一种重组脂氧合酶及其制备方法
【专利摘要】本发明涉及一种重组脂氧合酶PhLOX及其制备方法，该PhLOX同时具有脂氧合酶、氢过氧化物裂解酶、丙二烯氧化物合成酶活性。制备过程中，从坛紫菜中提取总RNA，根据脂氧合酶基因序列设计引物，通过RACE技术扩增出全长cDNA序列，重组到表达载体pET-28a，转化大肠杆菌E.coli BL21，筛选出阳性克隆，通过诱导表达产生表达量为2mg/L菌液的多功能脂氧合酶。与现有技术中的脂氧合酶相比，该重组脂氧合酶具有多种酶功能，没有严格的底物专一性，可形成多种结构的下游产物。
【专利说明】一种重组脂氧合酶及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程【技术领域】，尤其涉及一种重组脂氧合酶及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 脂氧合酶（LOX)是含有非血红素离子的双加氧酶，广泛存在于需氧生物中，包括植 物、动物和低等水生生物中，可催化含（Z，Z) -1，4戊二烯结构单元的不饱和脂肪酸的加氧 反应，产生不饱和脂肪酸的过氧化物，参与植物的萌发、生长、发育、衰老、植物抗病和抗伤 害等多种生理功能，以及动物中涉及炎症反应。
[0003] LOX的产物--氢过氧化脂肪酸在其他酶的作用下最终生成茉莉酸、白三烯以及 短链芳香性化合物，其中的短链芳香性化合物广泛应用于食品、日化以及医药工业等，如氢 过氧化物裂解酶（HPL)催化产生的多种天然短链香料物质会散发出青草香、草药香、花香、 菌菇香、肉香、木香等多种自然的香味，广泛添加于食品、日用化妆品、医药辅料等，由于天 然的香料不具有毒物质，因此比化学合成的香料更受欢迎，当然价格也更高。
[0004] 现有技术中脂氧合酶均为单功能酶，只催化脂肪酸的氢过氧化反应，而要形成短 链香料，必须要有HPL对其产物继续分解产生，而两种酶体系的反应条件复杂，较难控制， 不适合大规模生产，且一般酶法合成短链类香料所用的反应酶均为从植物中提取的粗酶 液，如中国专利CN1563310A、CN101225406A，该种粗酶液中酶种类多、酶活不稳定，导致产物 不稳定，不适合生产化。
【发明内容】
[0005] 本发明所要解决的第一个技术问题是提供含有所述的PhLOX的cDNA序列的表达 载体和利用该表达载体转化的重组微生物。
[0006] 本发明所要解决的第二个技术问题是提供所述的重组微生物制备PhLOX的过程。
[0007] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：
[0008] -种脂氧合酶PhLOX的cDNA序列，它的核苷酸序列如SEQID NO. 1所述，为获得重 组脂氧合酶PhLOX的cDNA序列，提取一种红藻门坛紫菜叶状体的总RNA，设计特异性引物克 隆该坛紫菜脂氧合酶核心片段，然后以该脂氧合酶核心片段为模板，设计用于3'端和5'端 延伸的特异性引物，进行RACE扩增得到完整的开放阅读框，获得扩增产物，将扩增序列与 GeneBank数据库系列进行相似性搜索，发现其非血红素铁活性区域的氨基酸序列与其它动 植物的保守性高，可以确定该序列是脂氧合酶类基因全长cDNA，碱基序列总长为3288bp， 包含一个完整的编码框。
[0009] 所述的PhLOX核苷酸序列和推断的氨基酸序列表明PhLOX cDNA与现有的脂氧合 酶相比，是新的一种LOX，PhLOX的氨基酸序列如SEQID NO. 2所述，具有898个氨基酸序列， 蛋白大小约为98. 7KDa。通过多重序列比对分析发现，其在非血红素铁活性区域的氨基酸序 列与其他动植物的保守性高。
[0010] 在表达载体中插入这样克隆的新的PhLOX cDNA序列，并且导入宿主细胞如大肠杆 菌中表达重组PhLOX，作为优选，表达载体为L0X-28a，宿主细胞为E. coli BL21。
[0011] 与现有技术相比，本发明的优点在于：本发明从较低等的真核生物-红藻门坛紫 菜中提取脂氧合酶基因，与高等真核生物中的脂氧合酶基因相比，该脂氧合酶基因进化度 低，未出现功能分化，使得该基因编码的脂氧合酶可以一酶执行多酶功能，且没有严格的底 物专一性，可以形成多种结构的下游产物；利用基因克隆的方法制得的重组脂氧合酶，酶纯 度高，酶活稳定，适合工业化生产。
【专利附图】
【附图说明】
[0012] 图1为RACE产物的SDS-PAGE反应结果示意图；
[0013] 图2为目的蛋白PhLOX催化游离不饱和脂肪酸的LC示意图；
[0014] 图3为目的蛋白PhLOX催化游离不饱和脂肪酸的利用率示意图；
[0015] 图4为PhLOX催化亚麻酸反应过程示意图。
【具体实施方式】
[0016] 以下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[0017] 本发明选取坛紫菜叶状体的DNA和总cDNA为模板，克隆脂氧合酶全基因，并选取 大肠杆菌E. coli BL21为表达系统，实现了对PhLOX的表达，并通过多不饱和脂肪酸的酶解 分析，确定其多功能的特征。
[0018] 实施例I :PhL0X全长cDNA序列的克隆
[0019] 以CTAB法（十六烷基三甲基溴化铵法）提取坛紫菜叶状体的基因组DNA，步骤如 下：
[0020] I) 65°C水浴预热2%CTAB抽提液后，分装15mL抽提液到50mL离心管中，加入0. 1% 的疏基乙醇，混勻待用；
[0021] 2)取500mg叶状体，于无菌研钵中液氮快速研磨至粉末，后立即转入CTAB抽提液 中；
[0022] 3)震荡均匀后65°C水浴加热60min，期间每IOmin反复颠倒离心管数次；
[0023] 4)放入离心机离心，离心条件为：4°C，8000rpm，lOmin，离心结束后吸上清；
[0024] 5)在上述上清液中加入等体积酚/氯仿/异戊醇混合液（比例为：25/24/1)，颠倒 数次，于 4°C，IOOOOrpm 离心 IOmin ;
[0025] 6)吸上清至新离心管中，重复5)抽提一次；
[0026] 7)吸上清，加2/3体积异丙醇，轻颠倒混匀，_20°C放置3h沉淀DNA ;
[0027] 8) 4°C，lOOOOrpm，离心 lOmin，弃上清；
[0028] 9) 2mL75%酒精漂洗沉淀2次，然后于4°C，lOOOOrpm，离心10min，弃上清；
[0029] 10)在超净工作台上倒置离心管，至沉淀周围水分晾干,用500 μ L无菌水溶解 DNA，_20°C保存待用。
[0030] 采用Takara RNAiso Plus kit(Takara，日本)，以trizol法提取坛紫菜叶状体的 总 RNA。采用 Takara primescript RT reagent kit (Takara，日本)，对提取的坛紫菜叶状 体总RNA进行反转录得到坛紫菜叶状体总cDNA。
[0031] 在NCBI中搜索藻类脂氧合酶LOXs序列信息，采用Primer primer5软件设计可行 性引物，进行坛紫菜脂氧合酶核心片段的克隆，其中特异性引物序列为LOX-S1-5' CTCACCCG CAAGGGAGATGG3' L0X-A1-5' TGGTAGGCCGCCGAGAAGAC3'，扩增 353bp 片段。分别以坛紫菜叶状 体的基因组DNA和总cDNA为模板进行PCR扩增，PCR程序见表1。
[0032] 表IPhLOX核心片段克隆的PCR程序
【权利要求】
1. 一种重组脂氧合酶PhLOX的cDNA，它的核苷酸序列如SEQID NO. 1所述。
2. -种重组脂氧合酶PhLOX，它的氨基酸序列如SEQID NO. 2所述。
3. 包括权利要求1的cDNA序列的表达载体。
4. 包括权利要求1的cDNA序列的表达载体L0X-28a。
5. 制备如权利要求1所述的重组脂氧合酶PhLOX的方法，包括用权利要求3所述的表 达载体转化宿主细胞，培养转化体，获得PhLOX。
6. 根据权利要求5所述的方法，其中宿主细胞是大肠杆菌。
7. 根据权利要求6所述的方法，其中宿主细胞是E. coli BL21。
【文档编号】C12N9/02GK104293805SQ201310299353
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2013年7月16日 优先权日:2013年7月16日
【发明者】陈海敏, 朱竹君, 陈娟娟, 严小军 申请人:宁波大学