一种跨膜蛋白3包装的外泌体在制备抗登革病毒感染药物中的应用
【专利说明】一种跨膜蛋白3包装的外泌体在制备抗登革病毒感染药物 中的应用
[0001]
技术领域
[0002] 本发明涉及蛋白质工程技术领域，更具体地，涉及一种跨膜蛋白3包装的外泌体 在制备抗登革病毒感染药物中的应用。
【背景技术】
[0003] 外泌体（exosome)又称胞外体，是由细胞内的多泡体（multivesicularbody, MVB) 与细胞膜融合后，释放到细胞外基质中的一种膜性囊泡（vesicles)。exosome这个术语最 初由Johnstone等报道提出并命名，他们在研宄网织红细胞向成熟红细胞转变过程中，从 体外培养羊网织红细胞的上清液中，分离纯化了这种小囊泡状物质，它可以带走成熟红细 胞不需要的质膜蛋白，如转铁蛋白受体和乙酰胆碱脂酶等。外泌体起源于细胞内吞过程中 的内体（endosome)，内体的外膜向其腔内出芽，形成一个膜包裹的结构，其基部逐渐与内涵 体的膜分离，脱落后就形成了内体内的小囊泡（40?100 nm大小)，同时可有多个小囊泡形 成，而含有多个小囊泡的内体又称为多泡体（500 nm大小)。多泡体的代谢途径一般有两种： 一是与质膜融合，将其中的小囊泡以胞吐的方式排到细胞外环境，即成为外泌体：另一种是 在胞内与溶酶体（lysosome)融合，导致其内容物的降解。随后研宄报道外泌体又从其他类 型细胞的培养基与体液中被分离出来。
[0004] 外泌体参与机体的多种功能，包括参与清除细胞冗余成分、介导细胞粘附及信号 传递、抗原提呈、细胞间传递遗传物质；另外，外泌体具有促病毒感染与抑制病毒感染双重 功能：1.外泌体传递病毒颗粒一一介导病毒的感染；2.外泌体传递病毒结构或非结构蛋 白--参与病毒逃避机体免疫监视；3.外泌体传递宿主细胞抗病毒蛋白--参与宿主天然 抗病毒免疫调节。
[0005] 既然外泌体能够包装各种蛋白，那么在病毒感染时，如果宿主细胞将干扰素诱导 的抗病毒蛋白包装成外泌体形式，进行抗病毒蛋白的细胞间传递，直接使宿主形成更强的 抗病毒免疫状态，这将提出宿主天然免疫调节新型模式。Khatua等科学家研宄发现包装了 AP0BEC3G蛋白的外泌体可直接传递到宿主细胞而具极强的抗HIV-I病毒感染的功效。作为 一种机体天然抗病毒因子，AP0BEC3G是一种胞嘧啶脱氨基酶家族成员，近年来因其独特的 抗病毒作用机制受到了广泛的关注。HIV-I在宿主细胞复制过程中，AP0BEC3G可以大量包 装进入新生成的病毒颗粒内部，诱导病毒负链cDNA胞嘧啶（cytimidine，C)脱氨基突变为 尿嘧啶（uracil，U)，导致病毒基因组高度突变而丧失活性。但是，HIV编码的Vif蛋白能拮 抗AP0BEC3G的脱氨基酶作用，二者形成动态平衡，所以HIV最终还是能够逃脱AP0BEC3G的 抗病毒作用。而AP0BEC3G外泌体不但直接参与了宿主抵抗HIV入侵的防御机制，而且可以 避免HIV的Vif蛋白的拮抗作用，具体分子机制未明。外泌体传递宿主细胞抗病毒蛋白，为 新型抗病毒药物的开发和机体天然免疫机制的研宄开拓了新的方向，可对未来的病毒性病 原体所致的疾病的防治提供新的线索与思路。本研宄通过探索包装抗病毒蛋白的外泌体， 是否可以直接代替干扰素的抗病毒作用，如此可拓展人体天然抗病毒蛋白的临床应用。
【发明内容】
[0006] 本发明人通过研宄发现，跨膜蛋白3作为外泌体的新型生物活性形式，外泌体传 递宿主细胞抗病毒蛋白，打破了现有技术中采用干扰素诱导产生抗病毒蛋白的思路，为新 型抗病毒药物的开发和机体天然免疫机制的研宄开拓了新的方向。
[0007] 本发明的目的通过以下技术方案实现： 本发明提供了一种IFITM3(跨膜蛋白3)包装的外泌体在制备抗登革病毒感染药物中 的应用，所述外泌体的制备方法为收集高表达IFITM3的人脐静脉内皮细胞培养基上清，将 上清采用蔗糖密度梯度超速离心法即得所述外泌体。
[0008] 优选地，所述高表达IFITM3重组质粒的制备方法为： SI:根据IFITM3的基因序列，设计正向引物，如SEQ ID NO :1所示，设计反向引物，如 SEQ ID NO : 2 所示； S2:根据PCR扩增产物，反应条件如下：94 °C预变性5 min;94 °C变性30 s，55 °C 30 s，72 °C 60 s，30个循环；72 °C延伸7 min，然后将所有扩增产物用I. 5 %琼脂糖凝胶电泳 并切胶回收纯化； S3:利用QIAprep spin miniprep kit抽提质粒，将pMSCV质粒DNA与IFITM3基因片段 PCR产物进行双酶切反应和连接，测序比对后，利用氯化铯梯度离心法提取pMSCV- IFITM3 重组质粒DNA。
[0009] 优选地，所述IFITM3包装的外泌体的产量鉴定方法为采用IFITM3包装的外泌体 处理HeLa受体细胞后，检测HeLa细胞中IFITM3的蛋白水平。
[0010] 优选地，所述IFITM3包装的外泌体的活性鉴定方法为应用real time RT-PCR检 测细胞内感染的登革病毒RNA和培养基上清中病毒RNA。
[0011] 本研宄首先证明了登革病毒感染可诱发宿主细胞内高表达IFITM，继而分别通过 逆转录病毒表达质粒和磷酸钙转染技术构建IFITM外源性稳定及瞬时高表达体系，应用 western blotting技术、流式细胞术来证明IFITM3蛋白的抗登革病毒感染的活性。同时， 还将应用RNA干扰技术沉默IFITM表达，以明确其是否能增强登革病毒感染，用以探讨宿主 细胞的内源性IFITM蛋白是否具有抗登革病毒感染能力。另一方面，本实验利用逆转录病 毒系统构建稳定高表达IFITM3蛋白的293T细胞系，并且利用超速分级离心技术成功获得 了 293T-IFITM3细胞系上清中的外泌体，应用透射电镜技术、质谱技术等方法证明上清中 的IFITM蛋白是外泌体形式，应real time RT-PCR技术证明IFITM3蛋白的外泌体形式的 高效抗登革病毒活性。由此提出了以IFITM3包装的新型内源性外泌体应用于抗登革病毒 治疗的新策略。
[0012] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果： 本发明所提供的外泌体可以传递宿主细胞抗病毒蛋白，从而为新型抗病毒药物的开发 和机体天然免疫机制的研宄开拓了新的方向，可对未来的病毒性病原体所致的疾病的防治 提供新的线索与思路。同时，抗病毒蛋白外泌体是否可以代替干扰素直接应用于抗病毒药 物研发，这将开拓人源性抗病毒蛋白在抗病毒防治的临床应用新领域。
【附图说明】
[0013] 图1是一系列易感细胞感染登革病毒后E蛋白的表达情况以及感染后IFITM3蛋 白的表达变化情况的电泳图； 图2是稳定高表达外源性IFITM1，2, 3的U937-IFITM1，2, 3细胞的建立并经电泳证实 的结果图； 图3是流式细胞仪检测外源性稳定高表达IFITM1、IFITM2、IFITM3蛋白对U937细胞的 抗登革病毒感染作用的结果图； 图4是IFITM内源性高表达的HUVEC的培养基上清中存在IFITM3蛋白的电泳鉴定图； 图5是所述外泌体的透射电子电镜观察鉴定结果图； 图6是所述外泌体中存在IFITM3蛋白的电泳结果图； 图7是所述外泌体中存在IFITM3蛋白质谱技术鉴定结果图； 图8是所述IFITM3外泌体处理HeLa细胞内的IFITM3蛋白变化电泳结果图； 图9是所述IFITM3外泌体处理后HeLa细胞内的IFITM3蛋白变化的时间-效应电泳 结果图； 图10是Real time RT-PCR方法检测细胞内感染的DENV RNA结果图； 图11是Real time RT-PCR方法检测培养基上清中的DENV RNA结果图。
【具体实施方式】
[0014] 下面结合一些【具体实施方式】对本发明做进一步解释和说明。具体实施例为进一步 详细说明本发明，非限定本发明的保护范围。
[0015] 实施例1 :pMSCV-IFITM重组质粒的构建、鉴定及提取 从 GenBank 数据库下载 IFITMl、IFITM2、IFITM3 基因序列，利用 Primer Premier 5. 0 软件自行设计一对引物扩增全长IFITM1/2/3基因，引物由上海英俊生物公司合成，引物系 列如下：正向引物序列如下：GGAAGATCTGCCATGAATCACACTGTCCAAACCTTC ;反向引物序列如 下：CCGGAATTCCTAAGCGTAGTCTGGGACGTCGTATGGGTATCCATAGGCCTGGAAGATCAG 〇
[0016] 利用Trizol法提取细胞总RNA后，以核酸蛋白定量仪分别测定RNA浓度，根据所 测得的浓度，将全部RNA用无 RNA酶的水稀释成终浓度为1 μ g/μ 1。我们利用提取到的细 胞RNA得到IFITM1/2/3基因的cDNA产物，再根据PCR扩增产物，反应条件如下：94 °C预变 性 5 min;94 °C变性 30 s，55 °C 30 s，72 °C 60 s，30 个循环；72 °C延伸 7 min。将所有 扩增产物用I. 5 %琼脂糖凝胶(含终浓度为0. 5 μ g/ml的EB)电泳并切胶回收纯化。
[0017] 利用 QIAprep spin miniprep kit 抽提质粒，将 pMSCV 质粒 DNA 与 IFITM1/2/3 基 因片段PCR产物进行双酶切反应和连接，在200 μ I DH5a感受态细菌中加入10 μ 1连接 产物中，37 °C培养箱中，倒置平板培养12?16 h至长出菌落。最后挑取单菌落接种于3 ml含氨苄青霉素（50 μ g/ml)的LB培养液中，37 °C 300 rpm摇菌过夜。