脂解酶在粘性物控制中的应用的制作方法

专利名称：脂解酶在粘性物控制中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及某些脂解酶在由回用纸(recycled paper)制造纸和纸制品中的应用。通过利用这些酶，减少了与来源于废纸的所谓粘性物(stick)有关的问题。
背景技术：
在整个工业领域(造纸，纺织等等)中，包含醋酸乙烯酯的聚合物最常用作粘合剂和涂料。然而，由于它们具有粘结性能(adhesive property)，所以这些聚合物经常在随后的处理阶段产生问题。
例如，在造纸工业中，包含醋酸乙烯酯的聚合物被用作粘合剂和涂料。在再循环期间，这些聚合物往往会与纤维和其它物质聚集在一起，形成所谓的“粘性物”，后者降低了纸制品的质量并明显增加停机时间。
WO 00/34450，WO 01/92502和US5,176,796报道了某些脂肪酶和角质蛋白酶(cutinases)在造纸中的应用，即用于树脂(pitch)控制的应用。根据上述美国专利，树脂是木材的天然组成，并且其主要组分是三酸甘油酯。
WO 01/98579披露了在纸张再循环期间脂肪酶和/或酯酶在控制粘性物所产生的问题中的应用。在其中的实施例1-3中，为进行对比，包括了商品名为RESINASE A2X和NOVOCORADL的脂肪酶。
发明概述本发明涉及一类脂解酶在由再生纸张造纸中的应用，以及利用该类脂解酶的造纸方法。该类脂解酶通过参考针对包含醋酸乙烯酯的聚合物水解活性的某些测试而确定。
发明详述粘性物根据the Thesaurus of Pulp and Paper Terminology，1991(由Institute ofPaper Science and Technology编辑，Atlanta，US)，将术语粘性物称为在后处理期间粘附纸机部件的具有粘合剂特征(adhesive character)的废纸杂质。作为上述杂质的实例，可以提及的有油墨、焦油和胶乳。
另外的粘性物实例是纤维、粘合剂、涂料、粘结剂和其它材料的粘性(tacky)聚集物，它们在循环造纸过程中形成。因此，粘性物主要关系到利用再生纸张的造纸过程。
粘性物是水不溶性的并且往往引起聚集并沉积至造纸设备的各种部件上，由此造成纸张质量问题，使纸幅断裂，并且为了清洗设备而采取昂贵的停工期。例如，粘性物可沉积至成纸毛毯(paper forming felt)上，由此使得从形成纸幅的排水不太有效，这又可能造成上述的问题。
粘性物可用不同的方式区分，例如通过大小或通过比重来区分原始粘性物很小，所以通常不会造成任何问题，而次级粘性物或宏观粘性物较大，并且往往会发生沉积。宏观粘性物通常具有留在细筛上的尺寸。细筛的实例是具有约50-200，60-190，或70-180，或80-170，或80-160，或约80-150微米狭长筛孔的那些。
在一定条件下，通过各种型式的机械设备可以除去高密度和密度低的粘性物，但是，特别是在所谓中等范围密度粘性物的情况下，即比重约0.9-1.1，或约0.95-1.05，或约0.98-1.02的粘性物，仍然存在这样的问题。
来自世界各地的粘性物的化学组成可能不同，这主要取决于本地造纸方法的特性。出于相同的理由，粘性物的组成在不同工厂之间也可能不同。
下列组分是所述组分的实例，其中一种或多种组分通常在欧洲粘性物中发现丙烯酸树脂、聚醋酸乙烯酯(PVAc)、苯乙烯丁二烯树脂(SBR)、聚乙烯(PE)和聚丙烯(PP)。
在本发明中，关注的是包含醋酸乙烯酯的聚合物，这些粘性物是上述聚合物的一个实例。包含醋酸乙烯酯单体的聚合物可以是包含醋酸乙烯酯单体的聚醋酸乙烯酯均聚物(PVAc)，或者它可以是包含醋酸乙烯酯及其他单体如乙烯、丙烯酸甲酯、月桂酸乙烯酯和叔-癸酸、乙烯基酯的共聚物。各种各样聚合物的掺混物和混合物也包括在本发明中使用的定义“包含醋酸乙烯酯的聚合物”中，其中至少一种聚合物包含醋酸乙烯酯单体。这也适用于其与其它聚合物的混合物，而且还适用于其与其它化合物的混合物。
业已开发出了各种控制粘性物的方法，如控制进入回用纸张的质量，各种机械筛选和离心法，以及利用各种化学剂的分散法。另外，还建议使用酶(例如参见上述的WO01/98579)。
然而，仍然存在着严重的问题，根据本发明，通过利用某些脂解酶减少了上述问题，本发明的脂解酶优越于为此目的的前述的酶。
脂解酶在本发明中，术语“脂解”酶指的是具有统一的和特征化特征的一类酶，它们能够水解包含醋酸乙烯酯单体的聚合物。
为确定所给出的酶是否落入本发明脂解酶的范围内，可利用下列测试的任一种(a)在45℃于分散的PVAc底物(substrate)上18小时之后，通过毛细管电泳确定水解度，其中分散的PVAc底物通过将1.5毫升于甲醇中6％的PVAc注入40毫升缓冲剂pH 6或8中而制得并且其中PVAc的分子量约为12800；或(b)在均包含醋酸乙烯酯单体的如下三种聚合物制剂的至少之一上确定所述酶的水解活性(i)PVAc均聚物制剂，(ii)醋酸乙烯酯乙烯共聚物制剂，或(iii)醋酸乙烯酯叔癸酸(tert-decanoic acid)乙烯基酯(ethenyl ester)共聚物制剂。在一种、两种或所有三种底物上的水解活性表明该酶为本发明中定义的“脂解”酶。
对于上述测试(a)如果根据本发明中实施例8所确定的水解度至少为0.1，则所述酶(enzyme in question)定量为用于根据本发明的脂解酶。约12800的PVAc分子量指的是通过凝胶渗透色谱法(GPC)测量的平均分子量。关于这一点，“约12800”意味着在10000和20000之间的平均分子量。缓冲剂pH 6或8的可以是pH 6或pH 8。合适缓冲剂的实例是5mM的Hepes缓冲剂(pH8)，和5mM的MES(pH6)。在特定的实施方案中，水解度至少为0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9或至少2.0。
令人惊奇的是，为了减少粘性物的粘性，似乎需要相对小的水解度。在特定的实施方案中，水解度在10％以下，或9％以下，或8％以下，或7％以下，或6％以下，或5％以下，或4％以下。在另外特定的实施方案中，水解度在可由上述上限和下限值得出的任何范围内。
对于根据上述(b)的测试，使聚合物底物乳化，并根据所述酶的特性，对反应条件如pH、温度和温育(incubation)时间进行选择。
反应温度的实例是10，20，30，35，37，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95或100℃。
反应pH值的实例是pH 2，3，4，5，6，7，8，9，10，11或pH 12。
反应时间的实例是30秒，1分钟，2，3，4，5，10，20，30，60，90，120或180分钟。
在第一特定实施方案中，在由50mM的NaCl、0.5mM的KH2PO4、9％(v/v)甘油和0.1％(w/v)阿拉伯胶(Gum Arabicum)组成的乳液中，将5％(w/v)聚醋酸乙烯酯(PVAc)均聚物制剂作为底物，在35℃，pH 8进行4分钟时，酶可以具有(优选具有)水解活性。在一特定的实施方案中，聚醋酸乙烯酯均聚物制剂(也称为PVAc均聚物)是干物质含量(dry matter content)在46至50％范围内，粘度在5800至7200mPas范围内(Brookfield，20℃)的均聚PVAc分散体胶液(dispersion glue)。优选的底物得自GLUDAN A/S公司(Vesterlundvej 5-7，DK-2730Herlev，Denmark)的产品GLUDANTM150-6.500(在本发明实施例1中使用)。在该第一实施方案中，水解活性可称为“PVAc水解活性”。
在第二特定实施方案中，在由50mM的NaCl、0.5mM的KH2PO4、9％(v/v)甘油和0.1％(w/v)阿拉伯胶组成的乳液中，将5％(w/v)醋酸乙烯酯乙烯共聚物制剂作为底物，在35℃、pH 7进行4分钟，酶具有水解活性。在一特定的实施方案中，醋酸乙烯酯乙烯共聚物是总固含量在56至60％范围内，粘度在6000至7000mPas范围内(Brookfield，20℃)的PVAc乙烯共聚物分散体胶液。优选的底物得自GLUDAN A/S公司(Vesterlundvej 5-7，DK-2730Herlev，Denmark)的产品GLUDANTM534-6.500(在本发明实施例2中使用)。
在第三特定实施方案中，在由50mM的NaCl、0.5mM的KH2PO4、9％(v/v)甘油和0.1％(w/v)阿拉伯胶组成的乳液中，将5％(w/v)醋酸乙烯酯叔癸酸乙烯基酯共聚物制剂作为底物，在35℃、pH 7进行4分钟，酶具有水解活性。在该特定的实施方案中，醋酸乙烯酯叔癸酸乙烯基酯共聚物制剂是总固含量在55±1％范围内，粘度在1000至4000cP范围内(Brookfield，20℃)的醋酸乙烯酯-Veova共聚物分散体胶液。优选的底物是得自CHE MARKApS公司(Noerregade 10A，2.t.v.，DK-4600 Koege，Denmark)的产品NOREMULTMVW 1501(实施例3中使用)。为了确定粘度，合适的粘度计是Brookfield LVF型。转速为60rpm，可以使用3号锭子。
在这些条件下，通过将溶解在相当于A280＝0.15的去离子水中的、200微升脂解酶添加至15毫升底物乳液中而确定脂解酶的水解活性(例如PVAc的水解活性)，并且将一单位的水解活性(例如PVAc水解活性)定义为通过pH-stat测量的1微摩尔乙酸酯(acetate)的释放。一般地，A280＝0.15相当于约0.10-0.40毫克酶蛋白/毫升，这取决于所述酶的消光系数。对于大多数用于实施例的酶，A280＝0.15可能相当于约0.20-0.30毫克酶蛋白/毫升，例如0.25毫克酶蛋白/毫升。在特定的实施方案中，试验中使用的酶蛋白量(即包含在添加至15毫升底物乳液中的200微升中的)约为40-60，或约为45-55，或约50微克酶蛋白。
在特定的实施方案中，脂解酶可以具有(优选具有)大于0.2单位、特别是0.4单位，更特别是0.6单位的PVAc水解活性。
在另一特定的实施方案中，每毫升A280为0.15的脂解酶溶液，脂解酶的PVAc水解活性至少为0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2.0，2.2，2.4，2.6，2.8，3.0，3.2，3.4，3.6，3.8，4.0，4.5，5.0，5.5，6.0，6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，9.5，10.0，10.5，11.0，11.5，12.0，12.5，13.0，或至少13.5单位。
在另一特定的实施方案中，每毫升A280为0.15的脂解酶溶液，脂解酶对醋酸乙烯酯乙烯共聚物底物的水解活性至少为0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，或至少1.2单位。
在另一特定的实施方案中，每毫升A280为0.15的脂解酶溶液，脂解酶对醋酸乙烯酯叔癸酸乙烯基酯共聚物底物的水解活性至少为0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0，1.1，1.2，1.3，1.4，1.5，1.6，1.7，1.8，1.9，2.0或至少2.1单位。
在各种各样其它的实施方案中，脂解酶(iv)在LAS存在下是活性的(“活性的”指的是，在试验(i)-(iii)的任一个中，通过将50或200ppmLAS添加至反应中，当与不添加LAS的对照试验中的活性相比时，活性(以单位/毫升测量)至少为50％；在另外特定的实施方案中，当与对照物相比时，活性至少为55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，105，110，120或至少130％；
(v)在LAS存在下是稳定的(“稳定的”指的是，利用试验(i)-(iii)的任一个，在pH6或8，温度45℃，对酶(A280＝0.15)预温育1、2或3小时之后，在50或200ppmLAS(剩余缓冲剂的pH为6或8)中的剩余活性(以单位/毫升测量)，与对照物相比，至少为55，60，65，70，75，80，85，90，95，100，105，110，120或至少为130％)；(v)在35、45或55℃和pH＝8(利用5mM的Hepes缓冲剂)，在PVAc底物上作用20分钟之后，与对照物相比显示出更高的浊度(turbidity)，其中所述底物是通过将0.15毫升2％w/v的PVAc(Mw≈113000)的甲醇溶液注入30毫升缓冲剂(参见表4-6)中而制备；(v)是耐过氧化氢的，即在加或不加15ppm过氧化氢的情况下，获得了基本相同的浊度/酶剂量(enzyme dosage profile)(参见表9)；和/或(vi)是耐LAS的，即利用50和200ppm LAS，45℃，pH 7，20分钟之后，获得了基本相同的浊度(参见表11)。
在特定的实施方案中，脂解酶是定义明确的(well-defined)意味着仅仅存在一种主要的酶组分。在可供选择的实施方案中，术语定义明确意味着仅仅存在一种主要脂解酶组分。上述定义明确的或提纯的或高度提纯的脂解酶，可按照现有技术中已知的手段获得，或根据与所述具体酶有关的出处物所述来获得。在合适尺寸排阻柱上定义明确酶的馏分揭示只有一种为所述脂解酶的主要的酶组分；或在另一可供选择的方案中，揭示了只有一种是所述的脂解酶的主要的脂解酶组分。
就界定主峰的峰而言，该峰的面积应当等于50，或55，或60，或65，或70，或75，或80，或85，或90，或92，或94，或96，或至少98％的总峰面积/总脂解峰面积。
本领域普通技术人员知道怎样选择合适尺寸排阻色谱柱。他可能通过在HiLoad26/60 Superdex75pg柱(得自Amersham Biosciences UK Limited，Amersham Place，Little Chalfont，Buckinghamshire HP7 9NA，UK)上对制剂进行分馏而开始操作。如果峰不能清楚地分离，他将尝试不同的柱(例如，利用改进的柱粒径(particle size)和/或柱长)，和/或他将改进试样的体积。具体内容参见实施例11。
在另外特定的实施方案中，使脂解酶脱盐，即基本上不含低分子量材料如盐。凝胶过滤层析法是合适的脱盐技术。优选的柱填充材料是SephadexG-25，以便保证Mr大于5000和Mr小于1000的蛋白质/肽的组分离。Mr指的是相对分子质量(分子量)，并且单位为道尔顿。合适的柱是例如得自Amersham，装填有Sephadex G-25M的PD-10柱，或NAP5柱。使用供应厂商指定的标准程序，并将脱盐水(MilliQ)用于平衡化和洗脱。
为了确定如上所述的脂解活性，优选使用定义明确的和/或脱盐的脂解酶制剂。优选酶制剂是定义明确的和脱盐的。如在材料和方法部分中所述，为了进行脂解活性测试，首先将酶制剂稀释至A280为0.15。
如上所述脂解酶的实例通常在根据酶命名法分类如EC 3.1.1羧酸酯水解酶的酶中找到(可在http//www.chem.qmw.ac.uk/iubmb/enzyme得到，或者根据酶命名法1992(Academic Press，San Diego，California，以及相应的Supplement 1(1993)，Supplement 2(1994)，Supplement 3(1995)，Supplement 4(1997)和Supplement 5(分别在Eur.J.Biochem.1994，223，1-5；Eur.J.Biochem.1995，232，1-6；Eur.J.Biochem.1996，237，1-5；Eur.J.Biochem.1997，250；1-6，和Eur.J.Biochem.1999，264，610-650中)，它们是能够水解羧酸酯键的酶。该脂解酶可以有具有活性的底物特异性，如EC3.1.1.3三酰基甘油酯酶或EC 3.1.1.74角质蛋白酶。
角质蛋白酶可来源于真菌。特别是，角质蛋白酶可得自腐质菌属菌株(strain of Humicola)，特别是H.insolens，更特别是H.insolens DSM 1800(US5,827,719)，或得自镰刀菌属菌株(strain of Fusarium)，例如F.roseumculmorum，或特别是F.solani pisi(WO 90/09446；WO 94/14964；WO94/03578)。真菌角质蛋白酶也可以得自丝核菌属菌株(strain of Rhizoctonia)，例如茄属丝核菌(R.solani)，或链格孢属菌株(strain of Alternaria)，例如甘蓝链格孢(A.brassicicola)(WO 94/03578)。此外，脂解酶也可以是母体角质蛋白酶的变种，如WO 00/34450或WO01/92502中所述的那些。
SEQ ID NO1是Humicola insolens角质蛋白酶的氨基酸序列(相当于US 5,827,719的SEQ ID NO2的成熟部分)，而SEQ ID NO2是根据WO94/14964

图1D的Fusarium Solani pisi的氨基酸序列。
另一实例是如EC 3.1.1.3分类的脂肪酶。更准确地说，脂肪酶源自假单胞菌属(Pseudomonas)，如恶臭假单胞菌(P.putida)ATCC 53552(WO88/09367；WO 89/09263)，葱头假单胞菌(P.cepacia)(US 4,876,024)，门多茜娜假单胞菌(P.mendocina)(US 5,389,536)，P.alkaligenes(US 6,313,283)，唐菖蒲假单胞菌(P.gladioli)(EP 205 208；EP 206 390)或Pseudomonas sp.(US5,942,431)。此外，脂解酶也可以是母体脂肪酶的变种，如EP 0 943 678、US5,352,594或WO 94/25578中所述的那些。
另外的实例是得自Candida antarctica的脂肪酶B(US 5,273,898)或氨基酸序列与得自Candida antarctica的脂肪酶B(US 5,273,898)至少有60％，特别是65％，更准确地说70％，或75％，或80％，或85％，或90％，或92％，或95％，或97％，或至少99％的同源性的酶，如得自Hyphozyma的脂肪酶(US5,856,163)。该脂肪酶具有SEQ ID NO3。
另外的实例是氨基酸序列与SEQ ID NO1或SEQ ID NO2可具有至少70％的同源性的酶，特别是75％，或80％，90％，92％，95％，97％或至少99％的同源性。
在本发明中，同源性(homology)根据表示由第二序列衍生出的第一序列的两个序列之间的相似度来确定。相似性通过GCG程序包中提供的计算机程序GAP确定(Program Manual for the Wisconsin Package，Version 8，August1994，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wisconsin，USA 53711)(Needleman，S.B.and Wunsch，C.D.，(1970)，Joumal of MolecularBiology，48，443-453，利用具有下列多肽序列比较设定的GAPGAP creationpenalty of 3.0和GAP extension penalty of 0.1)。在特定的实施方案中，同源性利用上述程序和设置的相同性程度来确定，在本发明用途的这种情况下，“同源性”可以用“相同性”替代，而“同源的”可以用“相同的”替代。
造纸方法本发明涉及一种造纸方法，包括a)由包含回用纸张的材料制备纸浆；b)用脂解酶对该纸浆进行处理，所述酶能够水解包含醋酸乙烯酯单体的聚合物；c)由处理过的纸浆制备纸张。
对于本发明的目的，可涉及到任一种造纸方法以及/或者能够使用任一种造纸纸浆，只要其包含回用纸张就可以。在特定的实施方案中，相对于纸浆总量，基于回用纸的纸浆量至少为2％，或至少4％，或至少6％，或至少8％，或至少10％，或至少15，20，25，30，35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90或至少95％。在另外特定的实施方案中，相对于纸浆总量，基于回用纸的纸浆量不多于25％，或不多于30％，或35，40，45，50，55，60，65，70，75，80，85，90，95或不多于98％。在另外特定的实施方案中，相对于纸浆总量，基于回用纸的纸浆量位于可由上述上限和下限组合二得到的任何间隔之内。优选的是，用干重来确定纸浆量。
不由回用纸衍生得到的纸浆部分可以由机械浆、化学浆及其任意混合物如化学-机械浆、热-机械浆、化学-热-机械浆等等衍生得到。
为了由包含回用(或废)纸，也称为二次纤维的材料制备纸浆，将所述材料在水中混合、分散或悬浮。这就是称为制浆的过程。因此，油墨和其它杂质如胶液，粘合剂，涂料等等的至少一部分将从纤维中除去。造纸纸浆常包含回用纸和新鲜的即所谓的原始纸浆。纸浆可具有高(在18％以上)、中等(7-10％)或低(低于7％)的稠度。在特定的实施方案中，本发明的方法和用途是在高、中等、或低纸浆稠度下进行的。
回用纤维的来源可是本领域已知的任何等级的回用配料或其混合物，以及回用纤维与原始纤维的混合物。回用纤维配料的主要等级例如有MOW(混合办公室废纸)，SOW(分类的办公室废纸)，ONP(旧新闻纸)，WM(废杂志)和OCC(旧瓦椤纸箱)。
供本发明的方法和用途使用的脂解酶披露于本发明中标题为“脂解酶”的部分中。
表述“处理纸浆”主要指的是将所述酶添加至纸浆中。处理在合适的条件下进行。处理条件可取决于特定的造纸过程参数或要求，以及取决于所述酶的特性，如pH-活性和pH-稳定性范围，温度活性和温度-稳定性范围，水解速率等等而改变。处理条件的实例描述于标题为“工艺条件”的部分中。在特定的实施方案中，条件为适合于减少粘性物的量和/或适合于获得脱墨作用的条件(见下文)。
由处理过的纸浆进行造纸包括用酶处理的纤维形成纸张或纸板制品。
除步骤a)-c)以外，还可以非强制地包括，例如下列步骤之一或更多个步骤d)脱墨，例如通过在碱性水溶液存在下对纤维进行制浆，其中非强制地包含过氧化物，如过氧化氢；e)例如通过筛选(粗筛和/或细筛)，将纤维与杂质分离；f)离心净化；g)浮选，例如利用一种或更多种表面活性剂；h)洗涤，例如利用一种或更多种表面活性剂；
i)分散，例如利用一种或更多种表面活性剂；和/或j)如果需要的话，例如通过热处理步骤，使酶灭活。
可以包括任何数量的这些附加步骤，并且其顺序不必如a-b-c-d-e-f-g-h-i-j那样。在特定的实施方案中，包括步骤d)和/或j)。在本文中定义的脂解酶也可有利地用于脱墨步骤d)中。
酶可以在制浆之前，制浆阶段期间，备料阶段期间或之前、优选刚好在备料阶段之前，或在浮选或脱墨阶段之后引入。在特定的实施方案中，将酶引入纸机网前箱中，或引入纸机白水中。
所述方法可以是封闭循环方法(至少一部分水回用，例如至少10％，15，20，25，30，40，50，60，70或至少80％的水回用(vol/vol))。
在本发明的方法和用途的另外特定的实施方案中，酶起控制粘性物的作用。控制粘性物指的是，与不用酶处理的对照物相比，粘性物量减少。在优选的实施方案中，与对照物相比，用所述酶处理的试样中粘性物的量最多为95％，或90％，或80％，或75％，或70％，或60％，或50％，或40％，或30％，或最多为20％(w/w)。披露在WO01/98579实施例1-6中的任一种方法均可来进行该测定。
在本发明的方法和用途的其它特定的实施方案中，酶起脱墨作用。酶可用于通过任何印刷方法，例如胶印，照相凹版印刷和凸版印刷进行印刷的脱墨回用纸中。酶的作用是改善所得到的纸张的白度或亮度和/或降低油墨量。这可根据本领域通常已知的方法来测量，例如根据披露于JP专利号96014078中的方法来测量。
存在于原始纸浆中的甘油酯往往会与来自回用纸浆、包含醋酸乙烯酯单体的聚合物聚集成粘性物。因此，在另一实例中，本发明的方法可包括能够使包含醋酸乙烯酯单体的聚合物水解的脂解酶和能够使甘油酯中的酯键水解的脂肪酶，如由EC 3.1.1.3分类的那些。
因此，本发明的方法和用途可以利用酶的组合进行，以便使酶促方法对于更宽范围的杂质都有效，所述杂质如蛋白类杂质、含淀粉杂质、包含三酸甘油酯的杂质以及包含半纤维素和果胶的杂质。因此，根据本发明使用的脂解酶可与至少一种另外的酶组合，所述酶选自蛋白酶、淀粉酶、支链淀粉酶、脂肪酶、半纤维素酶、葡聚糖内切酶、角质蛋白酶和果胶酶。这些酶可以是野生型酶，或具有相关酶活性的其突变体或变异体，所述酶活性即催化在用于相应酶分类的下列网页上指明的至少一种反应http://www.expasy.ch/enzyme/。
合适蛋白酶的实例是ALCALASE，ESPERASE，SAVINASE，NEUTRASE和DURAZYM蛋白酶。其它优选的丝氨酸-蛋白酶是来自Nocardiopsis，曲霉属(Aspergillus)，根霉属(Rhizopus)，嗜碱芽孢肝菌(Bacillusalcalophilus)，蜡状芽孢肝菌(B.cereus)，纳豆芽孢杆菌(B.natto)，B.vulgatus，蕈状芽孢杆菌(B.mycoide)的蛋白酶，以及得自芽孢肝菌属(Bacillus)的枯草杆菌蛋白酶(subtilisins)，特别是得自Nocardiopsis sp.和Nocardiopsisdassonvillei种的蛋白酶，如披露于WO88/03947中的那些，特别是得自Nocardiopsis sp.，NRRL 18262和Nocardiopsis dassonvillei，NRRL 18133的蛋白酶。其它优选的蛋白酶是得自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)突变体的丝氨酸蛋白酶，例如披露于WO91/00345和EP415296中的那些。合适的淀粉酶的实例是BAN，AQUAZYM，TERMAMYL，和AQUAZYM Ultra淀粉酶。脂肪酶的实例是RESINASE A2X脂肪酶。半纤维素酶的实例是PULPZYMEHC半纤维素酶。葡聚糖内切酶的实例是NOVOZYM 613、342和476酶产物。果胶酶的实例是NOVOZYME 863酶产品。支链淀粉酶的实例是PROMOZYM支链淀粉酶。用大写字母的酶是商品酶，可得自NovozymesA/S，Krogshoejvej 36，DK-2880 Bagsvaerd，Denmark。
特别是，本发明的方法可用于存在于纸中和/或纸上存在的包含醋酸乙烯酯单体的聚合物。更准确地说，本发明的方法可用来水解回用纸张的造纸纸浆中的包含醋酸乙烯酯单体的聚合物，从而减少涉及粘性物的问题。另外，本发明还可用来除去标签(label)，如邮件和瓶的标签。在另一实例中，本发明方法可以用于纸张循环期间粘性物的控制。本发明的方法可以在搅拌或机械搅拌下进行。
工艺条件对于造纸方法和在本文中所述的至少一种脂解酶在造纸过程中的应用，所述脂解酶不必是如上所述那样纯。首先，它不必是定义明确的酶制剂。其次，酶制剂可以不是脱盐的酶制剂。
然而，在特定的实施方案中，酶制剂是定义明确的。这主要是因为定义明确的制剂是有利的，例如考虑到结果的一致性和再现性。
工艺条件将随所用酶、反应时间和所给定的条件而改变。通常，酶的剂量在足以控制纸浆中粘性物的量。然而，可以预期的是，酶的总剂量可以是以每克包含醋酸乙烯酯单体的聚合物计为0.1-5000单位，特别是每克包含醋酸乙烯酯单体的聚合物为0.5-1000单位，更特别的是，每克包含醋酸乙烯酯单体的聚合物为1-500单位，其中一个单位指的是如上所述的PVAc水解活性。
在特定的实施方案中，脂解酶的剂量为每吨纸浆从约100-100000单位。在特定的实施方案中，这些单位指的是(i)PVAc水解活性；(ii)对醋酸乙烯酯乙烯共聚物的活性；或(iii)对醋酸乙烯酯叔癸酸乙烯基酯共聚物的活性(利用在此描述的方法)。在优选的实施方案中，该单位指的是(i)PVAc水解活性。有关特定剂量范围的另外的实例(所有范围均为“从约”和“至约”，并且以每吨纸浆为单位200-100,000；400-100,000；600-100,000；800-100,000；1000-100,000；1200-100,000；1500-100,000；2000-100,000；100-90.000；100-80.000；100-70.000；100-60.000；100-50.000；100-40.000；100-30.000；100-20.000；100-10.000；以及在此包括的上限和下限值的任何组合。
在其它特定的实施方案中，脂解酶的剂量为每吨纸浆w约0.1毫克酶蛋白至约100,000毫克酶蛋白。酶蛋白可以根据本发明实施例11所述来确定。特定剂量范围的另外实例如下(所有范围均为“从约”和“至约”，并以每吨纸浆为单位)0.5-100,000；1-100,000；5-100,000；10-100,000；20-100,000；40-100,000；60-100,000；80100,000；100-100,000；150-100,000；200-100,000；500-100,000；0.1-90,000；0.1-80,000；0.1-70,000；0.1-60,000；0.1-50,000；0.1-40,000；0.1-30,000；0.1-20,000；0.1-10,000；0.1-8,000；0.1-6,000；0.1-4,000；0.1-2,000；0.1-1,000；以及在此所包括的上限和下限的任何组合。
酶促处理可以在约10℃至约100℃进行。温度范围的另外实例如下(所有范围均为“从约”和“至约”)20-100，30-100，35-100，37-100，40-100，50-100，60-100，70-100，10-90，10-80，10-70，10-60，和30-60℃，以及在此所述上限和下限的任何组合。
酶促处理可以在约2至约12的pH下进行。PH范围的另外实例如下(所有范围均为“从约”和“至约”)3-12，4-12，5-12，6-12，7-12，8-12，9-12，2-11，2-10，2-9，2-8，4-10，5-8，以及在此所述上限和下限的任何组合。
酶促处理合适的持续时间可以进行几秒至若干小时，例如从约30秒至约48小时，或从约1分钟至约24小时，或从约1分钟至约18小时，或从约1分钟至约12小时，或从约1分钟至5小时，或从约1分钟至约2小时，或从约1分钟至约1小时，或从约1分钟至约30分钟。
添加剂除脂解酶以外，各种各样的添加剂可用于本发明的方法或用途中。例如，可用滑石、粘土及其他无机颗粒使粘性物的粘性变得更小，并且可用分散剂、表面活性剂、聚合物和溶剂来降低粘性物的尺寸和/或使其保持分散或悬浮状态。
表面活性剂和/或分散剂经常存在于造纸纸浆中和/或添加至造纸纸浆中。因此，本发明的方法可以在常用于造纸纸浆的阴离子、非离子、阳离子和/或两性离子表面活性剂和/或分散剂的存在下进行。能够水解包含醋酸乙烯酯单体的聚合物的酶可以是这样的酶其在常用于造纸纸浆中或在纺织物洗涤期间的阴离子、非离子、阳离子性和/或两性离子表面活性剂和/或分散剂存在下是具有活性的和稳定的。
阴离子表面活性剂的实例是烷基、取代烷基或芳基的羧酸盐、硫酸盐、磺酸盐或磷酸盐。非离子表面活性剂的实例是聚氧乙烯化合物，如醇乙氧基化物、丙氧基化物或混合的乙氧基化物/丙氧基化物，聚甘油及其它多元醇，以及某些嵌段共聚物。阳离子表面活性剂的实例是水溶性阳离子聚合物，如硫酸四价铵和某些胺，例如表氯醇/二甲胺聚合物(EPI-DMA)及其交联溶液、聚二烯丙基二甲基氯化铵(DADMAC)、DADMAC/丙烯酰胺共聚物和紫罗烯聚合物，如披露于US 5,681,862和5,575,993中的那些。两性离子表面活性剂或两性表面活性剂的实例是甜菜碱、氨基乙酸盐、氨基丙酸盐、亚氨基丙酸盐和各种各样的咪唑啉衍生物。另外，还可以使用披露于US5,256,252的聚合物。
另外，根据本发明，如上述的表面活性剂，包括其任何混合物，也可以与在本发明中所述的至少一种脂解酶一起用于造纸过程中，并与上述酶一起包括在组合物中。在上述组合物中各表面活性剂的量可以为组合物重量的约8至约40％重量。在特定的实施方案中，每种表面活性剂的量从约10至约38，或从约12至约36，或从约14至约34，或从约16至约34，或从约18至约34，或从约20至约34，或从约22至约34，或从约24至约34，或从约26至约34，或从约28至约32％(w/w)。
在另一特定的实施方案中，上述各种范围指的是表面活性剂的总量。
组合物优选是用于制造纸张的添加剂。在特定的实施方案中，组合物是非-构造(non-build)组合物，即它们不含构造剂(builders)。构造剂的实例是常用于洗涤剂组合物的某些磷酸盐，沸石等等。
组合物可以包含选自下列酶的至少一种另外的酶蛋白酶，淀粉酶，支链淀粉酶，脂肪酶，半纤维素酶，葡聚糖内切酶，角质蛋白酶，和果胶酶；以及它们任何的组合。
组合物可以利用在例如US 5,356,800；5,780,283中描述的配方而稳定化。
本发明还涉及(I)通过用角质蛋白酶处理而水解包含醋酸乙烯酯单体的聚合物的方法；根据上述的方法，其中角质蛋白酶源自于真菌；根据上述的方法，其中角质蛋白酶源自于Humicola insolens或Fusarium solani pisi；通过用源自假单胞菌属(Pseudomonas)的脂肪酶处理而水解包含醋酸乙烯酯单体的聚合物的方法；通过用氨基酸序列与源自Candida antarctica SEQ ID NO.3的脂肪酶B具有至少60％的同源性的脂肪酶处理而水解包含醋酸乙烯酯单体的聚合物的方法；通过用氨基酸序列与SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2具有至少70％的同源性的脂解酶处理而水解包含醋酸乙烯酯单体的聚合物的方法；(II)一种用酶对包含醋酸乙烯酯单体的聚合物进行处理而使聚合物水解的方法，该酶在由50mM NaCl、0.5mM的KH2PO4、9％(v/v)甘油和0.1％(w/v)阿拉伯胶组成的乳液中，以5％(w/v)聚醋酸乙烯酯(PVAc)均聚物作为底物，在35℃、pH8时持续4分钟时具有水解活性；和(III)酶在造纸中的应用，所述酶具有a)在45℃于分散的PVAc底物上18小时之后，通过毛细管电泳测定的水解度至少为0.1，其中分散的PVAc底物通过将1.5毫升于甲醇中6％的PVAc注入40毫升缓冲剂，pH 6或8，中而制得，并且其中PVAc的分子量约为12800；和/或b)在由50mM的NaCl、0.5mM的KH2PO4、9％(v/v)甘油和0.1％(w/v)阿拉伯胶组成的乳液中，将5％(w/v)的包含醋酸乙烯酯聚合物制剂作为底物，在35℃、pH7持续4分钟的水解活性，其中所述聚合物是(i)PVAc均聚物制剂并且反应pH为8；
(ii)醋酸乙烯酯 乙烯共聚物制剂并且反应pH是7；和/或(iii)醋酸乙烯酯 叔癸酸 乙烯基酯共聚物制剂并且反应pH为7；以及上述(III)的应用，其中在(i)的条件下水解活性大于0.2单位，优选大于0.4单位，更优选大于0.6单位；其中酶的PVAc水解活性至少为0.7单位/毫升；其中在(ii)的条件下水解活性至少为0.2单位/毫升；其中在(iii)的条件下水解活性至少为0.2单位/毫升；其中为了根据a)确定水解度和为了根据步骤i)-iii)任一项确定水解活性，所述酶是定义明确的；其中为了根据a)确定水解度和为了根据步骤i)-iii)任一项确定水解活性，所述酶是脱盐的；其中为了根据步骤i)-iii)任一项确定水解活性，将A280＝0.15或50微克酶蛋白的200微升酶溶液添加至15毫升底物乳胶中；为了进行粘性物控制和/或为了至少部分基于回用纸张制备的纸张或其制备；其中为了制造纸张，酶剂量以每克包含醋酸乙烯酯单体的聚合物计为0.1至5000单位的PVAc水解活性；其中每吨纸浆的酶剂量是(i)根据(III)的(i)为约100至约100000单位；或(ii)为约0.1至约100000毫克酶蛋白；其中在LAS和/或过氧化氢存在下，酶是活性的和稳定的另外还包括至少一种另外酶的应用，该另外的酶选自如下的酶蛋白酶，淀粉酶，支链淀粉酶，脂肪酶，半纤维素酶，葡聚糖内切酶，角质蛋白酶和果胶酶；和/或另外还包括至少一种阴离子，非离子，阳离子性和/或两性离子表面活性剂和/或分散剂的应用。
在此描述并要求保护的本发明并不局限于具有实施方案中所披露的范围，这是因为这些实施方案只是对本发明若干方面的说明。任何等效的实施方案均落入本发明的范围。实际上，除在此示出并描述的那些实施方案以外，本发明的各种改进对于本领域普通技术人员来说根据上面的描述将是显而易见的。
所述改进也将落入权利要求书的范围内。在有分岐的情况下，将参考包括定义在内的本发明的内容。
在此引证了各种参考文献，应将内容全文引入作为参考。
材料和方法酶A)根据US 5,827,719，源自于Humicola insolens的角质蛋白酶。
B)A)的热稳定的变种。
C)根据WO 00/34450的A)的热稳定变种。
D)根据WO 94/14964，源自Fusarium solani pisi的角质蛋白酶。
E)根据US 5,273,898，源自Candida antarctica的脂肪酶B。
F)根据US 4,876,024，源自洋葱假单胞菌(Pseudomonas cepacia)的脂肪酶。
G)根据US 5,942,431，源自Pseudomonas sp.的脂肪酶。
H)源自猪胰脏(Porcine Pancreas)的磷脂酶。
I)NOVOCOR ADL脂肪酶。
J)RESINASE A 2X脂肪酶。
K)根据WO 00/32758，具有脂肪酶和磷脂酶活性的J)的变种。
L)源自黑色曲霉(Aspergillus niger)的阿魏酸酯酶(Ferulic acid esterase)。
NOVOCOR ADL和RESINASE A 2X脂肪酶是得自Novozymes A/S，Krogshoejvej 36，DK-2880 Bagsvaerd，Denmark的商品酶产品。
在下表A中示出的Humicola insolens角质蛋白酶的变异体根据WO00/34450和WO 01/92502中的描述进行制备，并如下所述进行脂解活性的测试。对这两种变异体的测试结果，在实施例中作为B)和C)列出。
表A


试剂/底物0.025M NaOH5mM MES缓冲剂pH 6-6.50.98g MES 2-[N-吗啉代]乙磺酸水合物0.44g CaCl2，2H2O0.246g MgSO4，7H2OMilli Q水加至1升用稀(weak)NaOH或HCl调节pH5mM Hepes缓冲剂 pH 7-9
1.19g Hepes(N-[2-羟乙基]哌嗪-N′-[2-乙磺酸])0.44g CaCl2，2H2O0.246g MgSO4，7H2OMilli Q 水加至1升用稀NaOH或HCl调节pH6％w/v在MeOH溶液中的聚醋酸乙烯酯PVAc在约50℃溶解于约80毫升甲醇中的6g PVAc Mw≈12800(GPC)(AldrichChemical Company.Inc.Cat.No.43，043-9)，并使之冷却。
添加甲醇至100毫升。
2％w/v在MeOH溶液中的聚醋酸乙烯酯PVAc在约50℃溶解于约80毫升甲醇中的2g PVAc Mw≈113000(AldrichChemical Company.Inc.Cat.No.18.948-0)，并使之冷却。
添加甲醇至100毫升。
LAS(LAS Nansa 1169A，十二烷基苯磺酸钠盐，Alright & Wilson)。
乳液试剂17.9g NaCl0.41g KH2PO4540毫升甘油6.0g阿拉伯胶在强烈搅拌下添加阿拉伯胶之前，将NaCl、KH2PO4、甘油和400毫升DI水混合。在完全溶解以前，连续进行搅拌。用DI水添加至1升。
用于实施例1-3的底物乳液15g PVAc均聚物或共聚物(Gludan，Denmark)(分别是实施例1和实施例2-3)50毫升乳液试剂235毫升DI水对该溶液搅拌约30分钟，直至所有底物溶解。
设备滴定仪Radiometer Titralab(Vit 90)电极Orion 8103 Ross-Semi micro Combination pH电极，玻璃体。
浊度计带有USEPA过滤器的HACH浊度计2100AN(Cat.30312-00)，包括装配该仪器的特制玻璃(样品管Cat.20849-00)水浴包括磁性搅拌器的水浴(长方形搅拌棒，15毫米)水浴带有温度控制的水浴。
过滤器0.22微米的过滤器(Millipore的Millex-GV单用途过滤器)毛细管电泳带有Chemstation软件的Hewlett Packard 3D CEAgilent缓冲剂用于HPCE的Agilent的碱性阴离子缓冲剂，Part.No.5064-8209Agilent毛细管Agilent，熔融硅石，CE ext.Light path cap.，内径50微米，有效长度104厘米，总长112.5厘米，Part.no.G1600-64232张力仪KSV Sigma 70Model 6000，配备有铂Wilhelmy板(尺寸10mm×20mm)，温度调节和溶液搅拌实施例实施例1-3在通过酶释放乙酸酯下，在恒定pH使包含醋酸乙烯酯单体的聚合物制剂水解。作为时间函数的乙酸酯的释放通过pH-stat滴定用碱进行中和来测量。
打开滴定仪(参见设备)，将水浴设置在35℃，并用常规的校准缓冲剂对电极进行校准。将15毫升底物乳液添加至各烧杯中并对其加热3分钟，以获得正好的温度(在使用之前始终应对底物进行搅拌，以避免沉淀)。用新鲜制得的稀氢氧化钠溶液(25mM)调节pH。根据相应于酶A)-L)的高度提纯的和脱盐的酶，制备酶溶液(于去离子水中)。该溶液对应于A280＝0.15的吸收率，并将其的200微升溶液添加至底物乳液中并利用25mM的NaOH开始滴定。4分钟之后停止滴定。对于2-4分钟的周期，计算每分钟NaOH的平均消耗量(毫升)，并将该值用于下面单位的计算。
1单位酶定义为在给定条件下通过水解底物，每分钟释放1微摩尔可滴定乙酸酯所需的酶量。如在下表中列出的单位/毫升指的是A280＝0.15的酶溶液的毫升数。
实施例1PVAc均聚物的水解如上所述，测量不同脂解酶降解PVAc均聚物制剂的能力。在将酶添加至底物乳液中之前，将pH调节至8。结果列于表1中。
表1

实施例2醋酸乙烯酯共聚物的水解如上所述，测量脂解酶降解由醋酸乙烯酯和乙烯组成的醋酸乙烯酯共聚物制剂的能力。在将酶添加至底物乳液中之前，将pH调节至7。结果列于表2中。
表2

实施例3胶乳基醋酸乙烯酯共聚物的水解如上所述，测量脂解酶降解由醋酸乙烯酯叔癸酸乙烯基酯组成的醋酸乙烯酯共聚物制剂的能力。在将酶添加至底物乳液中之前，将pH调节至7。结果列于表3中。
表3

实施例4-10在实施例4-10中，将纯的聚醋酸乙烯酯(缩写为PVAc)用作底物。PVAc不溶于水但溶于甲醇。当将溶解于甲醇中的少量PVAc注入水中时，PVAc立即以极小的颗粒沉淀，并使液体变得混浊。由于它们具有粘性，所以这些颗粒往往会聚集成大得多的颗粒，从而使浊度减小。利用显示具有脂解活性的酶(例如PVAc水解活性)，能够防止这种聚集。因此，以随时间而变的PVAc分散体的浊度，可直接测量脂解酶的作用。浊度以NTU-单位(比浊法浊度单位(Nephelometric Turbidity Units))测量。数值低表明试样是透明的，而数值高表明试样是混浊的(即，酶起作用而降低了粘性)。在这些实施例中，酶剂量以ppm(w/w)酶蛋白给出。
实施例4凝聚PVAc的能力在玻璃杯中加上搅拌棒和30毫升缓冲剂。将玻璃杯放入水浴中，并等待调节至预定的温度。磁性搅拌器的速度保持不变。除去相当于待添加酶溶液量的缓冲剂量(以保证体积恒定)。添加酶。将0.15毫升2％w/v的PVAc(Mw≈13000)注入甲醇溶液中，并开启定时器。在搅拌10秒之后，将时间调零，并测量浊度。以时间为函数测量浊度。
分别在35、45或55℃，和pH＝8(利用5mM的Hepes缓冲剂)，利用10ppm的酶B)的结果分别示于下表4-6中。
表4

表5

表6

表7示出了利用5mM的Hepes缓冲剂，在45℃、pH＝8时两种脂解酶的剂量-响应图。在20分钟之后测量浊度。这些数值是三个实验的平均值。
表7

表8示出了脂解酶对pH的作用(45℃；20分钟后的浊度；酶剂量，10ppm酶B)。这些数值是三个实验的平均值。
表8

实施例5对过氧化氢的耐性使用与实施例4相同的装备。在20分钟之后测量浊度，但在该实施例中，以恒定速率将15ppm的过氧化氢添加至不同酶剂量的酶B)中；温度为48℃；pH＝8.5，利用5mM的Hepes缓冲剂。结果列于下表9中。
表9

在另一实验中，将0.5ppm酶B)的恒定酶剂量与不同用量的过氧化氢(0-1000ppm)相结合。结果列于下表10中。
表10

实施例6对LAS(直链烷基苯磺酸盐)的耐性使用与实施例4相同的装备。缓冲剂为5mM的Hepes，pH＝7；45℃；在20分钟之后测量浊度。将两种不同用量的LAS加入该实验50和200ppm。结果列于下表11中。
表11

实施例7测量醋酸乙烯酯均聚物的水解度借助检测释放入溶液中的乙酸酯，可测量包含醋酸乙烯酯单体的聚合物的水解度(脱乙酰作用)。可检测到低浓度的乙酸酯，并通过毛细管电泳分析进行定量。
在加热的水浴上，于封闭的锥形烧瓶中，将40毫升5mM的Hepes缓冲剂(pH＝8)加热至50℃。根据下表的用量，将酶计量加入缓冲剂中。然后，根据下表的用量，将于甲醇中的6％w/v的PVAc(Mw≈12800)注入缓冲剂中。18小时后取样，并过滤通过0.22微米的过滤器。利用Agilent缓冲剂并使用Agilent毛细管(参见设备清单)，通过毛细管电泳检测这些试样的乙酸酯数量。
程序温度30℃，电压-30kV。用缓冲剂冲洗4分钟。以50毫巴注入试样，6秒钟；以50毫巴注入缓冲剂，10秒钟。洗脱20分钟。检测信号350/20纳米。参考信号275/10纳米。
0-450ppm乙酸酯的乙酸酯标准曲线是并行的。将乙酸酯峰积分，并相对于标准曲线确定试样中的乙酸酯量。通过计算开始时烧瓶中醋酸乙烯酯单体的实际量，而确定PVAc的水解度。醋酸乙烯酯的Mw为86g/mol。
就注入1.5毫升PVAc溶液的实验1-6而言，按如下进行计算 0.0015升×60克VAc/升÷86克/摩尔×0.0415升＝2.522×10-2摩尔/升结果列于下表12中。1％的水解度将产生2.522×10-4摩尔/升的乙酸酯浓度，其等于15.1毫克/升＝15.1ppm乙酸酯。对于实验1-6，相对于对应于15.1ppm乙酸酯的1％的水解，计算水解度。对于实验7-12，计算的结果给出了对应于29.2ppm乙酸酯的1％的水解。
表12

表中enzyme酶实施例8以不同的pH和温度测量醋酸乙烯酯均聚物的水解度该实施例严格按照实施例7进行，所不同的是条件，即在35、45和55℃并且pH＝6(利用5mM的MES缓冲剂)或pH＝8(利用5mM的Hepes缓冲剂)。结果列于下表13中。
表13

*实验错误，放弃结果表中enzyme酶实施例9防止PVAc聚集物在金属上的沉积PVAc聚集物具有很高的沉积并粘附至不同表面上的趋势，这样的表面如用于例如成形毛毯、压榨毛毯等的金属和疏水材料的表面。在此描述的脂解酶当添加至包含PVAc的溶液中时，将阻止这些粘性物的形成(聚集物不粘附至玻璃表面上)。
将200毫升缓冲剂5mM的Hepes(pH＝8)加热至45℃。将10ppm酶B)添加至一烧杯中。对不添加酶的烧杯作为酶空白进行平行试验。通过玻璃涂覆的磁铁进行搅拌。将金属表面浸入该溶液中。将4毫升2％w/v的PVAc(Mw≈113000)甲醇溶液注入该溶液中。10分钟之后停止实验。
如图1，附上了金属表面的照片。左侧的杆为添加了酶B的实验，而右侧的杆为没有添加酶的对照实验。左侧杆的表面看来很干净，同时PVAc溶液保持混浊状态。相反，对照实验(右侧的杆)出现了粘附至金属表面上的PVAc聚集物，并且周围的溶液变得透明。
实施例10防止PVAc在金属表面上的沉积在金属表面上聚集物的沉积量能够定量为在定义明确的表面上的质量吸附(mass uptake)。为此，可使用装备有Wilhelmy板的张力仪。对张力仪进行操作，以测量将板整个缓慢地浸入PVAc溶液每一个2分钟之后的重量增加。测量10分钟之后的重量。
通过浸入乙醇中并在煤气灶火焰(gas bumer flame)中无焰(glow)燃烧对Wilhelmy板进行净化。
将干净板置于张力仪电子天平上。在张力仪烧杯中，将200毫升缓冲剂--5mM的Hepes(pH＝8)加热至希望的温度(35℃或45℃)。添加酶。
注入2毫升2％w/v的PVAc(Mw≈113000)甲醇溶液。开始使Wilhelmy板上/下移动。10分钟之后测量板的重量。低质量吸附表明防止了PVAc沉积。在35和45℃获得的结果分别列于表13和14中。
表13

表14

实施例11脂解酶纯度的测定利用得自PIERCE(与PIERCE cat.No.23225相同)的BCA蛋白测试盒(protein assay kit)，测定酶试样的蛋白质浓度。Bicinchoninic Acid(BCA)的钠盐是稳定的、水溶性化合物，它能够在碱性环境中与亚铜离子(Cu1+)形成强紫色配合物。BCA试剂构成了能够监测蛋白质与碱性Cu2+反应(双缩脲反应)中产生的亚铜离子的、BCA蛋白测试盒的基础。由该反应产生的颜色是稳定的，并且随着蛋白质浓度成比例地增加(Smith，P.K.，et al.(1985)，分析生物化学，vol.150，pp.76-85)。BCA工作液通过将50份试剂A与1份试剂B混合而制备(试剂A是PIERCE cat.No.23223，包含在碱性碳酸盐缓冲剂中的BCA和酒石酸；试剂B是PIERCE cat.No.23224，包含4％CuSO4*5H2O)。将300毫升试样与3.0毫升BCA工作液混合。在37℃30分钟之后，将试样冷却至室温，并将A490读作试样中蛋白质浓度的量度。作为标准物，在所述测试中，将包括牛血清清蛋白的稀释物(PIERCE cat.No.23209)。
如果脂解酶呈固态，首先，在5℃，将该产品溶解/悬浮在20体积的100mM H3BO3、10mM 3，3′-二甲基戊二酸、2mMCaCl2、pH6(缓冲剂A)中至少15分钟；而如果在该阶段的酶为悬浮液，那么，将该悬浮液过滤通过0.45微米的过滤器，以得到透明溶液。由此将溶液处理成液体脂解酶。
如果脂解酶是液体，那么，首先在6-8000Da cut-off SpectraPor渗析管(cat.no.132 670，得自Spectrum Medical Industries)中，相对100体积的缓冲剂A+150mM的NaCl(缓冲剂B)，在5℃渗析至少5小时，以除去可能引起高粘度的配方化学剂，后者对尺寸排阻色谱法是有害的。
如果在渗析期间形成沉淀物，那么使渗析的脂解酶过滤通过0.45微米的过滤器。在渗析过的酶产品中蛋白质的浓度利用上述蛋白质浓度测试来确定，并用缓冲剂B稀释该酶产品，从而给出准备用于尺寸排阻色谱法的试样，其蛋白质浓度为5毫克/毫升。如果在渗析之后酶产品的蛋白质浓度低于5毫克/毫升，那么，照原样使用之。
使300毫升HiLoad26/60 Superdex75pg柱(Amersham Pharmacia Biotech)在缓冲剂B中平衡(流量1毫升/分钟)。将1.0毫升酶试样应用于该柱，并用缓冲剂B对该柱进行洗脱(流量1毫升/分钟)。从柱的出口收集2.0毫升馏分，直至试样从该柱洗脱为止。就，分析所收集馏分的脂解活性。将在此所述的一次或更多次测试中具有活性的蛋白质峰定义为脂解酶峰。以峰中蛋白质量除以所有识别峰中总蛋白质量来计算脂解酶的纯度。在特定的实施方案中，纯度指的是峰中蛋白质量除以识别的脂解峰中蛋白质总量。
序列表<110>诺维信公司(Novozymes A/S)<120>脂解酶在粘性物控制中的应用<130>10142<160>3<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>194<212>PRT<213>Humicola insolens<400>1Gln Leu Gly Ala Ile Glu Asn Gly Leu Glu Ser Gly Ser Ala Asn Ala1 5 10 15Cys Pro Asp Ala Ile Leu Ile Phe Ala Arg Gly Ser Thr Glu Pro Gly20 25 30Asn Met Gly Ile Thr Val Gly Pro Ala Leu Ala Asn Gly Leu Glu Ser35 40 45His Ile Arg Asn Ile Trp Ile Gln Gly Val Gly Gly Pro Tyr Asp Ala50 55 60Ala Leu Ala Thr Asn Phe Leu Pro Arg Gly Thr Ser Gln Ala Asn Ile65 70 75 80Asp Glu Gly Lys Arg Leu Phe Ala Leu Ala Asn Gln Lys Cys Pro Asn85 90 95Thr Pro Val Val Ala Gly Gly Tyr Ser Gln Gly Ala Ala Leu Ile Ala100 105 110
Ala Ala Val Ser Glu Leu Ser Gly Ala Val Lys Glu Gln Val Lys Gly115 120 125Val Ala Leu Phe Gly Tyr Thr Gln Asn Leu Gln Asn Arg Gly Gly Ile130 135 140Pro Asn Tyr Pro Arg Glu Arg Thr Lys Val Phe Cys Asn Val Gly Asp145 150 155 160Ala Val Cys Thr Gly Thr Leu Ile Ile Thr Pro Ala His Leu Ser Tyr165 170 175Thr Ile Glu Ala Arg Gly Glu Ala Ala Arg Phe Leu Arg Asp Arg Ile180 185 190Arg Ala<210>2<211>199<212>PRT<213>Fusarium solani pisi<400>2Gly Arg Thr Thr Arg Asp Asp Leu Ile Asn Gly Asn Ser Ala Ser Cys1 5 10 15Ala Asp Val Ile Phe Ile Tyr Ala Arg Gly Ser Thr Glu Thr Gly Asn20 25 30Leu Gly Thr Leu Gly Pro Ser Ile Ala Ser Asn Leu Glu Ser Ala Phe35 40 45Gly Lys Asp Gly Val Trp Ile Gln Gly Val Gly Gly Ala Tyr Arg Ala50 55 60Thr Leu Gly Asp Asn Ala Leu Pro Arg Gly Thr Ser Ser Ala Ala Ile65 70 75 80
Arg Glu Met Leu Gly Leu Phe Gln Gln Ala Asn Thr Lys Cys Pro Asp85 90 95Ala Thr Leu Ile Ala Gly Gly Tyr Ser Gln Gly Ala Ala Leu Ala Ala100 105 110Ala Ser Ile Glu Asp Leu Asp Ser Ala Ile Arg Asp Lys Ile Ala Gly115 120 125Thr Val Leu Phe Gly Tyr Thr Lys Asn Leu Gln Asn Arg Gly Arg Ile130 135 140Pro Asn Tyr Pro Ala Asp Arg Thr Lys Val Phe Cys Asn Thr Gly Asp145 150 155 160Leu Val Cys Thr Gly Ser Leu Ile Val Ala Ala Pro His Leu Ala Tyr165 170 175Gly Pro Asp Ala Arg Gly Pro Ala Pro Glu Phe Leu Ile Glu Lys Val180 185 190Arg Ala Val Arg Gly Ser Ala195<210>3<211>317<212>PRT<213>Candida Antarctica<400>3Leu Pro Ser Gly Ser Asp Pro Ala Phe Ser Gln Pro Lys Ser Val Leu1 5 10 15Asp Ala Gly Leu Thr Cys Gln Gly Ala Ser Pro Ser Ser Val Ser Lys20 25 30Pro Ile Leu Leu Val Pro Gly Thr Gly Thr Thr Gly Pro Gln Ser Phe35 40 45
Asp Ser Asn Trp Ile Pro Leu Ser Thr Gln Leu Gly Tyr Thr Pro Cys50 55 60Trp Ile Ser Pro Pro Pro Phe Met Leu Asn Asp Thr Gln Val Asn Thr65 70 75 80Glu Tyr Met Val Asn Ala Ile Thr Ala Leu Tyr Ala Gly Ser Gly Asn85 90 95Asn Lys Leu Pro Val Leu Thr Trp Ser Gln Gly Gly Leu Val Ala Gln100 105 110Trp Gly Leu Thr Phe Phe Pro Ser Ile Arg Ser Lys Val Asp Arg Leu115 120 125Met Ala Phe Ala Pro Asp Tyr Lys Gly Thr Val Leu Ala Gly Pro Leu130 135 140Asp Ala Leu Ala Val Ser Ala Pro Ser Val Trp Gln Gln Thr Thr Gly145 150 155 160Ser Ala Leu Thr Thr Ala Leu Arg Asn Ala Gly Gly Leu Thr Gln Ile165 170 175Val Pro Thr Thr Asn Leu Tyr Ser Ala Thr Asp Glu Ile Val Gln Pro180 185 190Gln Val Ser Asn Ser Pro Leu Asp Ser Ser Tyr Leu Phe Asn Gly Lys195 200 205Asn Val Gln Ala Gln Ala Val Cys Gly Pro Leu Phe Val Ile Asp His210 215 220Ala Gly Ser Leu Thr Ser Gln Phe Ser Tyr Val Val Gly Arg Ser Ala225 230 235 240Leu Arg Ser Thr Thr Gly Gln Ala Arg Ser Ala Asp Tyr Gly Ile Thr245 250 255Asp Cys Asn Pro Leu Pro Ala Asn Asp Leu Thr Pro Glu Gln Lys Val260 265 270
Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala Pro Ala Ala Ala Ala Ile Val Ala Gly275 280 285Pro Lys Gln Asn Cys Glu Pro Asp Leu Met Pro Tyr Ala Arg Pro Phe290 295 300Ala Val Gly Lys Arg Thr Cys Ser Gly Ile Val Thr Pro305 310 权利要求
1.一种造纸方法，包括a)由包含回用纸的材料制备纸浆；b)用脂解酶对纸浆进行处理，所述酶能够水解包含醋酸乙烯酯单体的聚合物；和c)由处理过的纸浆造纸。
2.权利要求1的方法，其中酶具有a)在45℃于分散的PVAc底物上18小时之后，通过毛细管电泳确定的水解度至少为0.1，其中分散的PVAc底物通过将1.5毫升于甲醇中6％的PVAc注入40毫升缓冲剂，pH6或8，中而制得，并且其中PVAc的分子量约为12800；和/或b)在由50mM的NaCl、0.5mM的KH2PO4、9％(v/v)甘油和0.1％(w/v)阿拉伯胶组成的乳液中，将5％(w/v)包含醋酸乙烯酯聚合物制剂作为底物，在35℃持续4分钟的水解活性，其中所述聚合物是(i)PVAc均聚物制剂并且反应pH为8；(ii)醋酸乙烯酯乙烯共聚物制剂并且反应pH是7；和/或(iii)醋酸乙烯酯叔癸酸乙烯基酯共聚物制剂并且反应pH为7。
3.权利要求2的方法，其中在(i)条件下的水解活性大于0.2单位。
4.权利要求2的方法，其中酶的PVAc水解活性至少为0.7单位/毫升。
5.权利要求2的方法，其中在(ii)条件下的水解活性至少为0.2单位/毫升。
6.权利要求2的方法，其中在(iii)条件下的水解活性至少为0.2单位/毫升。
7.上述权利要求2-6任一项的方法，其中为了根据a)测定水解度以及为了根据步骤i)-iii)中的任一步测定水解活性，所述酶是定义明确的。
8.上述权利要求2-7任一项的方法，其中为了根据a)测定水解度以及为了根据步骤i)-iii)中的任一步测定水解活性，所述酶是脱盐的。
9.上述权利要求2-8任一项的方法，其中为了根据步骤i)-iii)中的任一项确定水解活性，将A280＝0.15或50微克酶蛋白的200微升酶溶液添加至15毫升底物乳液中。
10.权利要求1-9任一项的方法，用于粘性物控制和/或用于脱墨。
11.权利要求1-10任一项的方法，其中用于造纸的酶剂量以每克包含醋酸乙烯酯单体的聚合物计为0.1至5000单位的PVAc水解活性。
12.权利要求1-11任一项的方法，其中每吨纸浆的酶剂量为(i)根据权利要求1的(i)，从约100至100000单位；或(ii)为约0.1至约100000毫克酶蛋白。
13.权利要求1-12任一项的方法，其中在LAS和/或过氧化氢存在下，酶是活性的和稳定的。
14.权利要求1-13任一项的方法，另外还包括使用选自下列的至少一种另外的酶蛋白酶、淀粉酶、支链淀粉酶、脂肪酶、半纤维素酶、葡聚糖内切酶、角质蛋白酶和果胶酶。
15.权利要求1-14任一项的方法，另外还包括使用至少一种阴离子、非离子、阳离子性和/或两性离子表面活性剂和/或分散剂。
全文摘要
本发明涉及某些脂解酶如角质蛋白酶和脂肪酶在由再生纸张制造纸张和纸制品中的应用。上述酶的实例源自于腐质霉属、念珠菌属、镰刀菌属和假单胞菌属的菌株。通过利用这些酶，减少了与来源于废纸的所谓粘性物有关的问题。
文档编号D21H21/00GK1639416SQ02810427
公开日2005年7月13日 申请日期2002年5月17日 优先权日2001年5月21日
发明者金·博尔奇, 亨里克·伦德, 社领正树, 坂口博脩, 汉尼·H·佩德森, 詹姆斯·W·菲茨亨里 申请人:诺维信公司