专利名称：利用家蚕生物反应器生产猪圆环病毒2型重组衣壳蛋白亚单位疫苗的方法及其产品的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及利用家蚕生物反应器生产猪圆环病毒2型重组衣 壳蛋白亚单位疫苗的方法及其产品。
背景技术：
猪圆环病毒2型(Porcine circovirus II，PCV2)属于圆环病毒科 (circoviridae)圆环病毒属(circovirus)，猪圆环病毒2型(PCV2)感染可损伤猪的免疫 系统，引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)等猪圆环病毒性疾病(Porcine cirvovirus disease,PCVD)0猪圆环病毒2型(PCV2)开放性阅读框2 (0RF2)编码病毒衣壳蛋白(Cap)， 大小约为30KDa。Cap蛋白上存在抗原表达位点，具有免疫原性，因此成为PCV2特异性血清 学检测方法和亚单位疫苗、核酸疫苗的基础。专利CN101180406A中，公开了利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中生产PCV2 Cap蛋白的方法。然而，市售的昆虫细胞以及细胞培养基价格昂贵，而且大规模培养细胞需 要购置专门的细胞培养生物反应器，投资很大，生产过程中易受环境条件的污染，而且细胞 培养获得重组蛋白产物翻译后修饰不能有效进行，细胞培养生产外源蛋白的效率相对比较 低。这些都限制了 PCV2 Cap蛋白在昆虫细胞中大规模生产和应用。
发明内容
有鉴于此，本发明的主要目的在于提供一种利用家蚕生物反应器生产猪圆环病毒 2型重组衣壳蛋白亚单位疫苗的方法，包括以下步骤A克隆猪圆环病毒2型衣壳蛋白的0RF2基因，与杆状病毒转移载体连接，获得重组 转移载体；B重组转移载体与杆状病毒共同转染昆虫细胞，培养物上清经噬斑筛选，获得重组 杆状病毒；C重组杆状病毒感染家蚕幼虫或蚕蛹，在家蚕幼虫或蚕蛹中表达重组猪圆环病毒 2型衣壳蛋白；D回收重组病毒感染的家蚕幼虫或蚕蛹的血淋巴；E分离纯化血淋巴中的重组猪圆环病毒2型衣壳蛋白；F利用纯化的重组猪圆环病毒2型衣壳蛋白，辅以佐剂，制备猪圆环病毒2型亚单 位疫苗。优选地，本发明步骤A中猪圆环病毒2型衣壳蛋白的0RF2基因序列包含序列表中 的 SEQ ID NOl。优选地，本发明步骤B中所述重组杆状病毒中猪圆环病毒2型0RF2基因的表达受 多角体启动子的控制。优选地，本发明步骤B中所述昆虫细胞包括家蚕卵巢细胞。
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优选地，本发明步骤B中所述的杆状病毒包括家蚕核型多角体病毒。优选地，本发明步骤C中所述的家蚕品种包括箐松X皓月或与之相一致的家蚕品 种。优选地，本发明步骤E中所述的重组猪圆环病毒2型衣壳蛋白序列包含序列表中 的 SEQID N02。优选地，本发明步骤E中所述的重组猪圆环病毒2型衣壳蛋白为如下三种多肽的 任意一种i)选自序列表中的SEQ ID N02序列的多肽；ii)与i)所述多肽至少80%同源的多肽；iii)i)和ii)所述多肽的免疫原性部分。优选地，本发明步骤F中所述的佐剂为水性佐剂或油性佐剂。本发明另一方面在于使用本发明方法生产的重组猪圆环病毒2型衣壳蛋白。本发明又一方面在于使用本发明方法的猪圆环病毒2型重组衣壳蛋白亚单位疫
田ο优选地，本发明方法制备的疫苗每头份包含至少0. 5微克重组猪圆环病毒2型衣 壳蛋白。技术效果本发明使用了家蚕生物反应器生产PCV2 Cap蛋白，与采用细胞培养的现有技术相 比，具有很大的优越性。首先，我国已有5000多年的养蚕业历史，有丰富的家蚕资源。家蚕易于饲养，成本 低廉；其次家蚕生产蛋白，翻译后修饰效率高，并且能分泌到血液中，分离纯化比较容易。而 且家蚕的血淋巴具有储存蛋白的能力，淋巴内含有蛋白分解酶的抑制物，对目的蛋白起到 保护作用。家蚕生产蛋白的效率要远高于细胞培养表达效率，而且又很容易从家蚕体内分 离纯化出来。其次，本发明构建的重组家蚕核型多角体病毒(BmNPV)，带有完整的PCV2 Cap蛋 白目的基因，位于家蚕核型多角体基因启动子控制下，具有极晚期表达和表达量高的优点。 利用本发明的家蚕生物反应器生产PCV2 Cap蛋白的方法，安全可靠，适合大规模生产，为大 量生产猪圆环病毒2型特异性血清学检测抗原和猪圆环病毒2型疫苗的抗原成分Cap蛋白 提供了基础。
图1为重组家蚕核型多角体病毒构建流程图；图2为SDS-PAGE鉴定重组PCV2 Cap蛋白的表达；图3为Western blot鉴定重组PCV2 Cap蛋白的表达；图4为重组PCV2 Cap蛋白表达量的测定。
具体实施例方式本发明实施例中昆虫细胞使用了家蚕卵巢细胞(BmN)，其他类型的昆虫细胞，如家 蚕胚胎细胞，也可使用本发明之方法生产猪圆环病毒2型衣壳蛋白亚单位疫苗。
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本发明实施例中使用的家蚕品种为箐松X皓月，其他与之相一致的家蚕品种，如 白玉X秋风、苏镇X春光、皓月X箐松、871Χ872、57Α·57ΒΧ24·26等，也可使用本发明 之方法生产猪圆环病毒2型衣壳蛋白亚单位疫苗。本发明实施例中使用的佐剂为ISA206油性佐剂，本领域其他类型的水性佐剂或 油性佐剂，及本领域常用的其他乳化方法，也可使用本发明之方法生产猪圆环病毒2型衣 壳蛋白亚单位疫苗。本发明实施例中优选了疫苗成品猪圆环病毒2型衣壳蛋白的含量为0. 2微克/头 份、0. 5微克/头份、1微克/头份、2微克/头份、5微克/头份、10微克/头份和15微克/ 头份。根据本发明实施例，当剂量大于0.5微克时即可以对猪产生良好的免疫效果。本发 明术语头份的含义为一般情况下，免疫一头牲畜所需的疫苗用量。本实施例中构建的重组家蚕核型多角体病毒，带有完整的PCV2Cap蛋白基因，位 于家蚕核型多角体基因启动子控制下，多角体基因被PCV2 Cap蛋白基因取代，具有极晚期 表达和表达量高的优点。在家蚕卵巢细胞、幼虫和蚕蛹中，表达产物经SDS-PAGE和Western blot鉴定，结果表明构建的重组家蚕核型多角体病毒能够高效表达PCV2Cap蛋白，大小约 为28kDa。纯化的重组PCV2 Cap蛋白辅以佐剂，制备PCV2 Cap蛋白亚单位疫苗。通过仔猪 攻毒试验，验证该亚单位疫苗仅包含0. 5微克/头份的重组PCV2 Cap蛋白就具有很好的免 疫保护作用。本发明实施例中重组猪圆环病毒2型衣壳蛋白为序列SEQ IDN02的多肽；使用本 发明之方法还可生产如下重组猪圆环病毒2型衣壳蛋白与所述选自序列SEQ ID N02的多 肽至少80%同源的多肽及上述多肽的免疫原性部分。制备上述多肽的实施例方法与过程 与本发明实施例相同，下面不再累述。为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这 些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验 方法，通常按照常规实验方法进行。实施例1家蚕杆状病毒表达系统表达重组猪圆环病毒2型衣壳蛋白1)克隆猪圆环病毒2型衣壳蛋白的基因序列0RF2，与杆状病毒转移载体连接，获 得重组转移载体；提取PCV2-SH株(保藏号为CGMCC No. 2389) DNA作为扩增Cap蛋白基因的模板， 贮存于-20°C，备用。根据GenBank的PCV2全基因序列，设计一对引物用于扩增PCV20RF2开放性阅读 框基因序列。分别在上下游引物的5'端加上BamH I和Xhol I酶切位点(下划线表示)。上游引物5‘ -CGCGGATCCATGACGTATCCAAGGAGGC-3 ‘；下游引物5‘ -CCGCTCGAGGGGTTTAAGTGGGGGGTCT-3 ‘；利用设计的引物PCR扩增PCV2 0RF2基因片段，琼脂糖电泳并回收PCV2 0RF2基因 的条带。对胶回收的条带进行BamH I酶和XholI酶双酶切鉴定回收，同时将pBacPAK8质 粒(购自Clontech公司)用BamH I酶和XholI酶同样进行双酶切鉴定回收。对回收的目 的片段和PBacPAKS质粒进行T4连接酶连接，转化到DH5 α大肠杆菌中，筛选阳性克隆，提 取质粒，阳性质粒命名为pBacPAK8-Cap (质粒的构建参见图1)，即含PCV2 Cap蛋白基因重 组转移载体。用PCR扩增并测序，测序结果与GenBank登记的猪圆环病毒2型衣壳蛋白基因一致。因此，由测序结果可知，含PCV2 Cap蛋白基因重组转移载体中含0RF2基因序列， 即含序列表中的SEQ ID NOl序列。2)重组转移载体pBaCPAK8-Cap和家蚕核型多角体病毒(BmNPV)共转染家蚕卵巢 (BmN)细胞；培养物上清经噬斑筛选，获得重组杆状病毒；BmN细胞，购自美国标准生物品收藏中心(ATCC，CRL-8910)，以2. 5X IO6个/孔接 种于6孔组织细胞培养板，于27°C培养箱中贴壁培养。2h后移去培养基，每孔加2ml含10% 胎牛血清(FBS)的TC-100昆虫细胞培养基于室温放置。准备无菌的离心管，向其中加入 0. 1 μ g 1 μ g BmNPV DNA, 0. 5yg~1.5yg 重组转移载体 pBacPAK8_Cap、2 μ 1 25 μ 1 脂质体转染试剂Lipofectin。优选方案是BmNPV DNA含量0. 2 μ g ;pBacPAK8_Cap质粒含 量1 μ g ；脂质体转染试剂含量20 μ 1。充分混合后加入800 μ 1的TC-100培养基，混合后做为转染液。以点滴状的方式将 其加到BmN细胞中。将细胞培养板于27°C培养箱中放置24h后吸尽转染液，每孔加入4ml 含10%胎牛血清(FBS)的TC-100培养基，将平板于27°C培养箱中放置5天。收获转染细 胞上清液，4°C保存，该上清中即包含发生重组的家蚕核型多角体病毒。家蚕卵巢(BmN)细胞以2. 5X IO6个/孔接种于6孔细胞培养板，于27°C培养箱中 贴壁培养。2h后移去培养基，每孔接种500 μ 1的上述转染细胞上清液，感染吸附2h后去掉 感染液。将预融并42°C保温的4%低熔点琼脂糖凝胶与37°C保温的1. 33XTC-IOOd. 3倍 的TC100培养基)培养基，按1 3的比例充分混合后，以2. 5mL/孔加入上述细胞培养板 中。待琼脂糖凝固后，将细胞培养板倒置于无菌的湿盒中，27°C培养，逐日观察结果。通过倒置显微镜观察，筛选由细胞病变产生的病毒噬斑。将挑取的病毒噬斑溶解 于500μ1 TC-100生长培养基中，4°C过夜，让病毒从琼脂中释放出来。继续接种于6孔 组织细胞培养板培养的BmN细胞上，进行第二轮的噬斑筛选以获得纯的重组病毒，命名为 BmPNV-Cap病毒，用病毒噬斑滴度的方法鉴定病毒的滴度。3)重组BmPNV-Cap病毒感染家蚕幼虫，生产重组猪圆环病毒2型衣壳蛋白；重组BmPNV-Cap病毒以感染指数M. 0. I. = 0.5的剂量感染家蚕卵巢细胞，27°C 培养5天，收获病毒液，做为基础种毒。挑选5日龄家蚕(皓月X箐松)幼虫，按照感染剂量为IO5Pfu(噬斑形成单位)/ 头，用微量移液器于家蚕幼虫腹部第一环节或第二环节注射。分别于感染72h、84h、96h、108h、120h、132h、144h和156h后，收获感染重组杆状病 毒的幼虫，-20°C冻存。4)回收重组BmPNV-Cap病毒感染的家蚕的血淋巴；取收获的感染重组杆状病毒的幼虫用组织碾磨器勻浆，用100目网筛(孔径 0. 150mm),600rpm离心lOmin，过滤勻浆液，收集滤液。滤液经6000rpm于4°C条件下离心 30min后取上清。5)分离纯化血淋巴中的重组PCV2 Cap蛋白；在收集的上清中，加入4倍体积的lmol/1的柠檬酸缓冲液(pH5. 0)，充分搅拌2h 后于4°C条件下12，OOOrpm离心30min后取上清，转至真空冷冻干燥机进行冻干，于_70°C 进行保存。取感染家蚕幼虫72h、84h、96h、108h、120h、132h、144h和156h后收获的样品进行
6SDS-PAGE电泳和紫外分光光度计测定重组PCV2Cap蛋白及其含量。结果见附图4，结果显 示至少感染后120h，重组PCV2 Cap蛋白表达产率有大幅提高，感染后第132h表达量达到峰 值，超过 700μ g/ml。同时取冻干后样品进行SDS-PAGE鉴定重组蛋白的鉴定，结果见图2 ；其中，第1孔 为家蚕血淋巴阴性对照；第2孔为蛋白质Marker ；第3孔为家蚕感染重组病毒后第120h血 淋巴样品；第4孔为家蚕感染重组病毒后第96h血淋巴样品。SDS-PAGE蛋白质电泳凝胶观 察到大小约为28.2KDa的特异性条带，即为PCV2 Cap蛋白，与预计结果一致。将目的蛋白 进行测序，由测序结果可知，PCV2 Cap蛋白含序列表中的SEQ ID N02序列。采用Western blot鉴定表达的重组PCV2 Cap蛋白。取冻干样品感染后第96h样 品、第120h样品进行SDS-PAGE电泳，然后再进行转膜，将凝胶上的蛋白转移到硝酸纤维素 膜上，封闭液封闭后，加上针对PCV2 Cap蛋白的单抗，再加上带有标记物的二抗。然后判定 重组PCV2 Cap蛋白的表达。结果见附图3，其中，第1孔为家蚕感染重组病毒后第120h后 血淋巴样品，第2孔为家蚕感染重组病毒后第96h后血淋巴样品，第3孔为家蚕血淋巴阴性 对照样品。结果显示，在第120h和第96h样品中，硝酸纤维素膜上都能观察到一条分子量 大小与预期大小一致的特异性条带，而家蚕血淋巴阴性对照样品中未观察到任何特异性条 带。说明表达的重组PCV2 Cap蛋白能够同猪圆环病毒2型抗体特异性结合，说明重组PCV2 Cap蛋白具有特异的猪圆环病毒2型免疫原性。6)利用重组PCV2 Cap蛋白，辅以佐剂，制备重组PCV2 Cap蛋白亚单位疫苗；准备不同浓度的抗原稀释物，并与ISA206佐剂混合乳化。ISA206佐剂经121°C、 60min高压湿热灭菌，按照抗原/佐剂体积比例46 54混合。使用德国产IKA 2000/4型乳 化机，先将佐剂加入乳化机料筒内，在搅拌状态下(IOOrpm)缓缓将抗原水相滴入佐剂中， 滴完后，继续搅拌5min。用乳化机5000rpm，循环乳化4min，得到PCV2 Cap蛋白亚单位疫苗 成品。优选地，疫苗成品PCV2 Cap蛋白的含量为0. 2微克/头份、0. 5微克/头份、1微 克/头份、2微克/头份、5微克/头份、10微克/头份和15微克/头份。制备好的疫苗经粘度检测、离心检测、剂型检测、稳定性检测后，各项指标均符合 规定。疫苗保存于4°C。每剂量体积为2ml。本发明方法生产的PCV2 Cap蛋白抗原还可以与其他的油性佐剂、水性佐剂或其他 佐剂混合使用，如本领域常见的白油佐剂、铝胶佐剂、弗氏佐剂等等。实施例2重组PCV2 Cap蛋白亚单位疫苗的效力检测筛选10 14日龄的猪圆环病毒、猪瘟病毒、猪蓝耳病病毒、猪细小病毒等主要病 原阴性猪。将符合条件的仔猪随机分为9组，每组10头，7组给予包含不同量重组Cap蛋 白的亚单位疫苗(分别包含重组衣壳蛋白0. 2微克/头份、0. 5微克/头份、1微克/头份、 2微克/头份、5微克/头份、10微克/头份和15微克/头份)，1组做为攻毒对照，另1组 做为阴性对照。其中，第1组给予包含重组Cap蛋白0. 2微克/头份的亚单位疫苗；第2组 给予包含重组Cap蛋白0. 5微克/头份的亚单位疫苗；第3组给予包含重组Cap蛋白1微 克/头份的亚单位疫苗；第4组给予包含重组Cap蛋白2微克/头份的亚单位疫苗；第5组 给予包含重组Cap蛋白5微克/头份的亚单位疫苗；第6组给予包含重组Cap蛋白10微克 /头份的亚单位疫苗；第7组给予包含重组Cap蛋白15微克/头份的亚单位疫苗；第8组做为攻毒对照组，不给予任何包含重组Cap蛋白的亚单位疫苗。第1 7组进行两次免疫， 间隔2周。在第二次免疫后21天对第1 8组进行病毒攻击，毒株选用PCV2-SH株(CGMCC No. 2389) (106 0TCID50/ml)，每头猪滴鼻1ml，颈部肌肉注射2ml，隔离饲养。攻毒后第4、7天 分别在两腋下和两臀部注射弗氏不完全佐剂乳化的钥匙孔血蓝蛋白(4mg/ml，0.5ml)和腹 腔注射巯基乙酸培养基10ml。在第11天和19天腹腔注射巯基乙酸培养基10ml。攻毒后 25天进行剖杀。第9组做为阴性对照组，单独隔离饲养，在第1 8组攻毒后25天进行剖 杀。所有猪只在第1次免疫前、攻毒前和剖杀前收集血样。在第1次免疫前、攻毒前和剖杀前对所有猪只收集血样，通过ELISA法进行PCV2 血清抗体分析。攻毒后25天剖检全部猪只，观察各组织器官病理变化、拍照记录。符合以 下3项中的任何2项，即可判为发病。A.临床症状仔猪体温升高(彡400C )，应至少持续 3日，出现明显食欲减退、精神沉郁、被毛粗乱、消瘦和生长速度减缓；B.病理变化腹股沟 和气管淋巴结水肿、肺脏轻度水肿，肾脏发黄或有点状坏死。组织学病变为淋巴结有明显淋 巴细胞侵入，或有多核巨细胞；C.病毒检测用PCR检测淋巴结组织，检测到PCV2。结果本实施例结果如下。表1是各组试验猪在第1次在第1次免疫前、攻毒前和剖杀前对所有猪只收集的 血样进行ELISA检测血清中PCV2特异性抗体的结果。表1.各组试验猪PCV2血清抗体分析结果
组别PCV2抗体阳性率(％)第1次免疫前攻毒前剖杀前第1组0100100第2组0100100第3组0100100第4组0100100第5组0100100第6组0100100第7组0100100第8组00100第9组000表2.是各组试验动物在剖杀前观察临床表现和剖杀后进行病理变化检测和淋巴 结PCR检测病毒的试验结果。表2.各组试验动物发病判定结果
8 结果分析根据试验动物临床症状、剖检病理变化检测和病原的PCR检测判断结 果，其中第8组攻毒对照组仔猪全部发病。第1组试验动物有2只发病，亚单位疫苗保护率 为80%，第2 7组试验动物均没有发病，保护率均为100%。第2组亚单位疫苗效果好于 第1组，可以推断必须包含0. 5微克抗原或者更多抗原的亚单位疫苗可以给动物提供足够 的保护，以能有效的保护畜群对抗PCV2。以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精 神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
一种利用家蚕生物反应器生产猪圆环病毒2型重组衣壳蛋白亚单位疫苗的方法，其特征在于，包括以下步骤A克隆猪圆环病毒2型衣壳蛋白的ORF2基因，与杆状病毒转移载体连接，获得重组转移载体；B重组转移载体与杆状病毒共同转染昆虫细胞，培养物上清经噬斑筛选，获得重组杆状病毒；C重组杆状病毒感染家蚕幼虫或蚕蛹，在家蚕幼虫或蚕蛹中表达重组猪圆环病毒2型衣壳蛋白；D回收重组病毒感染的家蚕幼虫或蚕蛹的血淋巴；E分离纯化血淋巴中的重组猪圆环病毒2型衣壳蛋白；F利用纯化的重组猪圆环病毒2型衣壳蛋白，辅以佐剂，制备猪圆环病毒2型亚单位疫苗。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤A中猪圆环病毒2型衣壳蛋白 的0RF2基因序列包含序列表中的SEQ IDNOl。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤B中所述重组杆状病毒中猪圆 环病毒2型0RF2基因的表达受多角体启动子的控制。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B中所述昆虫细胞包括家蚕卵巢细胞。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤B中所述的杆状病毒包括家蚕核型多 角体病毒。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤C中所述的家蚕品种包括箐松X皓 月或与之相一致的家蚕品种。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤E中所述的重组猪圆环病毒2型衣壳 蛋白序列包含序列表中的SEQ ID N02。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤E中所述的重组猪圆环病毒2型 衣壳蛋白为如下三种多肽的任意一种i)含有序列表中的SEQ ID N02序列的多肽； )与i)所述多肽至少80%同源的多肽； iii)i)和ii)所述多肽的免疫原性部分。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤F中所述的佐剂为水性佐剂或油 性佐剂。
10.根据权利要求1 8任意一项方法生产的重组猪圆环病毒2型衣壳蛋白。
11.根据权利要求1 9任意一项方法生产的猪圆环病毒2型重组衣壳蛋白亚单位疫苗。
12.根据权利要求11所述疫苗，其特征在于，所述疫苗每头份包含至少0.5微克重组猪 圆环病毒2型衣壳蛋白。
全文摘要
本发明提供一种家蚕生物反应器生产猪圆环病毒2型衣壳蛋白的方法，属于生物技术领域。该方法以家蚕核型多角体病毒为载体，通过转移载体中的核型多角体病毒同源臂与家蚕核型多角体病毒(BmNPV)基因同源重组的方式将猪圆环病毒2型衣壳蛋白基因整合至家蚕核型多角体病毒多角体启动子下进行目的蛋白表达。通过噬斑筛选的方法获得含目的蛋白基因的重组家蚕核型多角体病毒，以家蚕生物反应器进行目的蛋白的大规模表达，制备成含有重组猪圆环病毒2型衣壳蛋白的亚单位疫苗。通过仔猪攻毒试验，验证该亚单位疫苗具有良好的免疫保护作用。该方法具有表达效率高、目的蛋白活性好、生产成本低等特点，适于规模化生产。
文档编号C12N7/01GK101920012SQ20101023664
公开日2010年12月22日 申请日期2010年7月22日 优先权日2010年7月22日
发明者乔荣岑, 孙进忠, 张许科 申请人:洛阳普莱柯生物工程有限公司