抗逆杨树的分子标记、筛选方法、试剂盒及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种筛选抗逆杨树的分子标记、筛选方法、试剂盒及应用。其中，该分子标记为采用MSAP法检测的分子标记，分子标记包括MS1，MS2，MS3，MS4，MS5，MS6，MS7，MS8，MS9，MS10。应用本发明确定的筛选抗逆杨树的分子标记，可以在杨树生长的早期进行筛选出逆境胁迫适应性强、生活力高的植株，极大地缩短林木育种选择周期，对发展杨树速生丰产纸浆林、确保我国林业持续稳定地提供高得率工业纸浆原料具有重要的战略意义。
【专利说明】抗逆杨树的分子标记、筛选方法、试剂盒及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学【技术领域】，具体而言，涉及一种筛选抗逆杨树的分子标记、 筛选方法、试剂盒及应用。
【背景技术】
[0002] DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，是基因组DNA在转录水平上进 行调控的一种修饰方式，它参与了基因表达、生物的生长发育和逆境响应应答等过程，其 中，在基因表达调控中具有重要作用。对基因组甲基化进行研究最常用的技术是甲基敏感 扩增多态性技术（Methylation sensitive amplified polymorphism，MSAP)，该方法是利 用识别5 '-CCGG序列的同裂酶Hpa II和Msp I对基因组DNA甲基化敏感性不同，相同序列 可以扩增出不同的谱带，来检测甲基化水平以及有效区分出基因组DNA的甲基化状态。
[0003] 杨树是我国北方的主要造林树种。但随着全球气候变暖，极端天气频发，严重影响 杨树的生长与发育，进而影响林木生产的可持续发展。其中，小叶杨是杨树属植物中具典型 抗逆特征的树种，是设施困难立地造林的主要树种。而且，利用传统育种选择抗逆性好的杨 树费时而且难度大、成本高。因此，以小叶杨为材料对研究影响杨树抗逆性状的分子调控机 制尤为重要，而近年来对杨树分子生物学方面的研究大多集中在群体遗传结构与遗传多样 性等方面，与其适应性密切相关的DNA甲基化表观遗传变异尚未见报道。
[0004] 目前，亟需开发有效的与杨树抗逆相关的分子标记。
【发明内容】
[0005] 本发明旨在提供一种筛选抗逆杨树的分子标记、筛选方法、试剂盒及应用，以解决 现有技术中利用传统育种选择抗逆性好的杨树费时而且难度大、成本高的技术问题。
[0006] 为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种筛选抗逆杨树的分子标 记。该分子标记为米用MSAP法检测的分子标记，分子标记包括碱基序列为SEQ ID NO. 1的 MSI，SEQ ID NO. 2 的 MS2, SEQ ID NO. 3 的 MS3, SEQ ID NO. 4 的 MS4, SEQ ID NO. 5 的 MS5， SEQ ID NO. 6 的 MS6, SEQ ID NO. 7 的 MS7, SEQ ID NO. 8 的 MS8, SEQ ID NO. 9 的 MS9, SEQ ID NO. 10 的 MSlO。
[0007] 进一步地，待筛选杨树中能够检测到上述分子标记的植株的抗逆性强于检测不到 上述分子标记的植株。。
[0008] 根据本发明的另一个方面，提供一种筛选抗逆杨树的方法。该方法包括以下步骤： S1，提取待筛选毛白杨的基因组DNA ;S2,采用MSAP法测定待筛选毛白杨的基因组DNA中是 否含有碱基序列为 SEQ ID NO. 1 的 MSI，SEQ ID NO. 2 的 MS2, SEQ ID NO. 3 的 MS3, SEQ ID NO. 4 的 MS4, SEQ ID NO. 5 的 MS5, SEQ ID NO. 6 的 MS6, SEQ ID NO. 7 的 MS7, SEQ ID NO. 8 的MS8, SEQ ID NO. 9的MS9, SEQ ID NO. 10的MSlO的分子标记；S3,根据步骤S2中的测定 结果判断待筛选毛白杨的抗逆性。
[0009] 进一步地，待筛选杨树中能够检测到分子标记的植株的抗逆性强于检测不到分子 标记的植株。
[0010] 进一步地，MSAP法所用的EcoRI接头的序列为SEQ ID NO : 11和SEQ ID NO :12， Hpall/MspI接头的序列为SEQ ID NO: 13和SEQ ID NO: 14, EcoRI预扩增引物的序列为SEQ ID N0:15，HpaII/MspI预扩增引物的序列为SEQ ID N0:16,筛选引物序列为SEQ ID NO: 17 ?20。
[0011] 进一步地，S2中进行MSAP法测定时的双酶切连接反应体系的总体积为20 μ 1，包 括基因组 DNA200ng，Hpa II/Msp I7.5U，EcoR I7.5U，10X 缓冲液 2yl，50pmol 的 HpaII/ MspI 接头和 5pmol EcoR I 接头，T4DNA 连接酶 2. 5U，加 ddH20 至 20μ 1，37°C保温 12h。
[0012] 根据本发明的再一个方面，提供一种筛选抗逆杨树的试剂盒。该试剂盒包括采用 MSAP法检测权利要求1中所述的分子标记时的EcoRI接头的序列为SEQ ID NO :11和SEQ ID NO :12, Hpall/MspI 接头的序列为 SEQ ID NO :13 和 SEQ ID NO :14, EcoRI 预扩增引物 的序列为SEQ ID N0:15，HpaII/MspI预扩增引物的序列为SEQ ID N0:16,筛选引物序列为 SEQ ID NO : 17 ?20。
[0013] 进一步地，该试剂盒包括PCR扩增试剂，扩增试剂包括PCR扩增缓冲液， 25mmolI -1MgCl2, IOmmoir1 dNTP，Taq DNA 聚合酶和双蒸水。
[0014] 根据本发明的再一个方面，提供一种碱基序列为SEQ ID NO. 1的MSI，SEQ ID NO. 2 的 MS2，SEQ ID N0.3 的 MS3，SEQ ID N0.4 的 MS4，SEQ ID N0.5 的 MS5，SEQ ID N0.6 的 MS6， SEQ ID NO. 7 的 MS7, SEQ ID NO. 8 的 MS8, SEQ ID NO. 9 的 MS9, SEQ ID NO. 10 的 MSlO 的 MSAP分子标记在杨树分子标记辅助选择育种中的应用。
[0015] 应用本发明确定的筛选抗逆杨树的分子标记，可以在杨树生长的早期进行筛选出 逆境胁迫适应性强、生活力高的植株，极大地缩短林木育种选择周期，对发展杨树速生丰产 纸浆林、确保我国林业持续稳定地提供高得率工业纸浆原料具有重要的战略意义。另外，本 发明的分子标记可以用于进一步的抗逆候选基因筛选，可以为作为遗传标记用于抗逆性状 的关联分析，也可以作为候选位点用于进一步的DNA甲基化调控基因表达研究。
【专利附图】
【附图说明】
[0016] 构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示 意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：
[0017] 图1示出了杨树MSAP技术扩增结果，其中H是采用Hpa II/EcoR I双酶切的结果， M是采用Msp I/EcoR I双酶切的结果；CK是对照组处理结果，D是经过干旱处理的结果；以 及
[0018] 图2示出了 MS2通过回收克隆得到的DNA差异位点核甘酸序列在基因中的位置， 其中，红色代表通过双酶切得到的差异条带，黄色代表甲基化修饰的CCGG位点，绿色代表 5'UTR、蓝色代表外显子、粉色代表3'UTR等基因结构。
【具体实施方式】
[0019] 需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相 互组合。下面将参考附图并结合实施例来详细说明本发明。
[0020] 利用传统育种选择抗逆性好的杨树费时而且难度大、成本高，稳定性差，为了解决 这一技术问题，本发明开发出与筛选抗逆杨树的分子标记，可以在早期就鉴定出抗逆性好 的单株，从而大大加速育种进程。
[0021] 根据本发明一种典型的实施方式，提供一种筛选抗逆杨树的分子标记。该分子标 记为采用MSAP法检测的分子标记，分子标记包括碱基序列为SEQ ID NO. 1的MSI，SEQ ID NO. 2 的 MS2, SEQ ID NO. 3 的 MS3, SEQ ID NO. 4 的 MS4, SEQ ID NO. 5 的 MS5, SEQ ID NO. 6 的 MS6, SEQ ID NO. 7 的 MS7, SEQ ID NO. 8 的 MS8, SEQ ID NO. 9 的 MS9, SEQ ID NO. 10 的 MS10,具体序列如下
[0022] >MS1 (SEQ ID N0:1)
[0023] ACAAACTCGATAGGGCGATTGAGCTGCCCTTGGTCTTAGGGCGATAATCCAATTACC GGCCATAGCAC CTCCTAAGCGTCTTGCCAAACGCTCAGGAAGTATTTCTTCAAGTATTTCT CGTTGATTGCTCGCTAAAGGG
[0024] >MS2 (SEQ ID NO:2)
[0025] GGATAACTCTATAGGGCGATTGAGCTGCCCTTGACTGCGTACCAATTCAGCTTCGAAT TTGTAGAAAA AATGCGGGTTACTCCCTGCTACCAACACACGCCCATCTGGTAAAAGGCTA GCTGTTGAATGGTACAATCTGGGTAC AGTTTCCGAGCAGGACTCATGATAAGGG
[0026] >MS3 (SEQ ID NO:3)
[0027] AGCTGCCCTTATCATGAGTCCTGCTCGGAAATGAGACCGATCGACTCTCCCTGCTAG CTTTTAAGGCT CAAATTACCAATGATCCTCTTGGTAAGCTGAATTGGTACGCAGTCAAGG G
[0028] >MS4 (SEQ ID NO:4)
[0029] CGGTGGCTCGTTAGGGCGATTGAGCTGCCCTTGACTGCGTACCAATTCAGCATTGTA GTGAACTTGAA GGCTTGCCTGAAGAAGGTTTCCGAGCAGGACTCATGATAAGGG
[0030] >MS5 (SEQ ID NO:5)
[0031] CGGTGACTACTATAGGGCGATTGAGCTGCCCTTATCATGAGTCCTGCTCGGAAACGC AAACTCCTGGA TGAATTGGTACGCAGTCAAGGG
[0032] >MS6 (SEQ ID NO:6)
[0033] TACGACTCACTATAGGGCGAATTGAAGCTGCCCTTATCATGAGTCCTGCTCGGAAAA GCACTCCAATC TAATATTCATATCCAGCATGACATTTCCGTGCTTGATCCAGCTGAATTGGT ACGCAGTCAAG
[0034] >MS7 (SEQ ID NO:7)
[0035] GGGAACTCTATAGGGGGCGATTGAGCTGCCCTTGACTGCGTACCAATTCATTATGCC CATGGCCTTGC TTGAGATCCCTATATCTGGATGAACTTGCTTCAGCACCTTAAAGATGTAG ATCTTGTATGTCTCTGTGCTCTTCTT CACCCTCTTTTTCTTCTTCTTTCCGAGCAGGACTCA TGATAAGGG
[0036] >MS8 (SEQ ID NO:8)
[0037] TACGACTCACTATAGGGCGAATTGAAGCTGCCCTTGACTGCGTACCAATTCATCAGT GCCATAGCTTT CACCACATGCTCCGCAAGTAGCACCCTGTTCGTCATCTTCTTCTTCCTCT TCCCCACTCTCATAGTCTTCCTTGGG TGGTGCAGATACCTTTACTGCCTTAGTCTGGGACT CAGGTTTCCGAGCAGGACTCATGATAAGGG
[0038] >MS9 (SEQ ID NO:9)
[0039] GGATGACTCCTATAGGGGCGGATTGAGCTGCCCTTGACTGCGTACCAATTCCCATCAT TTGCAGTTTC CGAGCAGGACTCATGATATGACTGCGTACCAATTCCCATCATTTGCAGTTT CCGAGCAGGACTCATGATAGGTGAC TGCGTACCAATTCCCATCATTTGCAGTTTCCGAGC AGGACTCATGATAAGGG
[0040] >MS10 (SEQ ID NO: 10)
[0041] AGGATTTGTCATGAGATATCAAAAGATCTCACTAGATCCTTCACTAAAATGAAGATTA ATCACTAAGT ATATGAATATCTGGCTGACGTCACATGCCTATTCATTAGC
[0042] 应用本发明确定的筛选抗逆杨树的分子标记，可以在杨树生长的早期进行筛选出 逆境胁迫适应性强、生活力高的植株，极大地缩短林木育种选择周期，对发展杨树速生丰产 纸浆林、确保我国林业持续稳定地提供高得率工业纸浆原料具有重要的战略意义。另外，本 发明的分子标记可以用于进一步的抗逆候选基因筛选，可以为作为遗传标记用于抗逆性状 的关联分析，也可以作为候选位点用于进一步的DNA甲基化调控基因表达研究。
[0043] 本发明所示的标记是利用MSAP技术发现的干旱处理材料与对照组DNA甲基化有 差异的片段，然后再经过DNA纯化及分子克隆手段得到相关具多态性DNA片段序列，因此， 待筛选杨树中能够检测到上述分子标记的植株的抗逆性强，反之亦然。
[0044] 根据本发明一种典型的实施方式，提供一种筛选抗逆杨树的方法。该方法包括以 下步骤：S1，提取待筛选毛白杨的基因组DNA ;S2,采用MSAP法测定待筛选毛白杨的基因组 DNA中是否含有上述分子标记（MS1-10) ;S3,根据步骤S2中的测定结果判断待筛选毛白杨 的抗逆性。
[0045] 本发明所示的标记是干旱处理材料与对照组DNA甲基化有差异的片段，待筛选杨 树中能够检测到上述分子标记的植株的抗逆性强，反之亦然。
[0046] 根据本发明一种典型的实施方式，MSAP法所用的接头、预扩增引物和筛选引物序 列如表1中所示。
[0047] 表 1
[0048]
【权利要求】
1. 一种筛选抗逆杨树的分子标记，其特征在于，所述分子标记为采用MSAP法检测的分 子标记，所述分子标记包括碱基序列为SEQ ID NO. 1的MSI，SEQ ID NO. 2的MS2, SEQ ID NO. 3 的 MS3, SEQ ID NO. 4 的 MS4, SEQ ID NO. 5 的 MS5, SEQ ID NO. 6 的 MS6, SEQ ID NO. 7 的 MS7, SEQ ID NO. 8 的 MS8, SEQ ID NO. 9 的 MS9, SEQ ID NO. 10 的 MS10。
2. 根据权利要求1所述的分子标记，其特征在于，待筛选杨树中能够检测到所述分子 标记的植株的抗逆性强于检测不到所述分子标记的植株。
3. -种筛选抗逆杨树的方法，其特征在于，包括以下步骤： S1，提取待筛选毛白杨的基因组DNA ; 52, 采用MSAP法测定所述待筛选毛白杨的基因组DNA中是否含有碱基序列为SEQ ID NO. 1 的 MSI，SEQ ID NO. 2 的 MS2, SEQ ID NO. 3 的 MS3, SEQ ID NO. 4 的 MS4, SEQ ID NO. 5 的 MS5, SEQ ID NO. 6 的 MS6, SEQ ID NO. 7 的 MS7, SEQ ID NO. 8 的 MS8, SEQ ID NO. 9 的 MS9， SEQ ID NO. 10的MS10的分子标记； 53, 根据所述步骤S2中的测定结果判断所述待筛选毛白杨的抗逆性。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，待筛选杨树中能够检测到所述分子标记 的植株的抗逆性强于检测不到所述分子标记的植株。
5. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，MSAP法所用的EcoRI接头的序列为SEQ ID NO :11 和 SEQ ID NO :12, Hpall/MspI 接头的序列为 SEQ ID NO :13 和 SEQ ID NO :14， EcoRI预扩增引物的序列为SEQ ID N0:15，HpaII/MspI预扩增引物的序列为SEQ ID NO: 16,筛选引物序列为SEQ ID NO :17?20。
6. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述S2中进行MSAP法测定时的双酶切连 接反应体系的总体积为20μ1，包括所述基因组DNA200ng，Hpa II/Msp I7.5U，EcoR I7.5U， 10X 缓冲液 2yl，50pmol 的 Hpall/MspI 接头和 5pmol EcoR I 接头，T4DNA 连接酶 2.5U， 加 ddH20 至 20 μ 1，37°C 保温 12h。
7. -种筛选抗逆杨树的试剂盒，其特征在于，包括采用MSAP法检测权利要求1中所述 的分子标记时的EcoRI接头的序列为SEQ ID NO :11和SEQ ID NO :12，HpaII/MspI接头的 序列为 SEQ ID NO :13 和 SEQ ID NO : 14,EcoRI 预扩增引物的序列为 SEQ ID NO : 15,Hpall/ MspI预扩增引物的序列为SEQ ID NO :16,筛选引物序列为SEQ ID NO :17?20。
8. 根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，进一步包括PCR扩增试剂，所述扩增试 剂包括PCR扩增缓冲液，25臟〇11^\%(：1 2, lOmmoirMNTP，Taq DNA聚合酶和双蒸水。
9. 碱基序列为 SEQ ID NO. 1 的 MSI，SEQ ID NO. 2 的 MS2, SEQ ID NO. 3 的 MS3, SEQ ID NO. 4 的 MS4, SEQ ID NO. 5 的 MS5, SEQ ID NO. 6 的 MS6, SEQ ID NO. 7 的 MS7, SEQ ID NO. 8 的MS8, SEQ ID NO. 9的MS9, SEQ ID NO. 10的MS10的MSAP分子标记在杨树分子标记辅助 选择育种中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK104293775SQ201310298867
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2013年7月16日 优先权日:2013年7月16日
【发明者】张德强, 次东, 宋跃朋, 田敏, 周大凌 申请人:北京林业大学