一种抗脂质过氧化物的制备方法和用图
【专利摘要】本发明公开了一种抗脂质过氧化物的制备方法，包括以下步骤：取干燥的红曲霉发酵样品，加入提取溶剂，采用浸提法提取得到粗提品，然后采用柱层析洗脱粗提品得到纯化洗脱液，对所述纯化洗脱液进行硅胶薄层层析，将相同硅胶薄层层析结果的洗脱液合并再次进行柱层析洗脱得到抗脂质过氧化物。本发明首次提供了以红曲霉为原料制备抗脂质过氧化物，本发明先将红曲霉洋品粗提品进行萃取，进一步根据性分布情况和在不同溶剂中的溶解度筛选最佳的柱层析洗脱剂，使其有效分离纯化出抗脂质过氧化物。本发明的制备方法简单、易实现、耗时短，且原料易得成本低，实现抗脂质过氧化物的批量生产。
【专利说明】
一种抗脂质过氧化物的制备方法和用途
技术领域
[0001]本发明涉及留醇类化合物提取技术领域，具体涉及一种抗脂质过氧化物的制备方法和用途。
【背景技术】
[0002]自由基是指在外层轨道上具有未成对电子的原子或分子。它们具有极不稳定、非常活泼的特点，是细胞进行正常有氧代谢的产物，大部分以活性氧(ROS)的形式存在。自由基一旦产生，大部分的自由基会被细胞内抗氧化防御系统(酶和非酶分子)清除。自由基与抗氧化防御系统之间平衡的维持是生物体正常运作必不可少的条件。ROS在低等或中等浓度下，对机体是有益的，它参与细胞在生理过程中的信号转导与调节然而，在ROS产生过多或是抗氧化防御系统功能下降的情况下，ROS和抗氧化防御系统之间的平衡被打破。在这种情况下，过量的ROS会氧化损伤脂质，蛋白质和DNA，导致其变性，影响其正常功能的发挥。
[0003]在癌细胞中，ROS产生的增加与转录因子不断的被激活有关。此外，最近的一项研究发现，通过NF-kB的激活，线粒体中ROS的产生增加，TLR4被激活，促进胃癌产生。在胃癌细胞中，致癌信号使ROS的产生增加，促进胃癌细胞转移。研究报道，原癌基因遗传方面的不稳定性，ROS的产生导致DNA损伤和p53功能的退化。突变的Ras2通过限制线粒体呼吸链到非磷酸化状态来促进氧化应激。K-ras基因也通过ROS介导的JNK激活促进癌变。ROS和4RaclB参与MMP-3介导的上皮间充质干细胞的转化。ROS刺激了Snail转录因子的表达，引起DNA损伤和因损伤造成的基因组不稳定。研究指出，NADPH氧化酶和NADPH氧化酶介导的ROS的产生对癌症发生的影响。ROS的增加可引起JNK与GST-Ji转移酶之间的联结断裂，促进JNK的活化。另夕卜，H202介导JNK活化的同时，也使JNK磷酸酶水平下调。
[0004]氧化应激在胃肠道疾病的发病机制中起着重要的作用，包括粘膜损害，胃肠溃疡和癌症。胃溃疡可由不同的诱因造成，如非留体类抗炎药(NSAIDs)，热应力，乙醇和幽门螺杆菌感染等会致使大量自由基(尤其是OH.)的产生，从而导致氧化损伤与进一步的胃粘膜损伤。此外，胃肠疾病与氧化应激和氧化剂的水平增加密切相关，如谷胱甘肽，脂质过氧化，蛋白羰基，髓过氧化物酶。此外，病原体能直接参与加重氧化应激，例如，研究报道彻底根除幽门螺杆菌可以减轻胃粘膜的氧化应激水平。
[0005]患有典型胃肠道炎症，如溃疡性结肠炎，肝炎，幽门螺杆菌感染等的患者，更易得癌症，原因尚不清楚。炎症和因此伴随的氧化应激的升高可能是加重慢性炎症和诱导恶性转化的重要因素。转基因小鼠在肝内表达乙型肝炎病毒蛋白，伴随着8-oxo-dG表达水平升高发展成慢性肝炎，最终导致肝癌。在恶性肿瘤中，炎症的产生常伴有氧化应激水平的升高。研究发现胃癌患者的脂质过氧化水平明显升高。与正常组相比，虽然术后总抗氧化能力明显降低，但胃癌患者无论是在术前还是在术后体内均有较高的过氧化物酶活性。胃相关方面的癌症与蛋白氧化水平提高密切相关，虽然在幽门螺杆菌IgG抗体阳性和阴性的胃癌患者中的氧化应激参数和抗氧化酶活性没有显现差异性。
[0006]氧自由基反应和脂质过氧化反应在机体的新陈代谢过程中起着重要的作用，正常情况下两者处于协调与动态平衡状态，维持着体内许多生理生化反应和免疫反应。一旦这种协调与动态平衡产生紊乱与失调，就会引起一系列的新陈代谢失常和免疫功能降低，形成氧自由基连锁反应，损害生物膜及其功能，以致形成细胞透明性病变、纤维化，大面积细胞损伤造成进神经、组织、器官等损伤。这种反应就叫脂质过氧化。脂质过氧化过程中发生的ROS氧化生物膜的过程，S卩ROS与生物膜的磷脂、酶和膜受体相关的多不饱和脂肪酸的侧链及核酸等大分子物质起脂质过氧化反应形成脂质过氧化产物如丙二醛和4-羟基壬烯酸，从而使细胞膜的流动性和通透性发生改变，终导致细胞结构和功能的改变。由此可见，制备一种具有抗脂质过氧化活性的药物对于医药技术领域十分重要，目前已成为本领域技术人员的研究热点。目前针对制备抗脂质过氧化物的方法较少，现有的针对抗脂质过氧化物的反应条件仍不够温和，且需要制备时间长，选择的菌株在制备抗脂质过氧化物时产量仍不够尚。
[0007]由此可见，能否针对上述不足，提供一种抗脂质过氧化物的制备方法和用途，使其方法简单，易实现，且原料易得成本低，实现抗脂质过氧化物的批量生产，成为本领域技术人员亟待解决的技术难题。
【发明内容】
[0008]本发明为了解决上述技术问题，提供一种抗脂质过氧化物的制备方法和用途，其包括以下技术方案:
[0009]—种抗脂质过氧化物的制备方法，包括采用红曲霉发酵样品作为原料提取的步骤。
[0010]首次提供了以红曲霉为原料制备抗脂质过氧化物的方法，使其区别于现有技术中的制备方法，并且具有制备步骤简单，有效实现抗脂质过氧化物的批量生产。
[0011]进一步的，包括以下步骤:取干燥的红曲霉发酵样品，加入提取溶剂，采用浸提法提取得到粗提品，然后采用柱层析洗脱粗提品得到纯化洗脱液，对所述纯化洗脱液进行硅胶薄层层析，将相同硅胶薄层层析结果的洗脱液合并得到抗脂质过氧化物。
[0012]浸渍法适用于粘性药材、无组织结构的药材、新鲜及易于膨胀的药材、价格低廉的芳香性药材的浸提。而浸渍法中的热浸渍法指将中草药溶解于溶剂中，有效作用成分通过水浴或蒸汽加热达40 0C?60 0C提取出来。
[0013]进一步的，所述的提取溶剂为水，所述的红曲霉发酵样品与所述提取溶剂的体积比为I?3:10?12;所述浸提法包括以下步骤:于12000r.min—1条件下60V浸提12h；所述柱层析洗脱的方法为极性梯度洗脱。
[0014]红曲霉样品粗提品成分较复杂，在对其抗脂质过氧化活性物质进行分离纯化时，要尽量得到单一组分，为避免活性物质交叉洗脱下来，所以采用极性梯度洗脱。
[0015]进一步的，所述的极性梯度洗脱的方法包括以下步骤:
[0016]步骤一:拌样:将所述粗提品浓缩后得到的浸膏，采用溶剂充分溶解，加入中性氧化铝至溶剂挥发且析出的固体吸附在硅胶上；
[0017]步骤二:装柱:采用湿法装柱得到中性氧化铝柱；
[0018]步骤三:上样:将步骤一拌好的样品倒入中性氧化铝柱中后，加入石英砂，并在柱顶端塞入脱脂棉；
[0019]步骤四:洗脱:采用洗脱剂按极性由小至大进行梯度洗脱，收集洗脱液，所述洗脱剂分别包括乙酸乙酯和甲醇的纯溶液以及乙酸乙酯和甲醇的混合溶液。
[0020]本发明通过柱层析洗脱及筛选实验，得到在粗提品中，乙酸乙酯居中，甲醇极性较大，故选用乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱。
[0021]进一步的，所述步骤一中的溶剂为乙酸乙酯，加入的所述中性氧化铝与所述浸膏等体积;湿法装柱包括以下步骤:称取中性氧化铝装柱悬于乙酸乙酯中，不断搅拌溶胀去除气泡后得到悬液，将悬液匀速倒入底部塞有棉花的层析柱中，打开底阀使液体流出。
[0022]进一步的，所述乙酸乙酯和甲醇的混合溶液分别包括体积比为10:1、9:1、8:1、7:
1、6:1、5:1、3:1和1:1的混合溶液;每个所述洗脱剂冲洗5个柱体积。
[0023]进一步的，所述的洗脱剂分别包括乙酸乙酯和甲醇按体积比为10:1、9:1和8:1的混合溶液。
[0024]当采用上述的混合溶液作为洗脱剂时，洗脱出的成分脂质过氧化抑制率更高。
[0025]其中，柱体积=(拌样硅胶+空白硅胶)X7/3。
[0026]采用上述体积比的洗脱剂进行柱层析洗脱时，能够有效分离纯化出抗脂质过氧化物。
[0027]进一步的，所述的硅胶薄层层析中的展开剂为体积比为12?0.5:1的石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂。优选地，所述的硅胶薄层层析中的展开剂为体积比为2:1的石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂。
[0028]当所述展开剂为体积比为12?0.5:1的石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂时，层析效果好，结果清晰，能够得到抗脂质过氧化物的组分带。
[0029]—种抗脂质过氧化物的用途，所述的抗脂质过氧化物在制备抗脂质过氧化活性药物中的应用。
[0030]本发明所制备的抗脂质过氧化物经过进一步抗脂质过氧化活性检测，证明产物能够在制备抗脂质过氧化活性的药物中使用。
[0031]采用上述技术方案，包括以下有益效果:本发明首次提出了以红曲霉为原料制备具有抗脂质过氧化作用的物质，首次提供了以红曲霉为原料制备抗脂质过氧化物，本发明先将红曲霉洋品粗提品进行萃取，进一步根据性分布情况和在不同溶剂中的溶解度筛选最佳的柱层析洗脱剂，使其有效分离纯化出抗脂质过氧化物。本发明的制备方法简单、易实现、耗时短，且原料易得成本低，实现抗脂质过氧化物的批量生产。
【附图说明】
[0032]图1为本发明不同溶剂提取物的脂质过氧化抑制率数据图；
[0033]图2为本发明萃取的各部分抗脂质过氧化活性数据图；
[0034]图3为本发明组分一的薄层层析结果图；
[0035]图4为本发明柱层析得到组分一的抗脂质过氧化活性数据图。
【具体实施方式】
[0036]下面通过具体的实施例对本发明做进一步的详细描述。
[0037]实施例一:一种抗脂质过氧化物的制备方法，包括采用红曲霉发酵样品作为原料提取的步骤。
[0038]实施例二:一种抗脂质过氧化物的用途，所述的抗脂质过氧化物在制备抗脂质过氧化活性的药物中使用。
[0039]实施例三:一种抗脂质过氧化物的制备方法，包括以下步骤:取干燥的红曲霉发酵样品，加入提取溶剂，采用浸提法提取得到粗提品，然后采用柱层析洗脱粗提品得到纯化洗脱液，对所述纯化洗脱液进行硅胶薄层层析，将相同硅胶薄层层析结果的洗脱液合并得到抗脂质过氧化物。
[0040]—种抗脂质过氧化物的用途，所述的抗脂质过氧化物在制备抗脂质过氧化活性药物中的应用。
[0041]实施例四:一种抗脂质过氧化物的制备方法，包括以下步骤:取干燥的红曲霉发酵样品，加入10倍体积的水，于12000r.π?η—1条件下60°C浸提12h，提取得到粗提品，然后采用柱层析极性梯度洗脱粗提品得到纯化洗脱液，对所述纯化洗脱液进行硅胶薄层层析，将相同硅胶薄层层析结果的洗脱液合并得到抗脂质过氧化物。
[0042]—种抗脂质过氧化物的用途，所述的抗脂质过氧化物在制备抗脂质过氧化活性药物中的应用。
[0043]实施例五:一种抗脂质过氧化物的制备方法，包括以下步骤:取干燥的红曲霉发酵样品，加入12倍体积的水，于12000r.π?η—1条件下60°C浸提12h，提取得到粗提品，然后采用柱层析极性梯度洗脱粗提品得到纯化洗脱液，对所述纯化洗脱液进行硅胶薄层层析，将相同硅胶薄层层析结果的洗脱液合并得到抗脂质过氧化物。
[0044]所述的极性梯度洗脱的方法包括以下步骤:
[0045]步骤一:拌样:将所述粗提品浓缩后得到的浸膏，采用溶剂充分溶解，加入中性氧化铝至溶剂挥发且析出的固体吸附在硅胶上；
[0046]步骤二:装柱:采用湿法装柱得到中性氧化铝柱；
[0047]步骤三:上样:将步骤一拌好的样品倒入中性氧化铝柱中后，加入石英砂，并在柱顶端塞入脱脂棉；
[0048]步骤四:洗脱:分别以乙酸乙酯和甲醇的纯溶液、乙酸乙酯和甲醇的混合溶液作为洗脱剂按极性由小至大进行梯度洗脱，收集洗脱液。
[0049]—种抗脂质过氧化物的用途，所述的抗脂质过氧化物在制备抗脂质过氧化活性药物中的应用。
[0050]实施例六:一种抗脂质过氧化物的制备方法，包括以下步骤:取干燥的红曲霉发酵样品，加入水，所述红曲霉发酵样品与所述提取溶剂的体积比为3:10，于12000r.min—1条件下60°C浸提12h，提取得到粗提品，然后采用柱层析极性梯度洗脱粗提品得到纯化洗脱液，对所述纯化洗脱液进行硅胶薄层层析，将相同硅胶薄层层析结果的洗脱液合并得到抗脂质过氧化物。
[0051 ]所述的极性梯度洗脱的方法包括以下步骤:
[0052]步骤一:拌样:将水提浓缩后得到的浸膏，用乙酸乙酯充分溶解，置于平皿内，加入等体积的中性氧化铝搅拌至溶剂挥发，物质均匀吸附在硅胶上，中性氧化铝颗粒松散不黏着；
[0053]步骤二:装柱:采用湿法装柱，称取300g中性氧化铝装柱，所述中性氧化铝的体积与柱的体积比为1:20，悬于100ml乙酸乙酯，不断搅拌溶胀去除气泡后，将悬液匀速缓慢地倒入底部塞有棉花的层析柱中，打开底阀使液体流出，吸附剂均匀下降，并适当振动，利于排气，避免分层；
[0054]步骤三:上样:以中性氧化铝拌好的样品缓慢倒入装好的中性氧化铝柱中，使其均匀平整地铺在柱上，后加入适量石英砂，并在在柱顶端塞入脱脂棉，以防止溶剂的加入对于样品的冲击；
[0055]步骤四:洗脱:分别以乙酸乙酯和甲醇纯溶液，以及乙酸乙酯和甲醇纯的混合溶液作为洗脱剂按极性由小至大进行梯度洗脱，收集洗脱液。
[0056]—种抗脂质过氧化物的用途，所述的抗脂质过氧化物在制备抗脂质过氧化活性药物中的应用。
[0057]实施例七:一种抗脂质过氧化物的制备方法，包括以下步骤:取干燥的红曲霉发酵样品，加入水，所述红曲霉发酵样品与所述提取溶剂的体积比为3:12，于12000r.min—1条件下60°C浸提12h，提取得到粗提品，然后采用柱层析极性梯度洗脱粗提品得到纯化洗脱液，对所述纯化洗脱液进行硅胶薄层层析，将相同硅胶薄层层析结果的洗脱液合并得到抗脂质过氧化物。
[0058]所述的极性梯度洗脱的方法包括以下步骤:
[0059]步骤一:拌样:将水提浓缩后得到的浸膏，用乙酸乙酯充分溶解，置于平皿内，加入等体积的中性氧化铝搅拌至溶剂挥发，物质均匀吸附在硅胶上，中性氧化铝颗粒松散不黏着；
[0060]步骤二:装柱:采用湿法装柱，称取300g中性氧化铝装柱，所述中性氧化铝的体积与柱的体积比为1:20，悬于100ml乙酸乙酯，不断搅拌溶胀去除气泡后，将悬液匀速缓慢地倒入底部塞有棉花的层析柱中，打开底阀使液体流出，吸附剂均匀下降，并适当振动，利于排气，避免分层；
[0061 ]步骤三:上样:以中性氧化铝拌好的样品缓慢倒入装好的中性氧化铝柱中，使其均匀平整地铺在柱上，后加入适量石英砂，并在在柱顶端塞入脱脂棉，以防止溶剂的加入对于样品的冲击；
[0062]步骤四:洗脱:分别以乙酸乙酯和甲醇纯溶液，以及乙酸乙酯和甲醇纯的混合溶液作为洗脱剂按极性由小至大进行梯度洗脱，收集洗脱液。所述乙酸乙酯和甲醇的混合溶液分别包括体积比为10:1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、3:1和1:1的混合溶液;每个所述洗脱剂冲洗5个柱体积。
[0063]所述的硅胶薄层层析的方法包括以下步骤:
[0064]步骤一:点样:将层析板水平放置，用内径小于1mm，管口平整的洁净毛细管将收集的洗脱成分逐个点在层析板一端的同一水平线上，样品间距离大于5mm。
[0065]步骤二:饱和:将预先配好的展开剂适量倒入层析缸，盖严后静置5-10min，使层析缸中溶剂挥发气体饱和均匀。
[0066]步骤三:展开:将点好样的层析板放入层析缸中展开，使展开剂浸没薄板下端，但未达到点样线，密闭层析缸进行展开，当展开剂从层析板下端慢慢扩散到前沿，距顶端5-1Omm时，取出层析板，用铅笔标记溶剂前沿位置。
[0067]步骤四:观察、显色、定性:层析板上溶剂挥干后进行观察，GF254硅胶板可置于紫外分析仪下直接观察;有些物质在紫外分析仪下无荧光斑点，即均匀喷洒10%硫酸乙醇溶液，用高温枪烘烤至显色，标记点的位置，测量，计算比移值(Rf值)。
[0068]步骤五:展开剂的选择:配制不同极性的展开剂，分别对样品进行薄层层析，经过观察和计算Rf值后，选择展开后组分斑点圆且集中，不同组分斑点明显分开，Rf值范围为0.2-0.8的展开剂为最佳。最终得到体积比为12:1的石油醚和乙酸乙酯、体积比为1: 2的石油醚和乙酸乙酯，经硅胶板薄层层析分析，10%硫酸乙醇显色观察。
[0069]—种抗脂质过氧化物的用途，所述的抗脂质过氧化物在制备抗脂质过氧化活性药物中的应用。
[0070]实施例八:一种抗脂质过氧化物的制备方法，包括以下步骤:取干燥的红曲霉发酵样品，加入10倍体积的水，于12000r.π?η—1条件下60°C浸提12h，提取得到粗提品，然后采用柱层析极性梯度洗脱粗提品得到纯化洗脱液，对所述纯化洗脱液进行硅胶薄层层析，将相同硅胶薄层层析结果的洗脱液合并得到抗脂质过氧化物。
[0071 ]所述的极性梯度洗脱的方法包括以下步骤:
[0072]步骤一:拌样:将水提浓缩后得到的浸膏，用乙酸乙酯充分溶解，置于平皿内，加入等体积的中性氧化铝搅拌至溶剂挥发，物质均匀吸附在硅胶上，中性氧化铝颗粒松散不黏着；
[0073]步骤二:装柱:采用湿法装柱，称取300g中性氧化铝装柱，所述中性氧化铝的体积与柱的体积比为1:20，悬于100ml乙酸乙酯，不断搅拌溶胀去除气泡后，将悬液匀速缓慢地倒入底部塞有棉花的层析柱中，打开底阀使液体流出，吸附剂均匀下降，并适当振动，利于排气，避免分层；
[0074]步骤三:上样:以中性氧化铝拌好的样品缓慢倒入装好的中性氧化铝柱中，使其均匀平整地铺在柱上，后加入适量石英砂，并在在柱顶端塞入脱脂棉，以防止溶剂的加入对于样品的冲击；
[0075]步骤四:洗脱:分别以乙酸乙酯和甲醇按体积比为10:1、9:1和8:1的混合溶液作为洗脱剂按极性由小至大进行梯度洗脱;每个所述洗脱剂冲洗5个柱体积。
[0076]所述的硅胶薄层层析的方法包括以下步骤:
[0077]步骤一:点样:将层析板水平放置，用内径小于1mm，管口平整的洁净毛细管将收集的洗脱成分逐个点在层析板一端的同一水平线上，样品间距离大于5mm。
[0078]步骤二:饱和:将预先配好的展开剂适量倒入层析缸，盖严后静置5-10min，使层析缸中溶剂挥发气体饱和均匀。
[0079]步骤三:展开:将点好样的层析板放入层析缸中展开，使展开剂浸没薄板下端，但未达到点样线，密闭层析缸进行展开，当展开剂从层析板下端慢慢扩散到前沿，距顶端5-1Omm时，取出层析板，用铅笔标记溶剂前沿位置。
[0080]步骤四:观察、显色、定性:层析板上溶剂挥干后进行观察，GF254硅胶板可置于紫外分析仪下直接观察;有些物质在紫外分析仪下无荧光斑点，即均匀喷洒10%硫酸乙醇溶液，用高温枪烘烤至显色，标记点的位置，测量，计算比移值(Rf值)。
[0081]步骤五:展开剂的选择:配制不同极性的展开剂，分别对样品进行薄层层析，经过观察和计算Rf值后，选择展开后组分斑点圆且集中，不同组分斑点明显分开，Rf值范围为0.2-0.8的展开剂为最佳。最终得到体积比为12:1的石油醚和乙酸乙酯、体积比为1:2的石油醚和乙酸乙酯，经硅胶板薄层层析分析，10%硫酸乙醇显色观察。
[0082]—种抗脂质过氧化物的用途，所述的抗脂质过氧化物在制备抗脂质过氧化活性药物中的应用。
[0083]不同溶剂的脂质过氧化抑制率检测:
[0084]一、实验方法:
[0085]1、粗提品的卒取:
[0086](I)乙酸乙酯萃取水提物
[0087]分别取定量未干燥的药性菌质，加入10倍体积水，60°C浸提12h，12000r.min—S离心15min，取上清液200ml置于500mL分液漏斗中，加入200mL乙酸乙酯，充分振摇萃取，静置，待溶液完全分层后，放出上层的萃取液，下层的浸提液用同法再萃取2次，每次加萃取剂200mL，3次萃取剂合并，在低于60°C下减压回收萃取剂，旋干后，使溶剂自然挥干，得到水提乙酸乙酯萃取物。下层的浸提液在低于60°C下减压回收，旋干后，使溶剂自然挥干，得到乙酸乙酯萃取后剩余的水层。
[0088](2)氯仿萃取水提物
[0089]分别取定量未干燥的药性菌质，分别加入10倍体积的水，60°C浸提12h，12000r.min—S离心15min，取上清液200ml置于500mL分液漏斗中，分别加入200mL氯仿，充分振摇萃取，静置，待溶液完全分层后，放出下层的萃取液，上层的浸提液用同法再萃取2次，每次加萃取剂200mL，3次萃取剂合并，在低于60°C下减压回收萃取剂，旋干后，得到水提氯仿萃取物。上层的浸提液合并，在低于60°C下减压回收萃取剂，旋干后，得到氯仿萃取后剩余的水层。
[0090]2、萃取物的抗脂质过氧化待测样品的制备:称取0.4mg各部分萃取样品，用蒸馏水溶解、定容至10mL，此溶液质量浓度为8mg/mL。吸取8mg/mL溶液25、12.5、6.25、3.13、I.56、0.78,0.39mL，分别加入蒸馏水定容至25mL，样品的浓度分别为0.5、1、2、4、8mg/mL。
[0091]3、脂质过氧化抑制实验:使用鸡蛋黄匀浆液(10%，体积分数)作为反应的脂质媒介，取0.1mL上述制备的待测样品同0.5mL蛋黄匀浆液、0.4mL纯水及50yL硫酸亚铁溶液(FeSO4.7H20，70mmol/L)混合，37°C孵育30min，迅速加入1.5mL乙酸溶液(20%，体积分数，pH值3.5)及1.5mL硫代巴比妥酸溶液(0.8%，质量浓度，用1.1 %十二烷基硫酸钠溶液配制)，高速混匀后95 0C水浴60min。待反应混合物冷却至室温，加入5mL正丁醇，摇匀，混合物5000r/min离心15min，取上清液测定其在532nm处的吸光度，纯水做空白对照。
[0092]计算方法如下式:
[0093]脂质过氧化抑制率(% ) = (1-实验组吸光度/空白组吸光度)X 100%。
[0094]二、实验结果:
[0095]检测结果见图1，结果表明水提物抗脂质过氧化活性最高，其次为30%乙醇提取物，随着乙醇浓度的增加，提取物脂质过氧化抑制率逐渐降低，30%乙醇提取物、70%乙醇提取物、90 %乙醇提取物与水提物抑制率差异具极显著性(p< 0.0I)，水提物与50 %醇提物相比差异具显著性(P<0.05)，直到浓度增至90%乙醇时提取液的脂质过氧化抑制率增加，与70%乙醇提取物、90%乙醇提取物相比差异不具显著性(p>0.05)，而水和90%乙醇浓度相差较大，提取出的活性物质组成相差也较大。因此将水和乙醇作为提取剂进行提取所得到的产物，均具有抗脂质过氧化的功能。而以水作为溶剂以红曲霉为原料提取抗脂质过氧化物的含量最高，效果最好。
[0096]水提取的粗提品的卒取:
[0097]1、乙酸乙酯萃取水提物
[0098]红曲霉样品的水提物经乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯萃取物标记为(i)。下层得到乙酸乙酯萃取后剩余的水层标记为(ii)。如图2所示，每组柱状部分，从左至右红曲霉样品的水提物的浓度依次为811^/1111、411^/1111、211^/1111、111^/1111、0.511^/1111，从图2中看出，部分(；0无抗脂质过氧化活性，而部分(ii)在浓度为8mg/ml时的脂质过氧化抑制率达到了 87.08%，说明水提物中提取出的活性物质与乙酸乙酯相比，二者的互溶性不强或是极性相差较大，乙酸乙酯无法从水提物中萃取出活性物质。
[0099]2、氯仿萃取水提物
[0100]红曲霉样品的水提物经氯仿萃取得到氯仿萃取物，标记为:(iv)。上层得到氯仿萃取后剩余的水层，标记为:(iii)。从图2中看出，部分(iii)在浓度为8mg/ml时的脂质过氧化抑制率为63.92%,部分(iv)为75.42%,部分(iv)的脂质过氧化抑制率大于部分(i ii)，差异具极显著性(P<0.01)。说明水提出的活性物质与氯仿较易互溶，氯仿萃取出了一部分活性物质，但大部分活性物质仍然于水提物中。
[0101]柱层析洗脱剂的选择:
[0102]1、水提浸膏在不同溶剂中的溶解情况:取少许药性菌质的水提浸膏分别经石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇溶解，考察浸膏在不同溶剂中的溶解情况，结果表明浸膏在乙酸乙酯中的溶解性较好。
[0103]2、样品在TLC展开剂中分离情况:根据浸膏在不同溶剂中溶解度的考察以及极性分布情况的考察，
[0104]选取不同极性配比的乙酸乙酯和甲醇分别对水提浸膏进行薄层层析，经过多次薄层层析结果分析后，在不同配比的展开剂比例下，水提样品的薄层层析，表明水提样品中的物质非常复杂，不同极性段均有物质。但在水提样品在同一极性条件(石油醚:乙酸乙酯=20:1)，比移值范围不同。
[0105]3、柱层析洗脱剂的确定:红曲霉样品粗提品成分较复杂，在对其抗脂质过氧化活性物质进行分离纯化时，要尽量得到单一组分，为避免活性物质交叉洗脱下来，所以采用极性梯度洗脱。根据上述抗脂质过氧化活性物质的极性分布情况，综合考虑样品在溶剂中溶解度，样品在TLC展开剂中分离情况，溶剂的极性等选定洗脱剂。在水提粗提品中，甲醇极性较大，故采用乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱。
[0106]洗脱液薄层层析展开剂的选择:
[0107]对洗脱液进行硅胶薄层分析时，可根据不同阶段洗脱下来的组分的极性来选择展开剂。对得到组分、化合物进行硅胶薄层分析时，试验性地选择各种配比展开剂，经过观察和计算Rf值后，选择展开后组分斑点圆且集中，Rf值范围为0.2-0.8的展开剂。
[0108]粗提品首次柱层析纯化结果:
[0109]水粗提品经中性氧化铝柱层析，将相同薄层层析洗脱部分合并，分别选用按体积比为2:1的石油醚和乙酸乙酯的混合溶液作为展开剂，经硅胶板薄层层析分析，10%硫酸乙醇显色观察，得到组分带，记为组分一，薄层层析结果如图3所示。
[0110]4、柱层析得到的各组分抗脂质过氧化活性:
[0111]柱层析得到的各组分的脂质过氧化抑制率如下图4，图4中组分一和VC组中的柱状数据中，指抗脂质过氧化物的浓度从左至右依次为25口8/1111、5(^8/1111、10(^8/1111，组分一的抗脂质过氧化效果随着抗脂质过氧化物的浓度的增加而上升，在浓度达到lOOyg/ml时，月旨质过氧化抑制率最高。这说明红霉素提取出抗脂质过氧化活性物质具有较高脂质过氧化抑制率且大部分属于中等极性的物质。
[0112]以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1.一种抗脂质过氧化物的制备方法，其特征在于，包括采用红曲霉发酵样品作为原料提取的步骤。2.根据权利要求1所述的一种抗脂质过氧化物的制备方法，包括以下步骤:取干燥的红曲霉发酵样品，加入提取溶剂，采用浸提法提取得到粗提品，然后采用柱层析洗脱粗提品得到纯化洗脱液，对所述纯化洗脱液进行硅胶薄层层析，将相同硅胶薄层层析结果的洗脱液合并得到抗脂质过氧化物。3.根据权利要求2所述的一种抗脂质过氧化物的制备方法，其特征在于，所述浸提法包括以下步骤:于12000r.min—1条件下60°C浸提12h。4.根据权利要求2所述的一种抗脂质过氧化物的制备方法，其特征在于，所述的提取溶剂为水，所述的红曲霉发酵样品与所述提取溶剂的体积比为I?3:10?12;所述柱层析洗脱的方法为极性梯度洗脱。5.根据权利要求4所述的一种抗脂质过氧化物的制备方法，其特征在于，所述的极性梯度洗脱的方法包括以下步骤: 步骤一:拌样:将所述粗提品浓缩后得到的浸膏，采用溶剂充分溶解，加入中性氧化铝至溶剂挥发且析出的固体吸附在硅胶上； 步骤二:装柱:采用湿法装柱得到中性氧化铝柱； 步骤三:上样:将步骤一拌好的样品倒入中性氧化铝柱中后，加入石英砂，并在柱顶端塞入脱脂棉； 步骤四:洗脱:采用洗脱剂按极性由小至大进行梯度洗脱，收集洗脱液，所述洗脱剂分别包括乙酸乙酯和甲醇的纯溶液以及乙酸乙酯和甲醇的混合溶液。6.根据权利要求5所述的一种抗脂质过氧化物的制备方法，其特征在于，所述步骤一中的溶剂为乙酸乙酯，加入的所述中性氧化铝与所述浸膏等体积;湿法装柱包括以下步骤:称取中性氧化铝装柱悬于乙酸乙酯中，不断搅拌溶胀去除气泡后得到悬液，将悬液匀速倒入底部塞有棉花的层析柱中，打开底阀使液体流出。7.根据权利要求5所述的一种抗脂质过氧化物的制备方法，其特征在于，所述乙酸乙酯和甲醇的混合溶液分别包括体积比为1: 1、9:1、8:1、7:1、6:1、5:1、3:1和1:1的混合溶液；每个所述洗脱剂冲洗5个柱体积。8.根据权利要求7所述的一种抗脂质过氧化物的制备方法，其特征在于，所述的洗脱剂分别包括乙酸乙酯和甲醇按体积比为10:1、9:1和8:1的混合溶液。9.根据权利要求2所述的一种抗脂质过氧化物的制备方法，其特征在于，所述的硅胶薄层层析中的展开剂为体积比为12?0.5:1的石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂。10.—种抗脂质过氧化物的用途，其特征在于，所述的抗脂质过氧化物在制备抗脂质过氧化活性药物中的应用。
【文档编号】A61K36/062GK105853470SQ201610278175
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月29日
【发明人】周礼红, 侯素媛, 倪爱欣
【申请人】周礼红