专利名称：利用家蚕生物反应器表达轮状病毒vp6蛋白的方法
利用家蚕生物反应器表达轮状病毒VP6蛋白的方法技术领域
本发明是一种新的方式生产轮状病毒VP6蛋白的方法以及所用的重组病毒 BmNPV-RVVP6的获得方法。
背景技术：
一、家蚕生物反应器
家蚕生物反应器是利用家蚕BmNPV表达系统生产外源蛋白，其外源蛋白表达量高，产物的天然性质好。它没有哺乳类细胞培养系统外源蛋白生产效率低、设备条件要求高等问题，也没有大肠杆菌的内毒素、表达产物糖苷化及生物活性低等缺陷。由于该系统潜在的诸多优势，为人类生产急需的蛋白质类药物、基因工程疫苗和基因工程杀虫剂等提供了崭新的途径，因此近年来受到广泛重视。
BmNPV基因组是超螺旋的闭环双链DNA，主要编码100余种结构蛋白和非结构蛋白。多角体蛋白基因不是病毒复制的必需基因，在感染晚期进行高效表达。其编码的多角体蛋白只起到包埋病毒粒子的作用，与病毒粒子的形成没有直接关系。多角体蛋白基因即使部分或全部被其他外源基因取代，仍能形成有感染性的病毒粒子。根据这一特性，将外源基因通过基因操作手段替换BmNPV基因中的多角体蛋白基因，从而使BmNPV在蚕体细胞内大量表达外源蛋白。
Bm-BacPAK6 DNA 是 Clontech 公司产品，是野生型 BmNPV DNA 与商品化的 BacPAK6 同源重组的产物，其上有3个Bsu36I(Aoc I)酶切位点(图I)。经酶切线性化的Bm_BacPAK6 DNA由于0RF1629被破坏，所以不具感染性。只有与外源DNA发生同源重组，修复必需基因 0RF1629后，才能使病毒正常地进行繁殖和复制，同时将目的融合基因导入到病毒基因组中。由于外源基因的插入导致了 LacZ基因失活，使在X-gal存在时不显色，少量酶切不完全的线型化病毒具有完整的LacZ基因，在X-gal存在时呈蓝色，通过蓝白斑的筛选可以筛选处重组病毒，在经过2 3轮的筛选就可以获得纯度较高的重组病毒。
共转染后第4天左右，细胞瓶中有一个小区域的细胞呈发病感染状，继续培养直至有大量的病毒粒子从细胞中释放出来。然后取出共转染上清lmL，加2μ I的X-gal，将病毒在27 1条件下继续培养24小时，病毒液颜色不变蓝，可以初步判别同源重组已经成功。
将不同梯度的共转染上清稀释液感染BmN单层细胞，进行空斑筛选。待培养的细胞产生空斑时，选取第一轮筛选不能产生β -半乳糖苷酶的空斑病毒株(白斑)进入下一轮筛选，以次类推，依次完成第二和第三轮空斑筛选，最后获得纯化的病毒株。
家蚕生物反应器优点
家蚕昆虫杆状病毒(BmNPV)表达系统是目前被公认的表达量很高的真核表达系统，以家蚕核型多角体病毒作为表达载体，具有特殊的优越性(I)在强有力的多角体蛋白启动子的调控下，外源基因可在蚕体内表达，表达效率可高于培养细胞10-100倍，每头蚕的表达量可达毫克级；(2)杆状病毒具有严格的宿主专一性，它对脊椎动物或植物均无致病性，是一种比较安全的表达载体；(3)杆状病毒质粒既能表达原核基因又能表达各种真核基因，这些真核基因在昆虫细胞中可利用信号肽将目的蛋白分泌到胞外，还能有效地进行蛋白质翻译后的加工、转运、糖基化、脂酰化和磷酸化等，表达产物的抗原性等生物学活性与天然蛋白质相比毫不逊色；(4)家蚕血淋巴中含有蛋白分解酶的抑制物，本身就可作为佐剂，蚕体内含丰富脂类物质，类似于生物胶囊，保护抗原蛋白不会在胃肠道迅速降解， 表达产物具有口服免疫的前景。(5 )宿主家蚕是人目前唯一可以无菌大规模饲养经济昆虫， 可以低成本地大规模饲养，特别是在家蚕起源地的中国，容易形成自主产业。说明家蚕杆状病毒表达系统(BmNPV)是一种更加快速、稳定、可靠的系统。
二.轮状病毒VP6简介
轮状病毒(Rotavirus，RV)是世界范围内引起婴幼儿传染性重症腹泻和幼龄动物腹泻的主要病原，全世界3岁以下的儿童中约有90%受到RV感染，每年因轮状病毒腹泻造成的死亡人数超过100万。目前，发展有效的疫苗，特别是开发适合给婴幼儿服用的口服疫苗，仍然是对RV感染最有力的预防和控制措施。
研究表明，VP6蛋白是轮状病毒第6个基因编码的内壳蛋白，约占病毒蛋白的50 %，并且VP6含有组和亚组特异性抗原，刺激机体产生的抗体对病毒感染有保护作用。Yang 等进行了鼠和牛VP6 DNA注射疫苗研制和试验，结果表明疫苗对鼠RV具有部分抵抗作用。 李国华等从我国腹泻患儿的粪便中克隆到轮状病毒地方株T114 VP6的全基因序列，将其在苜蓿银纹夜蛾核型杆状病毒(AcMNPV)系统中进行表达，结果表明VP6可以杆状病毒系统中表达，具有正常的抗原反应性和天然VP6的三体结构。但是，由于婴幼儿体质和发育特点对疫苗安全性具有特殊要求，使得生物反应器的选择成为制约婴幼儿口服轮状病毒疫苗开发的关键问题。
目前轮状病毒VP6生产中所遇到的问题
基因长度高，化学合成困难，收率低，生成的副产难以除去，合成路线步骤繁多等缺陷；在生物合成中一般原核表达载体产生的目的蛋白生物活性极低或无生物活性；植物表达系统一般产量低，周期长，难以大规模投入生产，更难以满足市场需要；而酵母和动物表达系统生产药物成本极高,产量极低,也存在相同的问题。发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种应用家蚕生物反应器来进行轮状病毒VP6 的生产，既能获得高活性的目的产物，又能降低成本，可规模化生产，以适应市场需求。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种重组病毒BmNPV_RVVP6的获得方法，其特征是包括以下步骤
I)、选用A组轮状病毒VP6基因，该基因编码的序列为SEQ ID NO: I所示；
2)、构建重组转移载体质粒pBacPAK8_RVVP6 ；
3 )、将构建所得的重组转移载体质粒pBacPAK8_RVVP6与已线性化的病毒 Bm-BacPAK6 DNA经脂质体介导共转染家蚕细胞，获得重组病毒BmNPV_RVVP6。
作为本发明的重组病毒BmNPV_RVVP6的获得方法的改进步骤2)为
VP6基因的PCR扩增产物经纯化后，得纯化后PCR产物，用限制性内切酶EcoR I和 BamH I双酶切，随后插入经过同样酶切(即，用限制性内切酶EcoR I和BamH I双酶切)的转移质粒PBacPAK8 (纯化后载体质粒PBacPAK8)中，并转化到大肠杆菌(E. coli) TGl感受态细胞进行阳性菌落筛选，得质粒pBacPAK8-RVVP6。
作为本发明的重组病毒BmNPV_RVVP6的获得方法的进一步改进步骤2)包括以下步骤
①、纯化后载体质粒PBacPAK8和纯化PCR产物的双酶切；
②、酶切产物处理
双酶切后，1%凝胶电泳，分别割胶回收PCR酶切后小片段以及PBacPAK8载体大片段；利用胶回收试剂盒分别纯化回收；
③、重组连接载体DNA和目的基因；
连接反应体系
权利要求
1.重组病毒BmNPV-RVVP6的获得方法，其特征是包括以下步骤 1)、选用A组轮状病毒VP6基因，该基因编码的序列为SEQID NO: I所示； 2)、构建重组转移载体质粒pBacPAK8-RVVP6； 3)、将构建所得的重组转移载体质粒pBacPAK8-RVVP6与已线性化的病毒Bm_BacPAK6DNA经脂质体介导共转染家蚕细胞，获得重组病毒BmNPV-RVVP6。
2.根据权利要求I所述的重组病毒BmNPV-RVVP6的获得方法，其特征是所述步骤2)为 VP6基因的PCR扩增产物经纯化后，得纯化后PCR产物，用限制性内切酶EcoR I和BamH I双酶切，随后插入经过同样酶切的转移质粒PBacPAK8中，并转化到大肠杆菌TGl感受态细胞进行阳性菌落筛选，得质粒pBacPAK8-RVVP6。
3.根据权利要求2所述的重组病毒BmNPV-RVVP6的获得方法，其特征是所述步骤2)包括以下步骤 ①、纯化后载体质粒PBacPAK8和纯化PCR产物的双酶切； ②、酶切产物处理 双酶切后，凝胶电泳，分别割胶回收PCR酶切后小片段以及PBacPAK8载体大片段；利用胶回收试剂盒分别纯化回收； ③、重组连接载体DNA和目的基因； 连接反应体系
4.根据权利要求1、2或3所述的重组病毒BmNPV-RVVP6的获得方法，其特征是所述步骤3)为 提取家蚕杆状病毒Bm-BacPAK6 DNA,并用Bsu36 I酶切使之线性化，得线性化家蚕杆状病毒Bm-BacPAK6 DNA ;提取pBacPAK8-RVVP6质粒与线性化家蚕杆状病毒Bm-BacPAK6 DNA共转染入家蚕BmN细胞。
5.利用家蚕生物反应器表达轮状病毒VP6蛋白的方法，其特征是包括以下步骤 将重组病毒BmNPV-RVVP6接种于家蚕细胞，从而进行重组蛋白RVVP6在家蚕细胞中的表达鉴定。
全文摘要
本发明公开了一种重组病毒BmNPV-RVVP6的获得方法，包括以下步骤1)选用A组轮状病毒VP6基因；2)构建重组转移载体质粒pBacPAK8-RVVP6；3)将构建所得的重组转移载体质粒pBacPAK8-RVVP6与已线性化的病毒Bm-BacPAK6 DNA经脂质体介导共转染家蚕细胞，获得重组病毒BmNPV-RVVP6。本发明用BmNPV-RVVP6感染家蚕BmN、5龄幼虫和蚕蛹，使重组蛋白VP6在家蚕中获得表达的技术，该方法原料易得，生产成本低，且无毒害，为新型轮状病毒疫苗的研制提供了新途径。
文档编号C12N15/66GK102978240SQ201210451970
公开日2013年3月20日 申请日期2012年11月12日 优先权日2012年11月12日
发明者李司, 张耀洲 申请人:浙江理工大学