一种抗脂质过氧化物的制备方法和用图
【专利摘要】本发明公开了一种抗脂质过氧化物的制备方法，包括以下步骤：取干燥的红曲霉发酵样品，加入提取溶剂，采用浸提法提取得到粗提品，然后采用柱层析洗脱粗提品得到纯化洗脱液，对纯化洗脱液进行硅胶薄层层析，将相同硅胶薄层层析结果的洗脱液合并得到抗脂质过氧化物。本发明首次提供了以红曲霉为原料制备抗脂质过氧化物，本发明先将红曲霉洋品粗提品进行萃取，进一步根据性分布情况和在不同溶剂中的溶解度筛选最佳的柱层析洗脱剂，使其有效分离纯化出抗脂质过氧化物。本发明的制备方法简单、易实现、耗时短，且原料易得成本低，实现抗脂质过氧化物的批量生产。
【专利说明】
一种抗脂质过氧化物的制备方法和用途
技术领域
[0001] 本发明涉及化合物提取技术领域，具体涉及一种抗脂质过氧化物的制备方法和用 途。
【背景技术】
[0002] 自由基是指在外层轨道上具有未成对电子的原子或分子。它们具有极不稳定、非 常活泼的特点，是细胞进行正常有氧代谢的产物，大部分以活性氧(R0S)的形式存在。自由 基一旦产生，大部分的自由基会被细胞内抗氧化防御系统(酶和非酶分子)清除。自由基与 抗氧化防御系统之间平衡的维持是生物体正常运作必不可少的条件。R0S在低等或中等浓 度下，对机体是有益的，它参与细胞在生理过程中的信号转导与调节然而，在R0S产生过多 或是抗氧化防御系统功能下降的情况下，R0S和抗氧化防御系统之间的平衡被打破。在这种 情况下，过量的R0S会氧化损伤脂质，蛋白质和DNA，导致其变性，影响其正常功能的发挥。
[0003] 在癌细胞中，R0S产生的增加与转录因子不断的被激活有关。此外，最近的一项研 究发现，通过NF-kB的激活，线粒体中R0S的产生增加，TLR4被激活，促进胃癌产生。在胃癌细 胞中，致癌信号使R0S的产生增加，促进胃癌细胞转移。研究报道，原癌基因遗传方面的不稳 定性，R0S的产生导致DNA损伤和p53功能的退化。突变的Ras2通过限制线粒体呼吸链到非磷 酸化状态来促进氧化应激。K-ras基因也通过R0S介导的JNK激活促进癌变。R0S和4RaclB参 与MMP-3介导的上皮间充质干细胞的转化。R0S刺激了Snail转录因子的表达，引起DNA损伤 和因损伤造成的基因组不稳定。研究指出，NADPH氧化酶和NADPH氧化酶介导的R0S的产生对 癌症发生的影响。R0S的增加可引起JNK与GST-Ji转移酶之间的联结断裂，促进JNK的活化。另 外，H202介导JNK活化的同时，也使JNK磷酸酶水平下调。
[0004] 氧化应激在胃肠道疾病的发病机制中起着重要的作用，包括粘膜损害，胃肠溃疡 和癌症。胃溃疡可由不同的诱因造成，如非留体类抗炎药(NSAIDs)，热应力，乙醇和幽门螺 杆菌感染等会致使大量自由基(尤其是0H* )的产生，从而导致氧化损伤与进一步的胃粘膜 损伤。此外，胃肠疾病与氧化应激和氧化剂的水平增加密切相关，如谷胱甘肽，脂质过氧化， 蛋白羰基，髓过氧化物酶。此外，病原体能直接参与加重氧化应激，例如，研究报道彻底根除 幽门螺杆菌可以减轻胃粘膜的氧化应激水平。
[0005] 患有典型胃肠道炎症，如溃疡性结肠炎，肝炎，幽门螺杆菌感染等的患者，更易得 癌症，原因尚不清楚。炎症和因此伴随的氧化应激的升高可能是加重慢性炎症和诱导恶性 转化的重要因素。转基因小鼠在肝内表达乙型肝炎病毒蛋白，伴随着8-oxo-dG表达水平升 高发展成慢性肝炎，最终导致肝癌。在恶性肿瘤中，炎症的产生常伴有氧化应激水平的升 高。研究发现胃癌患者的脂质过氧化水平明显升高。与正常组相比，虽然术后总抗氧化能力 明显降低，但胃癌患者无论是在术前还是在术后体内均有较高的过氧化物酶活性。胃相关 方面的癌症与蛋白氧化水平提高密切相关，虽然在幽门螺杆菌IgG抗体阳性和阴性的胃癌 患者中的氧化应激参数和抗氧化酶活性没有显现差异性。
[0006] 氧自由基反应和脂质过氧化反应在机体的新陈代谢过程中起着重要的作用，正常 情况下两者处于协调与动态平衡状态，维持着体内许多生理生化反应和免疫反应。一旦这 种协调与动态平衡产生紊乱与失调，就会引起一系列的新陈代谢失常和免疫功能降低，形 成氧自由基连锁反应，损害生物膜及其功能，以致形成细胞透明性病变、纤维化，大面积细 胞损伤造成进神经、组织、器官等损伤。这种反应就叫脂质过氧化。脂质过氧化过程中发生 的ROS氧化生物膜的过程，即ROS与生物膜的磷脂、酶和膜受体相关的多不饱和脂肪酸的侧 链及核酸等大分子物质起脂质过氧化反应形成脂质过氧化产物如丙二醛和4-羟基壬烯酸， 从而使细胞膜的流动性和通透性发生改变，终导致细胞结构和功能的改变。由此可见，制备 一种具有抗脂质过氧化活性的药物对于医药技术领域十分重要，目前已成为本领域技术人 员的研究热点。目前针对制备抗脂质过氧化物的方法较少，现有的针对抗脂质过氧化物的 反应条件仍不够温和，且需要制备时间长，选择的菌株在制备抗脂质过氧化物时产量仍不 够尚。
[0007] 由此可见，能否针对上述不足，提供一种抗脂质过氧化物的制备方法和用途，使其 方法简单，易实现，且原料易得成本低，实现抗脂质过氧化物的批量生产，成为本领域技术 人员亟待解决的技术难题。
【发明内容】
[0008] 本发明为了解决上述技术问题，提供一种抗脂质过氧化物的制备方法和用途，其 包括以下技术方案：
[0009] -种抗脂质过氧化物的制备方法，包括采用红曲霉发酵样品作为原料提取的步 骤。
[0010] 首次提供了以红曲霉为原料制备抗脂质过氧化物的方法，使其区别于现有技术中 的制备方法，并且具有制备步骤简单，有效实现抗脂质过氧化物的批量生产。
[0011] 进一步的，包括以下步骤:取干燥的红曲霉发酵样品，加入提取溶剂，采用浸提法 提取得到粗提品，然后采用柱层析洗脱粗提品得到纯化洗脱液，对所述纯化洗脱液进行硅 胶薄层层析，将相同硅胶薄层层析结果的洗脱液合并得到抗脂质过氧化物。
[0012] 浸渍法适用于粘性药材、无组织结构的药材、新鲜及易于膨胀的药材、价格低廉的 芳香性药材的浸提。而浸渍法中的热浸渍法指将中草药溶解于溶剂中，有效作用成分通过 水浴或蒸汽加热达40 °C~60 °C提取出来。
[0013] 进一步的，所述的提取溶剂为乙醇，所述的红曲霉发酵样品与所述提取溶剂的体 积比为1~3:10~12;所述浸提法包括以下步骤:于12000r ? mirT1条件下60°C浸提12h;所述 柱层析洗脱的方法为极性梯度洗脱。
[0014] 进一步的，所述的乙醇为体积分数为30%~90%的乙醇。
[0015] 红曲霉样品粗提品成分较复杂，在对其抗脂质过氧化活性物质进行分离纯化时， 要尽量得到单一组分，为避免活性物质交叉洗脱下来，所以采用极性梯度洗脱。
[0016] 进一步的，所述的极性梯度洗脱的方法包括以下步骤：
[0017]步骤一:拌样:将所述粗提品浓缩后得到浸膏，采用溶剂充分溶解，加入硅胶搅拌 至溶剂挥发且析出的固体吸附在硅胶上；
[0018]步骤二:装柱:采用湿法装柱得到硅胶柱；
[0019]步骤三:上样:将步骤一拌好的样品倒入硅胶柱中后，加入石英砂，并在柱顶端塞 入脱脂棉；
[0020] 步骤四：洗脱:采用洗脱剂按极性由小至大进行梯度洗脱，收集洗脱液，所述洗脱 剂分别包括石油醚、乙酸乙酯和甲醇的纯溶液以及石油醚、乙酸乙酯和甲醇的混合溶液混 合溶液。
[0021] 本发明通过柱层析洗脱及筛选实验，得到在粗提品中，石油醚极性较小，乙酸乙酯 居中，甲醇极性较大，故选用石油醚、乙酸乙酯和甲醇的纯溶液及混合溶液进行梯度洗脱。
[0022] 进一步的，所述步骤一中的溶剂为石油醚，加入的所述硅胶与所述浸膏等体积;湿 法装柱包括以下步骤:称取硅胶悬于石油醚中，不断搅拌溶胀去除气泡后得到悬液，将悬液 匀速倒入底部塞有棉花的层析柱中，打开底阀使液体流出。
[0023] 进一步的，所述石油醚、乙酸乙酯和甲醇的混合溶液分别包括体积比为9:1:0、7: 2 :1、6:3:1、5:4:1、4:4:2、3:6:1、2:7:1、0:9:1、0:7:3、0:5:5、0:3:7、0:1:9的混合溶液;每个 所述洗脱剂冲洗5个柱体积。
[0024]其中，柱体积=(拌样硅胶+空白硅胶)*7/3。
[0025] 进一步的，所述的洗脱剂分别包括石油醚、乙酸乙酯和甲醇的体积比为9:1:0、6: 3 :1、5:4:1、4:4:2、3:6:1和2:7:1的混合溶液。
[0026]采用上述体积比的洗脱剂进行柱层析洗脱时，能够有效分离纯化出抗脂质过氧化 物。
[0027]进一步的，所述的硅胶薄层层析中的展开剂为体积比为12~0.5:1的石油醚和乙 酸乙酯的混合溶剂。
[0028]当所述展开剂为体积比为12~0.5:1的石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂时，层析效 果好，结果清晰，能够有效分离各组分带。
[0029] -种抗脂质过氧化物的用途，所述的抗脂质过氧化物在制备抗脂质过氧化活性药 物中的应用。
[0030] 本发明所制备的抗脂质过氧化物经过进一步抗脂质过氧化活性检测，证明抗脂质 过氧化物能够在制备抗脂质过氧化活性的药物中使用。
[0031] 采用上述技术方案，包括以下有益效果:本发明首次提出了以红曲霉为原料制备 具有抗脂质过氧化作用的物质，首次提供了以红曲霉为原料制备抗脂质过氧化物，本发明 先将红曲霉洋品粗提品进行萃取，进一步根据性分布情况和在不同溶剂中的溶解度筛选最 佳的柱层析洗脱剂，使其有效分离纯化出抗脂质过氧化物。本发明的制备方法简单、易实 现、耗时短，且原料易得成本低，实现抗脂质过氧化物的批量生产。
【附图说明】
[0032]图1为本发明不同浓度乙醇提取物脂质过氧化抑制率数据图；
[0033]图2为本发明萃取的各部分抗脂质过氧化活性数据图；
[0034]图3为本发明组分一、组分二、组分三薄层层析结果图；
[0035]图4为本发明组分三、组分四、组分五薄层层析结果图；
[0036] 图5为本发明柱层析得到的各组分的抗脂质过氧化活性数据图；
[0037] 图6为本发明分离得到的化合物薄层分析图；
[0038]图7为本发明化合物H-1的MS图谱；
[0039] 图8为本发明化合物H-1的1H-NMR图谱；
[0040] 图9为本发明化合物H-1的13C-NMR图谱；
[00411图10为本发明化合物H-1的13C-NMR图谱的局部放大图。
【具体实施方式】
[0042] 下面通过具体的实施例对本发明做进一步的详细描述。
[0043] 实施例一:一种抗脂质过氧化物的制备方法，包括采用红曲霉发酵样品作为原料 提取的步骤。
[0044] 实施例二:一种抗脂质过氧化物的用途，所述的抗脂质过氧化物在制备抗脂质过 氧化活性的药物中使用。
[0045] 实施例三:一种抗脂质过氧化物的制备方法，包括以下步骤:取干燥的红曲霉发酵 样品，加入提取溶剂，采用浸提法提取得到粗提品，然后采用柱层析洗脱粗提品得到纯化洗 脱液，对所述纯化洗脱液进行硅胶薄层层析，将相同硅胶薄层层析结果的洗脱液合并得到 抗脂质过氧化物。
[0046] -种抗脂质过氧化物的用途，所述的抗脂质过氧化物在制备抗脂质过氧化活性药 物中的应用。
[0047] 实施例四：一种抗脂质过氧化物的制备方法，包括以下步骤:取干燥的红曲霉发酵 样品，加入10倍体积的体积分数为30%乙醇溶剂，于12000r ? mirT1条件下60°C浸提12h，提 取得到粗提品，采用浸提法提取得到粗提品，然后采用柱层析洗脱粗提品得到纯化洗脱液， 对所述纯化洗脱液进行硅胶薄层层析，将相同硅胶薄层层析结果的洗脱液合并得到抗脂质 过氧化物。
[0048] -种抗脂质过氧化物的用途，所述的抗脂质过氧化物在制备抗脂质过氧化活性药 物中的应用。
[0049] 实施例五:一种抗脂质过氧化物的制备方法，包括以下步骤:取干燥的红曲霉发酵 样品，加入体积分数为50%乙醇溶剂，所述的红曲霉发酵样品与体积分数为50%乙醇的体 积比为3:10,于12000r ?mirT1条件下60°C浸提12h，提取得到粗提品，然后采用浸提法提取 得到粗提品，然后采用柱层析洗脱粗提品得到纯化洗脱液，对所述纯化洗脱液进行硅胶薄 层层析，将相同硅胶薄层层析结果的洗脱液合并得到抗脂质过氧化物。
[0050] 所述的极性梯度洗脱的方法包括以下步骤：
[0051 ]步骤一:拌样:将所述粗提品浓缩后得到浸膏，采用溶剂充分溶解，加入硅胶搅拌 至溶剂挥发且析出的固体吸附在硅胶上；
[0052]步骤二:装柱:采用湿法装柱得到硅胶柱；
[0053]步骤三:上样:将步骤一拌好的样品倒入硅胶柱中后，加入石英砂，并在柱顶端塞 入脱脂棉；
[0054] 步骤四：洗脱：分别以石油醚、乙酸乙酯和甲醇的纯溶液以及石油醚、乙酸乙酯和 甲醇的混合溶液作为洗脱剂按极性由小至大进行梯度洗脱，收集洗脱液。
[0055] -种抗脂质过氧化物的用途，所述的抗脂质过氧化物在制备抗脂质过氧化活性药 物中的应用。
[0056] 实施例六:一种抗脂质过氧化物的制备方法，包括以下步骤:取干燥的红曲霉发酵 样品，加入12倍体积的体积分数为70%乙醇溶剂，于12000r ? mirT1条件下60°C浸提12h，提 取得到粗提品，然后采用浸提法提取得到粗提品，然后采用柱层析洗脱粗提品得到纯化洗 脱液，对所述纯化洗脱液进行硅胶薄层层析，将相同硅胶薄层层析结果的洗脱液合并得到 抗脂质过氧化物。
[0057]所述的极性梯度洗脱的方法包括以下步骤：
[0058]步骤一:拌样:将醇提得到粗提品浓缩后得到的浸膏，用石油醚充分溶解，置于平 皿内，加入等体积的硅胶后搅拌至溶剂挥发，物质均匀吸附在硅胶上，硅胶颗粒松散不黏 着；
[0059]步骤二:装柱:采用湿法装柱，称取300g硅胶装柱，所述硅胶的体积与柱的体积比 为1:20,悬于1000ml石油醚，不断搅拌溶胀去除气泡后，将悬液匀速缓慢地倒入底部塞有棉 花的层析柱中，打开底阀使液体流出，吸附剂均匀下降，并适当振动，利于排气，避免分层；
[0060] 步骤三:上样:将以硅胶拌好的样品缓慢倒入装好的硅胶柱中，使其均匀平整地铺 在柱上，后加入石英砂，并在在柱顶端塞入脱脂棉，以防止溶剂的加入对于样品的冲击；
[0061] 步骤四：洗脱：以石油醚、乙酸乙酯和甲醇混合溶液作为洗脱剂按极性由小至大进 行梯度洗脱，收集洗脱液。
[0062] -种抗脂质过氧化物的用途，所述的抗脂质过氧化物在制备抗脂质过氧化活性药 物中的应用。
[0063] 实施例七:一种抗脂质过氧化物的制备方法，包括以下步骤:取干燥的红曲霉发酵 样品，加入体积分数为90%乙醇溶剂，所述红曲霉发酵样品与体积分数为90%乙醇溶剂的 体积比为3:12,于12000r ?mirT1条件下60°C浸提12h，提取得到粗提品，然后采用浸提法提 取得到粗提品，然后采用柱层析洗脱粗提品得到纯化洗脱液，对所述纯化洗脱液进行硅胶 薄层层析，将相同硅胶薄层层析结果的洗脱液合并得到抗脂质过氧化物。
[0064] 所述的极性梯度洗脱的方法包括以下步骤：
[0065] 步骤一:拌样:将醇提浓缩后得到的浸膏，用石油醚充分溶解，置于平皿内，加入等 体积的硅胶后搅拌至溶剂挥发，物质均匀吸附在硅胶上，硅胶颗粒松散不黏着；
[0066]步骤二:装柱:采用湿法装柱，称取300g硅胶装柱，所述硅胶的体积与柱的体积比 为1:20,悬于1000ml石油醚，不断搅拌溶胀去除气泡后，将悬液匀速缓慢地倒入底部塞有棉 花的层析柱中，打开底阀使液体流出，吸附剂均匀下降，并适当振动，利于排气，避免分层；
[0067]步骤三:上样:将以硅胶拌好的样品缓慢倒入装好的硅胶柱中，使其均匀平整地铺 在柱上，后加入石英砂，并在在柱顶端塞入脱脂棉，以防止溶剂的加入对于样品的冲击； [0068] 步骤四：洗脱：分别以石油醚、乙酸乙酯和甲醇的纯溶液以及石油醚、乙酸乙酯和 甲醇的混合溶液作为洗脱剂按极性由小至大进行梯度洗脱，收集洗脱液，所述石油醚、乙酸 乙酯和甲醇的混合溶液分别包括体积比为9:1:0、7:2:1、6:3:1、5:4:1、4:4:2、3:6:1、2:7: 1、0:9:1、0:7:3、0:5:5、0:3:7和0:1:9的混合溶液;每个所述洗脱剂冲洗5个柱体积。
[0069] 所述的硅胶薄层层析的方法包括以下步骤：
[0070] 步骤一：点样:将层析板水平放置，用内径小于1mm，管口平整的洁净毛细管将收集 的洗脱成分逐个点在层析板一端的同一水平线上，样品间距离大于5mm。
[0071] 步骤二:饱和:将预先配好的展开剂适量倒入层析缸，盖严后静置5-10min，使层析 缸中溶剂挥发气体饱和均匀。
[0072]步骤三:展开:将点好样的层析板放入层析缸中展开，使展开剂浸没薄板下端，但 未达到点样线，密闭层析缸进行展开，当展开剂从层析板下端慢慢扩散到前沿，距顶端5_ 10mm时，取出层析板，用铅笔标记溶剂前沿位置。
[0073]步骤四：观察、显色、定性:层析板上溶剂挥干后进行观察，GF254硅胶板可置于紫 外分析仪下直接观察;有些物质在紫外分析仪下无荧光斑点，即均匀喷洒10%硫酸乙醇溶 液，用高温枪烘烤至显色，标记点的位置，测量，计算比移值(Rf?值）。
[0074] 步骤五:展开剂的选择:配制不同极性的展开剂，分别对样品进行薄层层析，经过 观察和计算Rf值后，选择展开后组分斑点圆且集中，不同组分斑点明显分开，Rf值范围为 0.2-0.8的展开剂为最佳。最终得到体积比为12:1的石油醚和乙酸乙酯、体积比为1:2的石 油醚和乙酸乙酯，经硅胶板薄层层析分析，10%硫酸乙醇显色观察。
[0075] -种抗脂质过氧化物的用途，所述的抗脂质过氧化物在制备抗脂质过氧化活性药 物中的应用。
[0076] 实施例八:一种抗脂质过氧化物的制备方法，包括以下步骤:取干燥的红曲霉发酵 样品，加入体积分数为90%乙醇溶剂，所述红曲霉发酵样品与体积分数为90%乙醇溶剂的 体积比为1:10,于12000r ?mirT1条件下60°C浸提12h，提取得到粗提品，然后采用浸提法提 取得到粗提品，然后采用柱层析洗脱粗提品得到纯化洗脱液，对所述纯化洗脱液进行硅胶 薄层层析，将相同硅胶薄层层析结果的洗脱液合并得到抗脂质过氧化物。
[0077] 所述的极性梯度洗脱的方法包括以下步骤：
[0078] 步骤一:拌样:将醇提得到粗提品浓缩后得到的浸膏，用石油醚充分溶解，置于平 皿内，加入等体积的硅胶后搅拌至溶剂挥发，物质均匀吸附在硅胶上，硅胶颗粒松散不黏 着；
[0079]步骤二:装柱:采用湿法装柱，称取300g硅胶装柱，所述硅胶的体积与柱的体积比 为1:20,悬于1000ml石油醚，不断搅拌溶胀去除气泡后，将悬液匀速缓慢地倒入底部塞有棉 花的层析柱中，打开底阀使液体流出，吸附剂均匀下降，并适当振动，利于排气，避免分层；
[0080]步骤三:上样:将以硅胶拌好的样品缓慢倒入装好的硅胶柱中，使其均匀平整地铺 在柱上，后加入石英砂，并在在柱顶端塞入脱脂棉，以防止溶剂的加入对于样品的冲击；
[0081 ] 步骤四：洗脱:分别以石油醚、乙酸乙酯和甲醇按体积比为9:1:0、6:3:1、5:4:1、4: 4: 2、3:6:1和2:7:1的混合溶液作为洗脱剂按极性由小至大进行梯度洗脱;每个所述洗脱剂 冲洗5个柱体积。
[0082]所述的硅胶薄层层析的方法包括以下步骤：
[0083]步骤一：点样:将层析板水平放置，用内径小于1mm，管口平整的洁净毛细管将收集 的洗脱成分逐个点在层析板一端的同一水平线上，样品间距离大于5mm。
[0084] 步骤二:饱和:将预先配好的展开剂适量倒入层析缸，盖严后静置5-10min，使层析 缸中溶剂挥发气体饱和均匀。
[0085] 步骤三:展开:将点好样的层析板放入层析缸中展开，使展开剂浸没薄板下端，但 未达到点样线，密闭层析缸进行展开，当展开剂从层析板下端慢慢扩散到前沿，距顶端5-10mm时，取出层析板，用铅笔标记溶剂前沿位置。
[0086]步骤四：观察、显色、定性:层析板上溶剂挥干后进行观察，GF254硅胶板可置于紫 外分析仪下直接观察;有些物质在紫外分析仪下无荧光斑点，即均匀喷洒10%硫酸乙醇溶 液，用高温枪烘烤至显色，标记点的位置，测量，计算比移值(Rf?值）。
[0087] 步骤五:展开剂的选择:配制不同极性的展开剂，分别对样品进行薄层层析，经过 观察和计算Rf值后，选择展开后组分斑点圆且集中，不同组分斑点明显分开，Rf值范围为 0.2-0.8的展开剂为最佳。最终得到体积比为12:1的石油醚和乙酸乙酯、体积比为1:2的石 油醚和乙酸乙酯，经硅胶板薄层层析分析，10%硫酸乙醇显色观察。
[0088] -种抗脂质过氧化物的用途，所述的抗脂质过氧化物在制备抗脂质过氧化活性药 物中的应用。
[0089] 不同溶剂的脂质过氧化抑制率检测：
[0090] 一、实验方法：
[0091 ] 1、粗提品的卒取：
[0092] (1)乙酸乙酯萃取醇提物
[0093] 取定量未干燥的红曲霉样品，分别取10倍体积的30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇和 90%乙醇，分别于60°C浸提12h，12000r ? min-1，离心15min，取上清液200ml置于500mL分液 漏斗中，分别得到浓度为30 %乙醇、50 %乙醇、70 %乙醇和90 %乙醇的四个醇提物，将四个 醇提物中分别加入200mL乙酸乙酯，充分振摇萃取，静置，待溶液完全分层后，放出上层的萃 取液，下层的浸提液用同法再萃取2次，每次加萃取剂200mL，3次萃取剂合并，在低于60°C下 减压回收萃取剂，旋干后，使溶剂自然挥干，得到醇提乙酸乙酯萃取物。下层的浸提液在低 于60°C下减压回收，旋干后，使溶剂自然挥干，得到乙酸乙酯萃取后剩余的水层。
[0094] (2)石油醚进一步萃取乙酸乙酯萃取物
[0095] 取定量未干燥的红曲霉样品，分别取10倍体积30 %乙醇、50 %乙醇、70 %乙醇和 90%乙醇，分别于60°C浸提12h，12000r ? min-1，离心15min，取上清液200ml置于500mL分液 漏斗中，分别得到浓度为30 %乙醇、50 %乙醇、70 %乙醇和90 %乙醇的四个醇提物，将四个 醇提物中分别加入200mL乙酸乙酯，充分振摇萃取，静置，待溶液完全分层后，放出上层的萃 取液，下层的浸提液用同法再萃取2次，每次加萃取剂200mL，3次萃取剂合并，在低于60°C下 减压回收萃取剂，再加水充分溶解定容至200ml。
[0096]将用水充分溶解定容的乙酸乙酯萃取物置于500mL分液漏斗中，分别加入200mL石 油醚，充分振摇萃取，静置，待溶液完全分层后，放出上层的萃取液，下层的浸提液用同法再 萃取2次，每次加萃取剂200mL，3次萃取剂合并，在低于60°C下减压回收萃取剂，旋干后，得 到石油醚萃取物。下层的浸提液在低于60°C下减压，旋干后，得到石油醚萃取后剩余的乙酸 乙酯层。
[0097] 2、萃取物的抗脂质过氧化待测样品的制备:称取0.4mg各部分萃取样品，用蒸馏水 溶解、定容至100mL，此溶液质量浓度为8mg/mL。吸取8mg/mL溶液25、12 ? 5、6 ? 25、3 ? 13、1 ? 56、 0.78、0.39mL，分别加入蒸馏水定容至25mL，样品的浓度分别为0.5、1、2、4、8mg/mL。
[0098] 3、脂质过氧化抑制实验:使用鸡蛋黄匀浆液（10%，体积分数)作为反应的脂质媒 介。取0 . lmL上述制备的待测样品同0.5mL蛋黄匀浆液、0.4mL纯水及50yL硫酸亚铁溶液 (FeSCk ? 7H20，70mmol/L)混合，37°C孵育30min，迅速加入1.5mL乙酸溶液（20%，体积分数， pH值3.5)及1.5mL硫代巴比妥酸溶液（0.8 %，质量浓度，用1.1 %十二烷基硫酸钠溶液配 制），高速混匀后95 °C水浴60min。待反应混合物冷却至室温，加入5mL正丁醇，摇匀，混合物 5000r/min离心15min，取上清液测定其在532nm处的吸光度，纯水做空白对照。
[0099] 计算方法如下式：
[0100] 脂质过氧化抑制率（％ ) = ( 1-实验组吸光度/空白组吸光度）X 100%。
[0101] 二、实验结果：
[0102] 1、检测结果见图1，结果表明30%乙醇提取物抗脂质过氧化活性最高，随着乙醇浓 度的增加，提取物脂质过氧化抑制率逐渐降低，30%乙醇提取物、70%乙醇提取物，直到浓 度增至90 %乙醇时提取液的脂质过氧化抑制率增加，与70 %乙醇提取物、90 %乙醇提取物 相比差异不具显著性(P>〇.05)，30%乙醇提取物和90%乙醇浓度相差较大，提取出的活性 物质组成相差也较大。因此将乙醇作为提取剂进行提取所得到的产物，均具有抗脂质过氧 化的功能。
[0103] 2、醇提取的粗提品的萃取：
[0104] (1)乙酸乙酯萃取醇提物
[0105] 红曲霉样品的醇提物经乙酸乙酯萃取得到乙酸乙酯萃取物标记为（V)。下层得到 乙酸乙酯萃取后剩余的水层标记为(vi)。如图2所示，每组柱状部分，从左至右各组分的浓 度依次为8mg/ml、4mg/ml、2mg/ml、lmg/ml、0? 5mg/ml，从图2中看出，部分(v)在浓度为8mg/ ml时的脂质过氧化抑制率达到了 96.05%，而部分(vi)几乎无抗脂质过氧化活性。说明醇提 出的活性物质与乙酸乙酯互溶性较好，且提取出的活性物质大部分为中等极性的物质。 [0106] (2)石油醚萃取乙酸乙酯部(v)
[0107] 将乙酸乙酯部标记为(v)用石油醚进一步萃取后得到石油醚萃取物标记为(vii)。 下层得到石油醚萃取后剩余的乙酸乙酯层标记为(viii)。从图2中看出，部分(vii)在浓度 为811^/1111时的脂质过氧化抑制率为73.61%，部分(>;[;[;0达到了91.22%。部分(>;[;[;0的脂 质过氧化抑制率大于部分(vii)，差异具极显著性(P<0.01)。经乙酸乙酯层经石油醚进一 步萃取后，大部分活性物质仍在乙酸乙酯层，也有相当部分萃取到了石油醚层，说明醇提的 活性物质主要为中等极性的物质，也有相当一部分极性较小的活性物质。
[0108] 柱层析洗脱剂的选择：
[0109] 1、醇提后的浸膏在不同溶剂中的溶解情况:取少许红曲霉样品的醇提浸膏分别经 石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇溶解，考察浸膏在不同溶剂中的溶解情况，结果表明 浸膏在乙酸乙酯中的溶解性较好。
[0110] 2、样品在TLC展开剂中分离情况:根据浸膏在不同溶剂中溶解度的考察以及极性 分布情况的考察，
[0111] 选取不同极性配比的石油醚、乙酸乙酯和甲醇分别对醇提浸膏进行薄层层析，经 过多次薄层层析结果分析后，在不同配比的展开剂比例下，醇提样品的薄层层析，表明醇提 样品中的物质非常复杂，不同极性段均有物质。但在醇提样品在同一极性条件(石油醚：乙 酸乙酯= 20:1)，比移值范围不同。
[0112] 3、柱层析洗脱剂的确定:红曲霉样品粗提品成分较复杂，在对其抗脂质过氧化活 性物质进行分离纯化时，要尽量得到单一组分，为避免活性物质交叉洗脱下来，所以采用极 性梯度洗脱。根据上述抗脂质过氧化活性物质的极性分布情况，综合考虑样品在溶剂中溶 解度，样品在TLC展开剂中分离情况，溶剂的极性等选定洗脱剂。表明醇提样品中的物质非 常复杂，不同极性段均有物质。在醇提粗提品中，石油醚极性较小，乙酸乙酯居中，甲醇极性 较大，故选用石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度洗脱。
[0113] 洗脱液薄层层析展开剂的选择:对洗脱液进行硅胶薄层分析时，可根据不同阶段 洗脱下来的组分的极性来选择展开剂。对得到组分、化合物进行硅胶薄层分析时，试验性地 选择各种配比展开剂，经过观察和计算Rf值后，选择展开后组分斑点圆且集中，Rf值范围为 0.2-0.8的展开剂。
[0114] 粗提品首次柱层析纯化结果：
[0115] 醇提粗提品经硅胶柱层析，将相同薄层层析洗脱部分合并，得到组分一、组分二、 组分三、组分四、组分五，组分一和组分二选用石油醚-乙酸乙酯（12:1)作为展开剂，组分 三、组分四和组分五选用石油醚-乙酸乙酯（1:2)作为展开剂，经硅胶板薄层层析分析，10% 硫酸乙醇显色观察，得到各组分带，结果见图3和图4。洗脱出组分一的洗脱剂包括体积比为 9:1:0的石油醚、乙酸乙酯和甲醇的混合溶液;洗脱出组分二的洗脱剂包括体积比为7: 2:1 的石油醚、乙酸乙酯和甲醇的混合溶液，洗脱出组分三的洗脱剂分别包括体积比为6:3:1和 5:4:1的石油醚、乙酸乙酯和甲醇的混合溶液，洗脱出组分四的洗脱剂分别包括体积比为4: 4:2、3:6:1、2:7:1的石油醚、乙酸乙酯和甲醇的混合溶液，洗脱出组分五的洗脱剂分别包括 体积比为0:9:1、0:7:3、0:5:5、0:3:7、0:1:9的石油醚、乙酸乙酯和甲醇的混合溶液。
[0116] 柱层析得到的各组分抗脂质过氧化活性：
[0117] 柱层析得到的各组分的脂质过氧化抑制率如下图5,其中，组分二和组分五无抗脂 质过氧化活性。图5中每组柱状数据由左至右浓度依次上升，VC组中的柱状数据从左至右依 次为25iig/ml、50iig/ml、lOOμg/ml，组分一和组分四组中的柱状数据从左至右组分一和组粉 四的浓度依次为12 ? 5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、lOOμg/ml，组分三中的柱状数据从左至右组 分散的浓度依次为6 ? 25μg/ml、12.5μg/ml、25μg/ml、50μg/ml、100iig/ml，结果表明，各组分 的抗脂质过氧化效果随着浓度的增加而上升，其中组分三的抗脂质过氧化效果最强，在浓 度达到100μg/ml时，脂质过氧化抑制率可达90.54 %，其次为组分一，最高可达66.32 %。这 说明红霉素提取出的抗脂质过氧化活性物质大部分属于中等极性的物质。
[0118] 醇提物过柱组分的二次柱层析纯化结果：
[0119] 将组分一、组分三、组分四经二次柱层析纯化后，组分一析出了白色晶体，其余组 分均未得到纯的化合物。而组分二呈现的是黄色，故它里面很可能除白色晶体外，主要成分 为黄色的部分。组分一经硅胶柱层析，将相同薄层层析洗脱部分合并到青霉素瓶内，待溶剂 渐渐挥干至剩下一点时，有一瓶内析出白色针状晶体，将此瓶内物质，通过石油醚进行重结 晶，得到化合物H-1，薄层层析结果见图，6。
[0120] 结果表明，从组分一90%中分离得到的纯化合物的薄层层析来看，其极性非常小， 从形态来看，其呈白色针状晶体，密度极轻。
[0121] 化合物H-1结构鉴定：
[0122] 1、实验材料、仪器与试剂
[0123] 材料:药性菌质中分离得到的一个化合物。
[0124] 试剂：甲醇为色谱纯溶剂(天津登科化学试剂有限公司）
[0125] 仪器：气相色谱质谱联用仪(HP-5973美国惠普公司）、液相色谱质谱联用仪(HP-1100MSD美国惠普公司）、核磁共振波谱仪(IN0VA 400MHz Varian公司）。
[0126] 2、实验方法：
[0127] 化合物H-1的MS分析:将化合物溶于石油醚溶液，，进行EI-MS分析。
[0128] 化合物H-1的H-NMR和13C-NMR分析:将化合物溶于CD3C1溶液，进行H-NMR和13C-NMR 谱分析。
[0129] 3、结果与分析：
[0130] 化合物H-1的MS分析：
[0131 ] 将化合物H-1溶于石油醚溶液进行MS谱分析，得到的谱图如图7，EI-MSm/z : 396(M + )，363(M+-H2〇-CH3)，337(M+-H2〇-CH3-C2H2)，271(M+-C 9Hi7)，253(M+-C9Hi7-H2〇)。
[0132] 化合物的NMR分析：
[0133] 溶于CD3C1溶液，进行h-NMR和13C-NMR谱分析，得到的谱图如图8~10所示。
[0134] ^-NMRCSOOMzCDCl )8 ： 〇. 63 (3H, s) ,0.83 (3H,d,J = 6.0Hz) ,0.84(3H,d,J = 6.8Hz)，0.93(3H，d，J = 6.8Hz)，0.94(3H，s)，1.03(3H，d，J = 6.5Hz)，3.64(lH，m)，5.19(lH， dd，J=15.5Hz，6.8HZ)，5.22(lH，dd，J=15.5Hz，7.0Hz)，5.39(lH，d，J = 6.0Hz)，5.57(lH， d，J = 6.2Hz)。由1H-MR数据可知，化合物结构中有6个甲基，是甾醇类物质的特征信号
[0135] 13C-NMR(400MHz，CD3Cl)S:12.01(Ci8)，16.24(Ci9)，17.57(C28)，19.93(C26)，19.93 (C27)，21.06(Cii)，21.06(Cii)，22.95(Ci5)，28.27(Ci6)，31.93(C 2)，33.04(C25)，36.98(Ci〇)， 38.32(Ci)，39.02(Ci2)，40.42(C2〇)，40.73(C4)，42.77(Ci3)，42.77(C24)，46.18(C9)，54.51 (Ci4)，55.65(Ci7)，70.43(C 3)，116.23(C7)，119.54(C6)，131.92(C23)，135.53(C22)，139.74 (C 5)，141.35(C8)。依据波谱分析结果，比对文献报道(王剑平，2010)，鉴定化合物为麦角固 醇，分子式为C28H44Q分子量为396.34。
[0136] 抗脂质过氧化物的抗脂质过氧化活性检测：
[0137] 实验方法:将分别取得的白色晶体和黄色晶体，作为待测品进行检测，所述白色晶 体通过石油醚进行重结晶，得到抗脂质过氧化物。将得到的白色晶体和黄色晶体进行抗脂 质过氧化活性检测。
[0138] 待测样品的制备:分别称取0.4mg抗脂质过氧化物和黄色晶体，用蒸馏水溶解、定 容至100mL，此溶液质量浓度为8mg/mL。吸取8mg/mL溶液25、12.5、6.25、3.13、1.56、0.78、 0.39mL，分别加入蒸馏水定容至25mL，样品的浓度分别为0.5、l、2、4、8mg/mL。
[0139] 脂质过氧化抑制实验:使用鸡蛋黄匀浆液（10%，体积分数)作为反应的脂质媒介。 取0.1 m L上述制备的待测样品同0.5 m L蛋黄匀浆液、0.4 m L纯水及5 0 y L硫酸亚铁溶液 (FeSCk ? 7H20，70mmol/L)混合，37°C孵育30min，迅速加入1.5mL乙酸溶液（20%，体积分数， pH值3.5)及1.5mL硫代巴比妥酸溶液（0.8 %，质量浓度，用1.1 %十二烷基硫酸钠溶液配 制），高速混匀后95 °C水浴60min。待反应混合物冷却至室温，加入5mL正丁醇，摇匀，混合物 5000r/min离心15min，取上清液测定其在532nm处的吸光度，纯水做空白对照。
[0140]实验结果:实验结果见表1所示。
[0141]表1抗脂质过氧化物抗脂质过氧化活性检测
[0143] 由表1数据可知，抗脂质过氧化物在制备抗脂质过氧化活性的药物中使用。
[0144] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技 术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修 改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【主权项】
1. 一种抗脂质过氧化物的制备方法，其特征在于，包括采用红曲霉发酵样品作为原料 提取的步骤。2. 根据权利要求1所述的一种抗脂质过氧化物的制备方法，包括以下步骤:取干燥的红 曲霉发酵样品，加入提取溶剂，采用浸提法提取得到粗提品，然后采用柱层析洗脱粗提品得 到纯化洗脱液，对所述纯化洗脱液进行硅胶薄层层析，将相同硅胶薄层层析结果的洗脱液 合并得到抗脂质过氧化物。3. 根据权利要求2所述的一种抗脂质过氧化物的制备方法，其特征在于，所述的提取溶 剂为乙醇，所述的红曲霉发酵样品与所述提取溶剂的体积比为1~3:10~12;所述柱层析洗 脱的方法为极性梯度洗脱。4. 根据权利要求3所述的一种抗脂质过氧化物的制备方法，其特征在于，所述的乙醇为 体积分数为30 %~90 %的乙醇;所述浸提法包括以下步骤:于12000r · mirT1条件下60°C浸 提 12h。5. 根据权利要求3所述的一种抗脂质过氧化物的制备方法，其特征在于，所述的极性梯 度洗脱的方法包括以下步骤： 步骤一:拌样:将所述粗提品浓缩后得到浸膏，采用溶剂充分溶解，加入硅胶搅拌至溶 剂挥发且析出的固体吸附在硅胶上； 步骤二:装柱:采用湿法装柱得到硅胶柱； 步骤三:上样:将步骤一拌好的样品倒入硅胶柱中后，加入石英砂，并在柱顶端塞入脱 脂棉； 步骤四：洗脱:采用洗脱剂按极性由小至大进行梯度洗脱，收集洗脱液，所述洗脱剂分 别包括石油醚、乙酸乙酯和甲醇的纯溶液以及石油醚、乙酸乙酯和甲醇的混合溶液。6. 根据权利要求5所述的一种抗脂质过氧化物的制备方法，其特征在于，所述步骤一中 的溶剂为石油醚，加入的所述硅胶与所述浸膏等体积;湿法装柱包括以下步骤:称取硅胶悬 于石油醚中，不断搅拌溶胀去除气泡后得到悬液，将悬液匀速倒入底部塞有棉花的层析柱 中，打开底阀使液体流出。7. 根据权利要求5所述的一种抗脂质过氧化物的制备方法，其特征在于，所述石油醚、 乙酸乙酯和甲醇的混合溶液分别包括体积比为9:1:0、7:2:1、6:3:1、5:4:1、4:4:2、3:6:1、2 :7:1、0:9:1、0:7:3、0:5:5、0:3:7和0:1:9的混合溶液;每个所述洗脱剂冲洗5个柱体积。8. 根据权利要求7所述的一种麦角留醇的制备方法，其特征在于，所述的洗脱剂分别包 括石油醚、乙酸乙酯和甲醇的体积比为9:1:0、6:3:1、5:4:1、4:4:2、3:6:1和2:7:1的混合溶 液。9. 根据权利要求2所述的一种抗脂质过氧化物的制备方法，其特征在于，所述的硅胶薄 层层析中的展开剂为体积比为12~0.5:1的石油醚和乙酸乙酯的混合溶剂。10. -种抗脂质过氧化物的用途，其特征在于，所述的抗脂质过氧化物在制备抗脂质过 氧化活性药物中的应用。
【文档编号】A61P1/04GK105820205SQ201610278212
【公开日】2016年8月3日
【申请日】2016年4月29日
【发明人】周礼红, 侯素媛
【申请人】周礼红