专利名称：一种检测脂质过氧化物的方法
技术领域：
本发明涉及一种检测脂质过氧化物的方法。
背景技术：
氧自由基是人体白细胞用来抵御外来入侵的有力工具，但在某些状态下，它也可以导致人体的病理性改变，包括动脉粥样硬化、肺纤维化、肾小球硬化、肝硬化、衰老等。这些病理改变往往是由于体内过量的自由基导致脂质过氧化物在体内聚集所致。最常见的脂质过氧化物有氧化型低密度脂蛋白(oxLDL)和丙二醛氧化型低密度脂蛋白(MDA-LDL)。这些过氧化脂蛋白的形成可导致1)低密度脂蛋白出现自体抗原性；2)对正常低密度脂蛋白(LDL)受体的亲和力降低或消失；3)过多的脂质过氧化物被细胞摄取，而形成泡沫样细胞；4)刺激细胞增值。这些改变的最终结果表现为动脉粥样硬化、肺纤维化、肝硬化等。目前，已有许多临床研究报道证实oxLDL和MDA-LDL在冠心病人血液中的浓度明显高于正常人，同时在个别肾病病人、肝脏疾患、长期大量饮酒者血液中的浓度也高于正常人。部分结缔组织系统疾病患者，如系统性红斑狼疮患者血液中的浓度也有升高。血液脂质过氧化物的测定既有助于疾病的诊断，也是人群健康控制的一种良好检测手段。
酶联免疫法和免疫纸层析法是目前用于样品中oxLDL和MDA-LDL浓度的检测方法。一般采用双抗体夹心法，即选用不同的单克隆抗体，对样品抗原进行夹心测定，所用的抗体均为过氧化结构特异性的，即检测oxLDL水平，用抗oxLDL抗体，配对抗oxLDL抗体，检测MDA-LDL水平用抗MDA-LDL抗体配对抗MDA-LDL抗体。这些方法需要选配两个同时对抗脂质过氧化位点，但具有不同的抗原决定簇的抗体，工作量很大，比较复杂，并带有很大程度的偶然性，影响了血液脂质过氧化物水平检测的临床应用。
发明创造内容本发明的目的是提供一种具有较高稳定性、灵敏度及特异性的检测脂质过氧化物的方法。
检测脂质过氧化物的方法，是利用抗脂质过氧化物和抗非过氧化脂质的单克隆或多克隆抗体配对进行样品中脂质过氧化物oxLDL和MDA-LDL的测定。
利用本发明的方法检测脂质过氧化物既可以基于酶联免疫法的原理，又可以基于免疫纸层析法的原理。
在酶联免疫法的测定中包括以下步骤
1)用抗人oxLDL或抗人MDA-LDL或抗人LDL的单克隆或多克隆抗体包板；2)加入待测样品；3)加入相应的第二抗体，当采用抗人oxLDL或抗人MDA-LDL单克隆或多克隆抗体包板时，加入的第二抗体为抗人LDL单克隆或多克隆抗体；当采用抗人LDL单克隆或多克隆抗体包板时，加入的第二抗体为抗人oxLDL或MDA-LDL单克隆或多克隆抗体；4)加入与第二抗体对应的酶标抗体进行反应；5)加入底物进行反应；6)确定样品中oxLDL或MDA-LDL的水平。
所述与第二抗体对应的酶标抗体是以制造第二抗体的动物的IgG为抗原得到的抗体。
所述酶标抗体的标记物优选为辣根过氧化物酶；所述底物优选为过氧化氢。
优选用酶免测定仪读取450nm波长处吸光率来确定样品中oxLDL或MDA-LDL的水平。
以酶联免疫法为基础的测定样品中脂质过氧化物oxLDL和MDA-LDL含量的具体步骤为1)包被；2)洗板；3)封闭；4)洗板；5)加样；6)洗板；7)加入第二抗体；8)洗板；9)加入酶标抗体；10)洗板；11)加入底物；12)加入终止液；13)用酶免测定仪读取450nm波长处吸光率。
在免疫纸层析法的测定中包括以下步骤1)标记抗人oxLDL和抗人MDA-LDL或标记抗人LDL的单克隆或多克隆抗体，作为显色抗体；2)用对应的非标记抗人oxLDL和抗人MDA-LDL或非标记抗人LDL的单克隆或多克隆抗体包被检测膜，作为捕获抗体；当采用标记抗人oxLDL和抗人MDA-LDL作为显色抗体时，捕获抗体为非标记抗人LDL抗体，当采用非标记抗人LDL作为显色抗体时，捕获抗体为标记抗人oxLDL和抗人MDA-LDL抗体；3)组装检测试纸条4)向显色抗体中加入待测样品，使样品中的抗原oxLDL和抗人MDA-LDL分别与标记的抗人oxLDL和抗人MDA-LDL抗体结合或样品中的抗原LDL与标记的抗人LDL抗体结合并向捕获抗体泳动；5)确定样品中oxLDL或MDA-LDL的水平。
其中，结合有抗原的显色抗体与捕获抗体结合而显色，其显色强度与结合量相关。通过显色反应确定样品中oxLDL或MDA-LDL的水平。
一般采用胶体金属显色法进行所述显色抗体标记，其中优选的为胶体金法。
所述显色反应确定可采用目测法，即为定性法，或显色密度检测法来确定样品中oxLDL或MDA-LDL的水平，也可以用色卡等来确定样品中oxLDL或MDA-LDL的水平。
显色反应确定可采用目测法，即为定性法，或显色密度检测法来确定样品中oxLDL或MDA-LDL的水平，也可以用色卡等来确定样品中oxLDL或MDA-LDL的水平。
本发明中的抗人oxLDL、抗人MDA-LDL及抗人LDL的单克隆或多克隆抗体均可以按照常规生物学及生物工程学方法制得。
本发明巧妙地利用抗脂质过氧化物和抗非过氧化脂质的单克隆或多克隆抗体配对进行样品中脂质过氧化物oxLDL和MDA-LDL的测定，实现了利用只有一个抗脂质过氧化位点的单克隆或多克隆抗体配以一抗LDL的单克隆或多克隆抗体，就可夹心测定样品中脂质过氧化物oxLDL和MDA-LDL的水平，提高了对血液和脂质样品中过氧化物检测的可行性，并大大降低了该检测中的配对抗体筛选的复杂性，具有重要的实际应用意义。
图1为酶联免疫检测法不同样品吸收光度的直方图。
具体实施例方式
实施例1、用脂质过氧化物包板的酶联免疫检测方法检测样品中的脂质过氧化物一、实验材料1、样品制备MDA-LDL的制备取0.2ml 12M HCl，加入0.165ml四甲氧基丙烷，混合，室温静置30分钟，然后加入4.8ml 0.1M磷酸钠缓冲液(pH6.4)(用10M NaOH调pH)，再与等体积2mg/ml LDL(SIGMA)水溶液混合，37℃水浴2小时。
用0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.4)透析过夜(4℃)，终止反应，离心，-20℃保存。
oxLDL的制备分别配制1mg/ml LDL(SIGMA)和10mg/ml硫酸铜溶液，按1∶1体积混合，37℃水浴通氧气反应24小时，用0.1M磷酸钠缓冲液(pH7.4)透析过夜(4℃)，终止反应，离心，-20℃保存。
2、酶联反应板96孔板；3、试剂配制试剂来源兔抗人oxLDL多克隆抗体，羊抗人MDA-LDL多克隆抗体，购自美国Biodesign公司。辣根过氧化物酶(HRP)标记羊抗兔和兔抗羊IgG多克隆抗体购自北京中山生物技术公司，其它试剂均购自北京化学试剂总公司。
抗人非过氧化低密度脂蛋白单克隆抗体的制备过程是采用非过氧化低密度脂蛋白免疫Balb/c小鼠，收集免疫Balb/c小鼠脾细胞，与瘤细胞融合，经筛选和3-5次亚克隆化而获得抗人非过氧化低密度脂蛋白单克隆抗体细胞株，在将该细胞株接种于小鼠腹腔内，使其产生腹水，收集腹水，经蛋白A法纯化而得。
包被缓冲液50mM碳酸盐缓冲液，pH9.6；洗涤缓冲液10mM PBS，0.05％Twecn20，pH7.4；底物缓冲液24.3mM柠檬酸，51.4mM磷酸氢二钠，0.015％双氧水邻苯二胺1mg/ml；封闭缓冲液1×磷酸盐缓冲液，1％牛血清白蛋白，pH7.4；稀释缓冲液1×磷酸盐缓冲液，0.25％牛血清白蛋白，0.05％Tween，-20℃，pH7.4；终止液2M H2S04；二、操作方法1、包被取兔抗人oxLDL或MDA-LDL多克隆抗体，用稀释缓冲液配制4ug/ml液体，按100ul/孔加入反应板，37℃包被2小时。
2、洗板用洗涤缓冲液按100ul/孔洗涤三次；3、封闭用封闭缓冲液按100ul/孔，室温封闭2小时；4、洗板用洗涤缓冲液按100ul/孔洗涤三次；5、加样将MDA-LDL、oxLDL及LDL样品用稀释液稀释至1ug/ml，然后每孔加入100ul，37℃反应2小时；6、洗板用洗涤缓冲液按100ul/孔洗涤三次；7、加入第二抗体用稀释缓冲液对鼠抗人非过氧化低密度脂蛋白单克隆抗体进行1∶1000倍稀释，每孔加入100ul，37℃反应2小时；8、洗板用洗涤缓冲液按100ul/孔洗涤三次；9、检测用稀释缓冲液对HRP标记羊抗鼠IgG多克隆抗体进行1∶3000稀释，每孔加入100ul，37℃反应1小时；10、洗板用洗涤缓冲液按100ul/孔洗涤三次；11、底物加入底物缓冲液200ul/孔，室温放置15-20分钟；12、加入终止液50ul/孔；
13、用酶免测定仪读取450nm波长处吸光率。
三、结果如图1所示，MDA-LDL与oxLDL的反应明显比LDL强，表明用本发明的方法检测脂质过氧化物具有较高的稳定性和灵敏度。
实施例2、用标记非过氧化脂质的免疫纸层析法检测样品中的脂质过氧化物1、样品制备oxLDL和MDA-LDL样品制备同实施例1。
2、试剂配制试剂来源同实施例1，胶体金溶液的制备采用如下方法，取500ml 0.01％氯金酸(HAUCl4)溶液，在1000ml烧杯中加热至沸腾，加入3.5ml 1％柠檬酸三钠溶液，继续沸腾15分钟，溶液的颜色由无色变为蓝色，再变为紫红色，待冷却至室温后，分光光度计比色为OD536＝1.153、鼠抗人LDL单克隆抗体胶体金标记取胶体金溶液100ml，调pH至8.4，加入抗体10mg/ml，室温搅拌30分钟，再缓慢加入至10％终浓度，室温搅拌30分钟。12000g离心10分钟，弃去上清液，沉淀用含10％BSA的50mM磷酸缓冲液混悬，再离心一次，沉淀用同样液体混悬。
4、纸层析检测条制备在涂有不干胶的PVC板上，顺序粘贴多聚酯纤维素膜，硝酸纤维素检测膜，吸水滤纸，然后向多聚酯纤维素膜印制含有20％蔗糖的胶体金标记抗体，向硝酸纤维素检测膜印制兔抗人oxLDL或MDA-LDL多克隆抗体，同时印制羊抗鼠IgG多克隆抗体作为质控线，37℃干燥6小时。然后在切条机上切成3.5mg宽的试纸检测条，干燥箱保存备用。
5、待测样品中oxLDL或MDA-LDL浓度测定用正常血清配制的浓度为1ug/ml oxLDL或MDA-LDL溶液和正常血清，分别向不同的试纸条点样，15分钟后观察并记录检测膜上检测线的显色反应。
6、检测结果oxLDL或MDA-LDL溶液呈明显的显色反应，正常血清则未见显色(见表1)。
表1、标记非过氧化脂质的免疫纸层析法检测结果测试条 样品 浓度(ug/ml) 检测片显色强度oxLDL oxLDL 0 -oxLDL 1.0+++LDL1.0-MDA-LDLMDA-LDL0 -MDA-LDL1.0+++LDL1.0-
权利要求
1.检测脂质过氧化物的方法，是利用抗脂质过氧化物和抗非过氧化脂质的单克隆或多克隆抗体配对进行样品中脂质过氧化物oxLDL和MDA-LDL的测定。
2.根据权利要求1所述的检测脂质过氧化物的方法，其特征在于在酶联免疫法的测定中包括以下步骤1)用抗人oxLDL或抗人MDA-LDL或抗人LDL的单克隆或多克隆抗体包板；2)加入待测样品；3)加入相应的第二抗体，当采用抗人oxLDL或抗人MDA-LDL单克隆或多克隆抗体包板时，加入的第二抗体为抗人LDL单克隆或多克隆抗体；当采用抗人LDL单克隆或多克隆抗体包板时，加入的第二抗体为抗人oxLDL或MDA-LDL单克隆或多克隆抗体；4)加入与第二抗体对应的酶标抗体进行反应；5)加入底物进行反应；6)确定样品中oxLDL或MDA-LDL的水平。
3.根据权利要求2所述的检测脂质过氧化物的方法，其特征在于所述与第二抗体对应的酶标抗体是以制造第二抗体的动物的IgG为抗原得到的抗体。
4.根据权利要求2所述的检测脂质过氧化物的方法，其特征在于所述酶标抗体的标记物为辣根过氧化物酶；所述底物为过氧化氢。
5.根据权利要求2或3或4所述的检测脂质过氧化物的方法，其特征在于所述方法的步骤为1)包被；2)洗板；3)封闭；4)洗板；5)加样；6)洗板；7)加入第二抗体；8)洗板；9)加入酶标抗体；10)洗板；11)加入底物；12)加入终止液；13)用酶免测定仪读取450nm波长处吸光率。
6.根据权利要求1所述的检测脂质过氧化物的方法，其特征在于在免疫纸层析法的测定中包括以下步骤1)标记抗人oxLDL和抗人MDA-LDL或标记抗人LDL的单克隆或多克隆抗体，作为显色抗体；2)用对应的非标记抗人oxLDL和抗人MDA-LDL或非标记抗人LDL的单克隆或多克隆抗体包被检测膜，作为捕获抗体；3)组装检测试纸条；4)向显色抗体中加入待测样品；5)确定样品中oxLDL或MDA-LDL的水平。
7.根据权利要求6所述的检测脂质过氧化物的方法，其特征在于用胶体金属显色法进行所述显色抗体标记。
8.根据权利要求7所述的检测脂质过氧化物的方法，其特征在于所述胶体金属显色法为胶体金法。
全文摘要
本发明公开了一种检测脂质过氧化物的方法，目的是提供一种具有较高稳定性、灵敏度及特异性的检测脂质过氧化物的方法。本发明检测脂质过氧化物的方法，是利用抗脂质过氧化物和抗非过氧化脂质的单克隆或多克隆抗体配对进行样品中脂质过氧化物oxLDL和MDA－LDL的测定。利用本发明的方法检测脂质过氧化物既可以基于酶联免疫法的原理，又可以基于免疫纸层析法的原理。本发明的方法提高了对血液和脂质样品中过氧化物检测的可行性，并大大降低了该检测中的配对抗体筛选的复杂性，具有重要的实际应用意义。
文档编号G01N33/53GK1523355SQ0310466
公开日2004年8月25日 申请日期2003年2月20日 优先权日2003年2月20日
发明者刘凤鸣 申请人:刘凤鸣