一种可视化跟踪的家蚕生物反应器快速表达ns1蛋白的方法
【专利摘要】本发明涉及一种可视化跟踪的家蚕生物反应器快速表达NS1蛋白的方法，是构建携带有egfp表达盒和ns1基因表达盒的供体质粒，用该供体质粒转化大肠杆菌DH10B感受态细胞，供体质粒序列上Tn7R-Tn7L之间的egfp表达盒和ns1基因表达盒可特异性转座到Bm-Bacmid载体上，构建表达egfp和ns1基因的整合型重组真核表达载体，将其转染昆虫细胞后产生的重组芽生型BV病毒粒子感染家蚕，通过可视化的绿色荧光信号实时监测家蚕体内病毒增殖的情况。本发明能大规模地、实时监测外源基因在家蚕体内的表达动态情况，为揭示NS1蛋白及其它功能蛋白的特性奠定了基础。
【专利说明】一种可视化跟踪的家蚕生物反应器快速表达NS1蛋白的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及基因工程技术，公开了家蚕生物反应器可视化跟踪表达系统的构建流程及其应用。具体而言，特指一种重组芽生型病毒粒子BV的制备方法、及利用这种病毒在家蚕生物反应器中快速、高效表达家蚕二分浓核病毒非结构蛋白NSl，为NSl蛋白的后续功能和结构研究奠定基础，该方法同样也适用于其它外源基因以及具有重要功能的重组蛋白药物的表达。
【背景技术】
[0002]杆状病毒-昆虫细胞表达系统(BEVS)是当今基因工程四大表达系统之一，所利用的杆状病毒表达载体大都是选择苜猜丫纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)或者家蚕核型多角体病毒(BmNPV)。在众多的表达系统中，鉴于外源基因在原核表达系统中的表达产量相对较高，因此在表达外源基因时往往首选原核表达系统，但鉴于表达产物是以包涵体形式存在，产物没有生物活性且缺乏翻译后修饰，限制了该系统的进一步应用；单细胞酵母表达系统是一种真核表达系统，但其只能够对表达产物进行一些简单的糖基化修饰，表达产物具有一定的生物活性；哺乳动物细胞是一种理想中的真核表达系统，具有对翻译后的产物进行加工和翻译，所产生的蛋白在活性方面远胜于其它真核表达系统，更接近于天然蛋白质，但由于该系统中的外源蛋白表达量偏低，并且培养细胞所需要的成本很高，目前还难以满足大规模的实际应用。而BEVS中所表达的产物不仅具有正确的折叠，也具有翻译后加工、糖基化和磷酸化修饰等特性，所表达的产物在生物活性、抗原性和免疫原性都接近于其对应的天然产物，这些特性使BEVS成为一种应用广泛的表达系统(Kato et al., Appl Microbiol Biotechnol, 2010, 85:459-470 ；Prabhakar et al., MolBiotechnol, 2010, 46:80 - 89)。
[0003]由于BEVS具有众多独.特的特性以及安全性好，现已广泛应用于药物研发、疫苗生产以及重组病毒杀虫剂等众多研究领域中，是一种非常理想的真核表达系统，但该表达系统需要在培养的昆虫细胞中表达外源蛋白，所需费用昂贵，不适于大规模表达外源蛋白，而利用家蚕作为生物反应器则可以克服这个不利条件。家蚕是我国的一种重要经济昆虫，主要以桑叶为食，容易大规模饲养，所需要的培养设备简单，成本低廉，生产周期短，非常适于大规模表达具有重要功能的重组蛋白；另外，家蚕全基因组序列测定的完成(Xia et al.，Science, 2009，326:433 - 436.)，也有助于我们对家蚕进行遗传改造，由此可以培育出更有利于外源蛋白表达的新品种，到目前为止，全球至少已有30个实验室在利用家蚕作为生物反应器开展蛋白药物方面的研究，自1985年首次利用家蚕生物反应器高效表达了人干扰素-α (IFN-α ) (Maeda et al., Nature, 1985, 315:592 - 594)以来，30多种重组蛋白包括人生长因子、人2，6-唾液酸转移酶、人粒-巨噬细胞集落刺激因子以及人抗白蛋白免疫球蛋白Gl等功能蛋白药物在家蚕生物反应器中都成功地获得了表达(Kadono-Okuda et al., Biochem Biophys Res Commun, 1995, 213:389 - 396;Ogata etal.，BMC Biotechnolj 2009b, 9:54;Chen et al.，J Biotechnolj 2006, 123:236 - 247;Parket al., J Biotechnol，2009，139:108 - 114)，基于家蚕生物反应器巨大的商业前景，世界上很多国家都加大投资力度对家蚕生物反应器进行研发。
[0004]在家蚕体内表达外源蛋白，须制备具有感染性的重组病毒，而用传统的方法制备重组病毒需要经过多轮空斑筛选，其技术操作繁琐，仅鉴定与纯化重组病毒粒子就需要耗费一个多月的时间，还容易得到假阳性重组病毒。自1993年Luckow等(Luckow et al.，JVirol, 1993,67:4566-4579)构建了一种可以在大肠杆菌细胞中进行修饰改造的家蚕穿梭表达载体(Bm-Bacmid)后,可对供体质粒(pFastBacI)进行改造并转化含有Bm-Bacmid的大肠杆菌DHlOB细胞中，在位点特异性转座酶的作用下，供体质粒上Tn7R-Tn7L间的DNA片段就可以特异性转座到Bm-Bacmid上，进而将鉴定正确的重组Bm - Bacmid转染培养的BmN细胞，收集转染5天后的培养上清就可获得重组芽生型病毒粒子，由此，重组病毒的构建流程得到了很大的简化。将收集后的转染上清感染家蚕或者继续感染培养的BmN细胞，对感染后的家蚕或者BmN细胞总蛋白进行免疫印迹(Western blot)分析,就可以对目的蛋白是否表达进行检测，进而缩短了靶基因在BEVS中表达所需要的时间。
[0005]然而，Bm-Bacmid的基因组较大，是以低拷贝的形式在大肠杆菌DHlOB细胞中进行复制，其次，脂质体介导的重组Bm-Bacmid转染BmN细胞时效率又比较低，同时，研究表明还有一些具有特殊理化性质的蛋白在BEVS中往往难表达或者表达量偏低，因此，对构建的重组Bm-Bacmid转染的细胞中是否产生了重组病毒粒子进行快速鉴定是外源基因顺利表达的一个关键因素。以往在真核表达过程中，通过Western blot检测不到表达的靶蛋白，会令我们怀疑整个实验的设计及其流程，尤其会质疑重组Bm-Bacmid转染BmN细胞后，在细胞培养上清中是否产生了具有感染性的重组芽生型病毒粒子？因为这不仅关系到靶基因在BEVS中能否快速表达，同时也是目前制约靶蛋白功能与结构研究的一个瓶颈。而仅仅通过细胞形态上的变化难免对转染成功与否会产生误判，因此有必要创建一个能有效跟踪重组芽生型病毒粒子产生以及扩散的可视化信号，这样就可避免反复通过RT-PCR和Westernblot对目的基因转录以及表达与否来进行验证，做到省时省力又节省试剂。
【发明内容】
[0006]本发明所要解决的技术问题是:建立一种可跟踪外源基因是否进入家蚕体内进行表达的鉴定手段。主要技术路线是通过对供体质粒pFastBacI进行改造,构建egfp表达盒和多角体启动子控制下的可用于外源DNA片段插入的一个重组供体质粒，通过酶切连接的方式将nsl基因连接在多角体启动子下游，构建的该重组质粒在转座酶的作用下，特异性地转座到Bm-Bacmid中，通过脂质体Cellfectin介导重组的Bm-Bacmid转染BmN细胞,利用绿色荧光信号可迅速判定转染后的BmN细胞中重组病毒粒子产生的情况，将收集后的转染上清对4龄家蚕进行皮下注射，创建可视化跟踪的家蚕生物反应器大规模表达NSl蛋白。
[0007]本发明所要解决的问题是通过以下技术方案来实现的:
[0008]一种可视化跟踪的家蚕生物反应器快速表达NSl蛋白的方法，通过构建携带有
egfp表达盒和nsl基因表达盒的pFastBac1-|Pie1-gg-sv40|-[Ppol-/;s1-sv40 |供体质粒，该供体
质粒转化大肠杆菌DHlOB感受态细胞，供体质粒序列上Tn7R-Tn7L之间的egfp表达盒和nsl基因表达盒可特异性转座到Bm-Bacmid载体上,构建表达egfp和nsl基因的整合型重组真核表达载体，将其转染昆虫细胞后产生的重组芽生型病毒粒子BV皮下注射家蚕，通过可视化的绿色荧光信号实时监测家蚕体内病毒增殖的情况，创建一种新颖的利用家蚕生物反应器大规模地表达NSl蛋白的方法，为进一步揭示NSl蛋白的功能与结构研究提供基础。
[0009]所述egfp基因表达盒与nsl基因表达盒是串联排列的。
[0010]所述的
【权利要求】
1.一种可视化跟踪的家蚕生物反应器快速表达NSl蛋白的方法，其特征在于，构建携带有egfp表达盒和nsl基因表达盒的
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的
【文档编号】C12N15/66GK103436557SQ201310299415
【公开日】2013年12月11日 申请日期:2013年7月17日 优先权日:2013年7月17日
【发明者】李国辉, 王鹏, 唐琦, 胡朝阳, 姚勤, 陈克平, 李芒芒, 徐五 申请人:江苏大学