫酸钠0. 15g，磷酸二氢钾5. Og, 2-(N-morpholino) ethanesulfonicacid (MES，2_吗啉乙磺酸)1. Og,另含Img氯化铁，0. Ig氯化锰，0. 46g氯化 锌以及500yg C4_14-HSL，其余为水。所述的方法，其中LB琼脂平板是在LB液体培养基中加入1. 5衬％的琼脂，LB液体 培养基每升含有胰蛋白胨10. 0g，酵母粉5. 0g，氯化钠10. 0g，其余为水，PH为7. 0-7. 5。采用上述鉴别方法得到的能产生群体感应信号分子抑制剂的微生物在制备预防 人或动物疾病的益生素中的应用。运用该方法制备益生素(微生态制剂)，能够有效的抑制致病菌群体感应分子的 活性，从而抑制致病菌的致病性。进一步，运用该技术制备益生素预防人及畜禽疾病。本发明技术方案的分析，在第一步中，微生物产生群体感应信号分子 (acyl-homoserine lactone，AHLs，N-酰基高丝氨酸内酯)抑制剂能够降解C4_14_HSL (是群 体感应信号分子中的一种)，从而利用C4_14-HSL提供的C源、N源进行生长，而且不产生群 体感应信号分子抑制剂的微生物则不能生长。第二步LB琼脂培养基可适合微生物生长；第三步确认该微生物能够群体感应信号分子抑制剂，因为抑制剂能抑制指示菌紫 色色杆菌ATCC12472产生紫色(以农杆菌KYC6为指示菌则为蓝色)，培养皿中央可见有菌 落线(说明微生物能够生长)，周围呈现紫色，说明指示菌也能生长。但中间不显示紫色，说 明存在能抑制指示菌产生紫色的抑制剂。本发明可用于鉴别的微生物包括细菌、真菌、放线菌等。本发明的有益效果1、本方法简单易得，不需要昂贵的设备，检测目标明确。2、本方法成本低廉，可迅速获得能产生群体感应抑制剂的微生物，可大规模筛选 能产生群体感应抑制剂的微生物。3、能够产生细菌群体感应信号分子抑制剂，可抑制致病菌群体感应信号分子的活 性，从而抑制致病菌致病因子相关基因的表达，从而有效地控制致病菌的感染。4、该方法筛选的菌作为微生态制剂的出发菌，能够促进人和动物正常菌群的平 衡，有效刺激肠道粘膜免疫，提高饲料率用率。
图1是产群体感应信号分子抑制剂菌筛选示意图。图2是群体感应信号分子产生菌抑制色素产生的照片。
具体实施例方式以下通过实施例对本发明作进一步的阐述，其中采用的菌种仅为了使本领域普通技术人员理解本发明而举例用，不可理解为本发明的方法仅能用于这几个具体的菌筛选。实施例中所用的菌种购自美国标准生物品收藏中心(ATCC)。C6-HSL (N-hexanoyl-L-homoserinelactone，购自 Sigma 公司)指含有 6 个 C 原子 数的侧链，C4 C14都可以。实施例1产群体感应信号分子抑制剂芽孢菌的筛选，具体操作如下1、取含有微生物的土样Ig置于IOml无菌生理盐水中100°C水浴lOmin，2、取100 μ 1上述样品液接种于IOml含有500 μ g/L群体感应信号分子 (acyl-homoserinelactone，AHLs，N-酰基高丝氨酸内酯)的KG液体培养基中(250ml的三 角烧瓶)，30°C，200rpm摇床培养24h。3、取100 μ 1转接到KG液体培养基中，连续3次后将获得的增菌液稀释涂布于LB 琼脂平板上，获得单个菌落。(KG液体培养基每升含有氯化钠1.(^，氯化钾0.58，氯化镁0.4，氯化钙0. lg，硫 酸钠 0. 15g，磷酸二氢钾 5. Og, 2- (N-morpholino) ethanesulfonic acid(MES，2-吗啉乙磺 酸)1.0g，另含Img氯化铁，0. Ig氯化锰，0. 46g氯化锌以及500yg C6-HSL，其余为水。LB 琼脂平板是在LB液体培养基中加入1. 5衬％的琼脂，LB液体培养基每升含有胰蛋白胨 10. 0g，酵母粉5. 0g，氯化钠10. 0g，其余为水，pH为7. 0-7. 5。)4、挑取获得的单个菌落做一字型接种于LB琼脂平板中央，30°C培养24_48h ；5、将5ml含有106CFU/ml指示菌紫色色杆菌ATCC12472的45_50°C保温的0. 5% LB琼脂倾倒于步骤4所获得的平板上，24-48h培养，在平板中央分离菌周围未产生紫色色 素，说明该菌能产生群体感应信号分子抑制剂(图2)。图2中可见培养皿中央可见有菌落线，说明分离的微生物能够生长，周围呈现紫 色，说明指示菌也能生长，但中间不显示紫色，说明中央菌落线的微生物产生了能够抑制指 示菌紫色色杆菌ATCC12472产生紫色的抑制剂。该分离的微生物可用于制备预防人或动物疾病的益生素。制备益生素的方法为本 领域技术人员熟知的技术。实施例2 操作过程如实施例1，所不同的是指示菌采用农杆菌(Agrobacterium tumfaCiens)KYC6，培养皿周围呈现蓝色，中央菌落线周围不显色。 该分离的微生物可用于制备预防人或动物疾病的益生素。制备益生素的方法为本 领域技术人员熟知的技术。
权利要求
一种鉴别产生群体感应信号分子抑制剂的微生物的方法，其特征在于包括下列步骤a、将含微生物的样品用无菌生理盐水稀释，取100μl接种于10ml含有500μg/L群体感应信号分子N 酰基高丝氨酸内酯的KG液体培养基中，28 37℃，200rpm摇床培养24h，转接到相同培养基中，连续3次后将获得的增菌液稀释涂布于LB琼脂平板上，获得单个菌落；b、挑取获得的单个菌落做一字型接种于LB琼脂平板中央，28 37℃培养12 24h；c、将5ml含有106CFU/ml指示菌紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)ATCC12472或者农杆菌(Agrobacterium tumfaciens)KYC6的45 50℃保温的0.5％LB琼脂倾倒于步骤b所获得的平板上，24 48h培养，在平板中央分离菌周围未产生紫色或者蓝色色素的，说明该菌能产生群体感应信号分子抑制剂。
2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤a所用KG液体培养基每升含有氯化钠 1. Og,氯化钾0. 5g，氯化镁0. 4，氯化钙0. Ig,硫酸钠0. 15g，磷酸二氢钾5. Og, 2-吗啉乙磺 酸1. 0g，另含Img氯化铁，0. Ig氯化锰，0. 46g氯化锌以及500 μ g C4_14_HSL，其余为水。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于LB琼脂平板是在LB液体培养基中加入 1. 5衬％的琼脂，LB液体培养基每升含有胰蛋白胨10. 0g，酵母粉5. 0g，氯化钠10. 0g，其余 为水，pH 为 7. 0-7. 5。
4.采用权利要求1所述鉴别方法得到的能产生群体感应信号分子抑制剂的微生物在 制备预防人或动物疾病的益生素中的应用。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，公开了群体感应信号分子抑制剂产生菌的鉴别方法及应用。该方法通过将含有微生物的样品接种于含有N-酰基高丝氨酸内酯的KG培养基中进行增菌后接种在LB平板上获得单个菌落，采用指示菌紫色色杆菌或农杆菌进行检测，分离菌周围不产生色素表明该菌能够产生群体感应信号分子抑制剂。该技术可用于人和动物上作为疾病预防的益生素的筛选及应用。该技术具有方法简单，能有效控制致病菌致病因子的产生，同时又提高动物粘膜免疫功能，提高饲料利用率的特点。
文档编号C12Q1/04GK101914607SQ20101023670
公开日2010年12月15日 申请日期2010年7月26日 优先权日2010年7月26日
发明者储卫华 申请人:储卫华;江苏星海动物药业科技有限公司