植物中类轮状病毒颗粒的产生的制作方法

植物中类轮状病毒颗粒的产生的制作方法
【专利摘要】本发明提供了在植物中产生类病毒颗粒(VLP)的方法。所述方法包括将第一核酸引入至所述植物或所述植物的部分中。所述第一核酸包含在所述植物中具有活性并且操作性地连接至编码一个或更多个轮状病毒结构性蛋白质(例如但不限于轮状病毒蛋白质VP2)的核苷酸序列的第一调控区。所述核苷酸序列还可以包含一个或一个以上的扩增元件和/或区室靶向序列。可以将第二核酸引入至所述植物或所述植物的部分中。所述第二核酸包含在所述植物中具有活性并且操作性地连接至编码一个或更多个轮状病毒结构性蛋白质(例如但不限于轮状病毒蛋白质VP6)的核苷酸序列的第二调控区。任选地，可以将第三核酸和/或第四核酸引入至所述植物或所述植物的部分中。所述第三核酸包含在所述植物中具有活性并且操作性地连接至编码一个或更多个轮状病毒结构性蛋白质(例如但不限于轮状病毒蛋白质VP4)的核苷酸序列的第三调控区。所述第四核酸包含在所述植物中具有活性并且操作性地连接至编码一个或更多个轮状病毒结构性蛋白质(例如但不限于轮状病毒蛋白质VP7)的核苷酸序列的第四调控区。在允许所述核酸表达的条件下培养所述植物或所述植物的部分，由此产生了RLP。
【专利说明】植物中类轮状病毒颗粒的产生

【技术领域】
[0001] 本发明涉及在植物中产生轮状病毒结构性蛋白质。更具体地，本发明涉及在植物 中产生包含轮状病毒结构性蛋白质的类病毒颗粒。

【背景技术】
[0002] 轮状病毒感染为全球性的问题，主要影响五岁以下的儿童。它导致严重的肠胃炎， 并且在最坏的情况下导致死亡。
[0003] 轮状病毒是呼肠孤病毒科（Reoviridae)病毒（轮状病毒属）的成员，其感染肠 胃系统与呼吸道。该名称源于当通过负相差电子显微镜（negativecontrastelectron microscopy)观察时病毒粒子的轮状外观（图la;现有技术）。轮状病毒通常为球形，并且 因外壳和内壳或它们的双壳衣壳结构而得名。分别地，外衣壳直径为约70nm，内衣壳直径为 约55nm。轮状病毒的双壳衣壳围绕包括内蛋白质壳和基因组的核心。轮状病毒的基因组由 编码至少11个轮状病毒蛋白的双链RNA片断组成。
[0004]dsRNA编码六个结构性蛋白质（VP)与六个非结构性蛋白质（NSP)(图Ic;现有技 术）。结构性蛋白质包含VP1、VP2、VP3、VP4、VP6与VP7(图Ib;现有技术）。三个同心层 分别通过VP2、VP6与VP7的组装形成，其中VP4在病毒结构表面上形成"刺突（spike)"。 NSPs是在受感染的细胞内合成的，并且在复制周期的多个部分中起作用或者与宿主蛋白中 的一些相互作用从而影响发病或对感染的免疫应答（GreenbergandEstes, 2009)。
[0005]VP2是102kDa的蛋白质，并且是病毒核心中含量最丰富的蛋白质。它形成最内层 的结构性蛋白质层，并且为病毒核心的组分和转录酶的正确组装提供骨架（Lawton，2000)。 VPl是125kDa的最大的病毒蛋白，其作为轮状病毒的RNA依赖性聚合酶发挥作用，产生核心 复制中间产物，并且与VP2在其二十面体顶点处相结合（VaraniandAllain, 2002;Vende 等人，2002)。VP3 (98kDa的蛋白质）也直接与病毒基因组相结合，从而起到将5'端帽结构添 加至病毒mRNA的mRNA加帽酶（cappingenzyme)的作用。VPl与VP3 -起形成附着至VP2 衣壳层的外部5倍顶点的复合物（Angel，2007)。VP6是42kDa的蛋白质，其形成病毒核心的 中层壳，它是主要衣壳蛋白，并且在病毒颗粒的总蛋白质物质中占超过50% (Gonzdlez等 人，2004 ;Estes，1996)。它是基因转录所必需的，并且可以通过在核心中将VPl锚定至VP2 而在轮状病毒RNA的封装中起作用，如在呼肠孤病毒科的另一成员蓝舌病毒（bluetougue virus)中所观察到的那样。它还决定轮状病毒分为五组（A至E)的分类，其中A组最常感 染人类（Palombo，1999)。轮状病毒A组中的VP6具有至少四个亚组（SG):SGI、SGII、 SG(I+II)与SG非-(1+11)，这取决于SG特异性表位的存在与否。B组与C组缺少A组共有 的抗原，但也已知会感染人，而D组仅感染动物，例如，鸡与奶牛（Thongprachum，2010)。
[0006] 两种外部衣壳蛋白VP7,即37kDa的糖蛋白（G)与87kDa的蛋白酶敏感性VP4(P) 定义了病毒的血清型。这两种蛋白质诱导中和抗体反应并因而被用于将轮状病毒血清型 分类为双命名系统，这取决于G-P抗原组合（例如，GlP[8]或G2P[4]) (Sanchez-Padilla 等人，2009)。VP4蛋白二聚化从而在病毒外壳上形成60个刺突，所述刺突直接参与宿主细 胞进入的初始阶段。刺突蛋白在氨基酸（aa)位置248处包含切割位点。一旦感染，它被 蛋白酶胰蛋白酶切割，从而产生VP5(529aa，60kDa)和VP8(246aa，28kDa) (Denisova等人， 1999) 。该过程增强了病毒的感染性（宿主细胞的细胞附着与侵入）并且稳定了刺突结构 (Glass，2006)。VP7糖蛋白形成病毒的第三层或外层。目前，27G与35P基因型是已知的 (GreenbergandEstes，2009)。VP4与VP7是参与病毒中和的主要抗原并且是疫苗开发的 重要革巴标（Dennehy，2007)。
[0007] 在受感染的哺乳动物细胞中，轮状病毒经历独特形式的形态发生以形成完整的 三层VP2/6/4/7病毒颗粒（Lopez等人，2005)。三层衣壳是非常稳定的复合物，使其能够 粪-口传播并将病毒递送至小肠，在此其感染接近绒毛尖端的非分裂的分化肠上皮细胞 (GreenbergandEstes，2009)。首先，完整的病毒通过病毒表面上的60个VP4二聚体刺突 附着在独立于唾液酸的受体上（LundgrenandSvensson，2001)。病毒表面上的60个VP4 二聚体刺突允许病毒附着至这些细胞受体。VP4对通过胰蛋白酶的蛋白水解切割敏感，这导 致构象变化，所述变化暴露出用于和一系列共同受体相互作用的、糖蛋白表面上的额外附 着位点。
[0008] 然而，多步附着和进入过程尚未被清楚了解，但病毒被递送穿过宿主细胞膜。 VP7外部衣壳（也参与了进入过程）在该过程中被除去，并且双层颗粒（DLP)在囊泡中 被递送至细胞质（图2;现有技术）。DLP从囊泡脱离并且进入非膜结合的细胞质内含物 (cytoplasmicinclusions)中。通过VPl的基因组早期转录在颗粒中开始，从而使得dsRNA 永不暴露于细胞质。RNA复制与核心形成在这些非膜结合的细胞质内含物中发生。然后，初 期（+)RNA被运输进细胞质并用作病毒蛋白质合成的模板。VP4在胞质溶胶中产生并被运输 至粗面内质网（RER)，并且VP7被分泌进RER。VP2与VP6在病毒体的胞液中产生并组装， 并且随后出芽（bud)进RER区室，在该过程中获得瞬时膜包膜（Lopez等人，2005 ;Tian等 人，1996)。在RER中，在轮状病毒糖蛋白NSP4的关键性参与下，病毒颗粒的瞬时膜包膜被 移除并被VP4与VP7蛋白质单体代替（Tian等人，1996 ;Lopez等人，2005 ;Gonzalez等人， 2000) 。NSP4在ER膜中作为细胞内受体发挥作用，并且结合新产生的亚病毒颗粒，以及还可 能结合刺突蛋白VP4 (Tian等人，1996)。NSP4也对人有毒，并且是腹泻的致病物。随后，完 整、成熟的颗粒通过高尔基体从RER中转移至质膜进行分泌（Lopez等人，2005)。
[0009] 已采用多种不同的手段来产生适合保护人群以抵挡多种血清型的轮状病毒的轮 状病毒疫苗。这些手段包括多种Jennerian手段、使用减毒活病毒、使用类病毒颗粒、核酸 疫苗和作为免疫原的病毒亚单元。目前市场上有两种可用的经口疫苗，然而，在一些发展中 国家由于病毒株变化以及其它病原体的存在，这些疫苗效力较低。
[0010] 美国专利No. 4, 624, 850、4, 636, 385、4, 704, 275、4, 751，080、4, 927, 628、 5, 474, 773与5, 695, 767每篇描述了多种轮状病毒疫苗和/或制备它们的方法。该组成员 共有的共同性为这些疫苗中的每一种均依赖全病毒颗粒的使用以产生最终的轮状病毒疫 苗。考虑到对有效的多价疫苗的长期需求，很明显该工作主体在解决对此类疫苗的需求上 仅部分成功。
[0011] 不同于传统疫苗生产方法，分子生物学领域的进展已允许表达各轮状病毒蛋白。 Crawford等人（JVirol. 1994S印tember;68 (9) :5945-5952)将编码主要衣壳蛋白的VP2、VP4、VP6与VP7克隆进杆状病毒表达系统，并在昆虫细胞中表达了每种蛋白质。轮状病毒 主要结构性蛋白质的不同组合的共表达导致形成了稳定的类病毒颗粒（VLP)。VP2和VP6 的单独共表达或与VP4的共表达导致产生了VP2/6VLP或VP2/4/6VLP，它们与双层轮状病毒 颗粒相似。VP2、VP6与VP7的共表达（与或不与VP4的情况下）产生了三层的VP2/6/7VLP 或VP2/4/6/7VLP，它们与天然感染性轮状病毒颗粒相似。各VLP维持了天然粒子的结构和 功能性特征（如通过粒子电子显微镜观察所确定的）、VP4与VP7上非中和表位与中和表位 的存在、和VP2/4/6/7VLP的血球凝集活性。
[0012] 从不同蛋白质组成的类病毒颗粒产生的疫苗候选物已显示出作为亚单位疫苗的 潜力 ^O'Neal等人（''RotavirusVirus-likeParticlesAdministeredMucosallyInduce ProtectiveImmunity, 〃J.Virology, 71 (11) :8707-8717(1997))显示当将含有VP2 与VP6 的VLP或含有VP2、VP6与VP7的VLP在加入和未加入霍乱毒素的情况下施用至小鼠时，它们 在免疫小鼠中诱导了保护性免疫，而当各VLP与霍乱毒素（CT) 一起施用时保护更为有效。
[0013] 类核心颗粒（CLP)与VLP还用于免疫奶牛，Fernandez等人（"PassiveImmunity toBovineRotavirusinNewbornCalvesFedColostrumSupplementsFromCows ImmunizedwithRecombinantSAllrotaviruscore-likeparticle(CLP)orvirus-like particle(VLP)vaccines, "Vaccine, 16 (5) : 507-516 (1998))。在该研究中，研究了CLPs与 VLPs产生被动免疫的能力。该研究组总结：VLP在诱导被动免疫时比CLP更有效。
[0014] 植物正被越来越多地用于重组蛋白质的大规模生产。例如，US2003/0175303公 开了经稳定转化的番茄植株中重组轮状病毒结构性蛋白质VP6、VP2、VP4或VP7的表达。
[0015]Saldana等人使用花椰菜花叶病毒（CaMV) 35S启动子和重组农杆菌 (A.tumefaciens)在番爺植株的细胞质中表达了VP2与VP6 (Saldana等人，2006)。电子显 微镜研究显示少部分的颗粒已组装至2/6VLP中。在小鼠中检测到了保护性免疫应答，并且 这在某种程度上可能是未组装的VP导致的。各蛋白质已显示在小鼠中引起免疫应答，如在 VP8与VP6的情况中那样（Zhou等人，2010)。
[0016]Matsumura等人（2002)首先报道了转基因马铃薯植株中牛轮状病毒AVP6的表 达和组装。在他们的研究中，他们使用了通过花椰菜花叶病毒（CaMV)35S启动子调控的转 基因马铃薯植株以及携带VP6基因的重组农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens)。将蛋白 质表达、纯化并进行免疫研究。成年小鼠中的免疫应答显示血清中存在VP6抗体。然而，它 们未显示出经组装的VP6蛋白质的迹象。其可能是简单单体或者三聚体（可能在小鼠中 引起免疫应答）。另一小组的工作显示了使用马铃薯病毒X(PVX)载体在烟草（Nicotiana benthamiana)中VP6的组装（0'Brien等人，2000)。当VP6蛋白在植物中表达时，发现它 仅在融合至PVX杆状蛋白质（PVXproteinrods)时组装。一旦发生切割，VP6组装进二十 面体VLP，如Marusic等人（2001)在对HIV-PVX的类似研究中所观察到的那样。该结果可 能暗示轮状病毒蛋白质可能需要额外的因子或强化来形成VLP。
[0017] 由于需要对一个或更多个重组蛋白质的合成和组装两者，因此VLP的生产是具有 挑战性的工作。对于轮状病毒（其为RNA病毒，具有由四种不同蛋白质的1860个单体形成 的衣壳）的VLP而言正是如此。对于VLP的生产，二至三个重组蛋白质的同时表达与组装 是必需的。这些包括120个分子的VP2(内层）、780个分子的VP6(中间层）与780个分子 的糖蛋白VP7 (外层），最终形成了双层或三层颗粒。另外，大多数VLP的生产需要若干重组 蛋白的同时表达与组装，对于类轮状病毒颗粒（RLP)的情况而言，这需要在单一宿主细胞 中发生。
[0018] 最近的研究显示使用甜菜黑色焦枯病毒（Beetblackscorchvirus,BBSV)介导 的表达系统在红藜（Chenopodiumamaranticolor)中成功表达了经密码子优化的人轮状病 毒VP6。该蛋白质被工程化为BBSV的外壳蛋白开放阅读框的代替物。使用基于植物的VP6 蛋白对雌性BALB/c小鼠进行经口免疫，诱导了高效价的抗VP6粘膜IgA与血清IgG(Zhou 等人，2010)。然而，该研究组并未提及VP6蛋白组装进VLP还是颗粒。
[0019] 轮状病毒VP7也已被成功地表达进烟草植株中，并且其显示在小鼠中维持了其中 和性免疫应答（YuandLangridge，2001)。使用转基因马铃薯植株来表达VP7的另一研究 显示VP7基因在经转化的植物中稳定超过50代。来自第50代的VP7蛋白在成年小鼠中诱 导了保护性抗体以及中和性抗体两者（Li等人，2006)。
[0020] Yang等人（YangYM，LiX，YangH等人，2011)将ARV组（P[8]Gl)的三个轮状 病毒衣壳蛋白质VP2、VP6与VP7共表达进了烟草植株中，并且研究了这些蛋白质的表达水 平以及类轮状病毒颗粒的形成与免疫原性。从转基因烟草植株中纯化了VLP并通过电子显 微镜和Western印迹法进行了分析。Yang等人的结果表明植物来源的VP2、VP6与VP7蛋 白质自组装进直径60-80nm的2/6或2/6/7类轮状病毒颗粒。


【发明内容】

[0021] 本发明涉及在植物中产生轮状病毒结构性蛋白质。更具体地，本发明还涉及在植 物中产生包含轮状病毒结构性蛋白质的类病毒颗粒。
[0022]根据本发明，提供了在植物中产生类轮状病毒颗粒（RLP)的方法（A)，所述方法包 括：
[0023]a)将下述第一核酸、第二核酸和第三核酸引入至该植物、植物的部分或植物细胞 中，所述第一核酸包含在该植物中具有活性并且操作性地连接至编码第一轮状病毒结构性 蛋白质的第一核苷酸序列的第一调控区，所述第二核酸包含在该植物中具有活性并且操作 性地连接至编码第二轮状病毒结构性蛋白质的第二核苷酸序列的第二调控区，所述第三核 酸包含在该植物中具有活性并且操作性地连接至编码第三轮状病毒结构性蛋白质的第三 核苷酸序列的第三调控区，
[0024]b)在允许所述第一、第二和第三核酸瞬时表达的条件下培育所述植物、植物的部 分或植物细胞，由此产生RLP。
[0025] 此外，在步骤a)中，可以将下述第四核酸引入至该植物、植物的部分或植物细胞， 所述第四核酸包含在植物中具有活性并且操作性地连接至编码第四轮状病毒结构性蛋白 质的第四核苷酸序列的第四调控区，并且当在步骤b)中培育该植物、植物的部分或植物细 胞时所述第四核酸被表达。
[0026] 如以上方法（A)中所述，第一轮状病毒结构性蛋白质可以是VP2,第二轮状病毒结 构性蛋白质可以是VP6,并且第三轮状病毒结构性蛋白质可以是VP4或VP7。此外，第四轮 状病毒结构性蛋白质可以是VP7或VP4。蛋白酶可以在植物内共表达。
[0027] 本发明还提供了产生类轮状病毒颗粒（RLP)的方法（B)，所述方法包括：
[0028]a)将下述核酸引入至植物、植物的部分或植物细胞，所述核酸包含在植物中具有 活性并且操作性地连接至编码一个或更多个轮状病毒结构性蛋白质的第一核苷酸序列的 调控区，
[0029]b)在允许所述第一核酸瞬时表达的条件下培育所述植物、植物的部分或植物细 胞，由此产生RLP。
[0030] 如上所述的方法（B)还可以包括：在步骤a)中引入第二核酸，所述第二核酸包含 在该植物中具有活性并且操作性地连接至编码一个或更多个轮状病毒结构性蛋白质的第 二核苷酸序列的第二调控区，并且，当在步骤b)中培育该植物、植物的部分或植物细胞时 表达第二核酸。
[0031] 如上所述的方法（B)还可以包括：在步骤a)中将第三核酸引入至该植物，所述第 三核酸包含在该植物中具有活性并且操作性地连接至编码一个或更多个轮状病毒结构性 蛋白质的第三核苷酸序列的第三调控区，并且，当在步骤b)中培育该植物、植物的部分或 植物细胞时表达第三核酸。
[0032] 此外，在方法（A)或（B)中，可以在该植物、植物的部分或植物细胞中表达下述其 它的核酸，并且其中所述其它的核酸包含在该植物中具有活性并且操作性地连接至编码沉 默抑制子的核苷酸序列的调控区。
[0033] 可以将核苷酸序列密码子的使用调整为优选的人密码子使用、提高的GC含量或 其组合。
[0034] 轮状病毒结构性蛋白质可以包括截短的天然或非天然信号肽。非天然的信号肽可 以是蛋白质二硫键异构酶信号（roi)肽。
[0035] 可以将第一、第二、第三或第四核苷酸序列或其组合操作性地连接至豇豆花叶病 毒（CPMV)调控区。
[0036] 如上所述的方法（A)或（B)还可以包括以下步骤：
[0037] c)收获所述植物、植物的部分或植物细胞，和
[0038] d)从所述植物、植物的部分或植物细胞纯化RLP。
[0039] 在方法（A)或（B)中的收获或纯化步骤期间，可以使用胰蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白 酶、丝氨酸蛋白酶、糜蛋白酶样蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶加工或切割VP4,以产生VP5和VP8。
[0040] RLP的尺寸可以在70-100nm的范围内，并且可以在存在钙的情况下被纯化。
[0041] 本发明提供了通过如上所述的方法（A)或⑶产生的RLP。所产生的RLP可以至 少包含VP4轮状病毒结构性蛋白质。可以使用蛋白酶，例如，胰蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶、 丝氨酸蛋白酶、糜蛋白酶样蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶，将VP4切割成VP5和VP8。蛋白酶可以 在植物内共表达或者在收获、纯化或两者期间加入。此外，通过方法（A)或（B)产生的RLP 可以是双层RLP和/或三层RLP。
[0042] 此外，本发明提供了核苷酸序列。编码VP2的核苷酸序列可以包含与如SEQID N0:13、SEQIDN0:14或SEQIDN0:45所定义的核苷酸序列80%至100%的同一性。编码 VP6的核苷酸序列可以包含与如SEQIDNO:17、SEQIDNO:18或SEQIDNO:46所定义的 核苷酸序列80%至100%的同一性。编码VP7的核苷酸序列可以包含与如SEQIDNO:19、 20、48、49、52、53、54或57所定义的核苷酸序列80%至100%的同一性。并且，编码VP4的 核苷酸序列可以包含与SEQID勵：15、16、47、50或51所定义的核苷酸序列80%至100% 的同一性。另外，VP2可由包含与SEQIDNO:1或SEQIDNO:25所定义的氨基酸序列的 80%至100%同一性的氨基酸序列编码。VP6可由包含与SEQIDNO:3或SEQIDNO:31所 定义的氨基酸序列的80%至100%同一性的氨基酸序列编码。VP7可由包含与SEQIDNO: 4、39、43或59所定义的氨基酸序列的80%至100%同一性的氨基酸序列编码。VP4可由包 含与SEQIDNO:2或SEQIDNO:36、33所定义的氨基酸序列的80%至100%同一性的氨基 酸序列编码。所述一个或更多个轮状病毒结构性蛋白质可以是VP2、VP4、VP6和/或VP7。 可以将VP4加工成VP5和VP8。一个或更多个轮状病毒结构性蛋白质可以选自轮状病毒株 G9P[6]、轮状病毒AWA株、轮状病毒A疫苗USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]株以 及轮状病毒SAll株。
[0043] 在如上所述的方法（A)中，第一、第二或第三核酸序列或其组合可以包含下述在 该植物中具有活性的调控区，所述调控区被操作性地连接至一个或一个以上豇豆花叶病毒 (comovirus)增强子、连接至一个或一个以上扩增元件以及连接至编码轮状病毒结构性蛋 白质的核苷酸序列，并且其中可以将编码复制酶的第四核酸引入至该植物、植物的部分或 植物细胞。
[0044] 在如上所述的方法（B)中，第一、第二、第三或第四核酸序列或其组合可以包含下 述在该植物中具有活性的调控区，所述调控区被操作性地连接至一个或一个以上豇豆花叶 病毒（comovirus)增强子、连接至一个或一个以上扩增元件以及连接至编码轮状病毒结构 性蛋白质的核苷酸序列，并且其中可以将编码复制酶的第五核酸引入至该植物、植物的部 分或植物细胞。
[0045] 另外，根据本发明，提供了在植物中产生类轮状病毒颗粒（RLP)的方法（C)，所述 方法包括：
[0046]a)将下述核酸引入至植物或植物的部分，所述核酸包含在植物中具有活性并且操 作性地连接至编码一个或更多个轮状病毒结构性蛋白质的核苷酸序列的调控区，
[0047]b)在允许所述第一核酸瞬时表达的条件下培育所述植物、植物的部分，由此产生 RLP。
[0048] 此外，可以将第二核酸引入至植物或植物的部分，所述第二核酸包含在该植物中 具有活性并且操作性地连接至编码一个或更多个轮状病毒结构性蛋白质的第二核苷酸序 列的第二调控区，并且其中当在步骤b)中培育该植物或植物的部分时，第二核酸被表达。 [0049] 此外，可以将第三核酸引入至植物或植物的部分，所述第三核酸包含在该植物中 具有活性并且操作性地连接至编码一个或更多个轮状病毒结构性蛋白质的第三核苷酸序 列的第三调控区，并且其中当在步骤b)中培育该植物或植物的部分时，第三核酸被表达。
[0050] 如上所述的方法（C)还可以包含收获植物和提取RLP的步骤。
[0051] 方法（C)的一个或更多个轮状病毒结构性蛋白质可以是轮状病毒蛋白质VP2、VP4 或VP6。所述第一或第二核苷酸序列编码的一个或更多个轮状病毒结构性蛋白质可以是 VP2或VP6。第三核苷酸序列编码的一个或更多个轮状病毒结构性蛋白质可以是VP4。可以 将VP4切割以产生VP5和VP8。
[0052] 所述第一、第二或第三核苷酸序列还可以编码、包含、或者编码并包含一个或一个 以上的区室靶向序列和/或扩增元件。所述一个或更多个区室靶向序列将一个或更多个轮 状病毒结构性蛋白质引向植物细胞的内质网（ER)、叶绿体、质体或质外体。
[0053] 本发明还提供了产生类轮状病毒颗粒（RLP)的方法（D)，所述方法包括：
[0054]a)提供包含下述核酸的植物或植物的部分，所述核酸包含在植物中具有活性并且 操作性地连接至编码一个或更多个轮状病毒结构性蛋白质的核苷酸序列的调控区，
[0055] b)在允许所述核酸瞬时表达的条件下培育所述植物、植物的部分或植物细胞，由 此产生RLP。
[0056] 此外，方法（D)的植物或植物的部分还可以包含：
[0057] i)第二核酸，其包含在植物中具有活性并且操作性地连接至编码一个或更多个轮 状病毒结构性蛋白质的第二核苷酸序列的第二调控区，
[0058] ii)第二和第三核酸，其中所述第二核酸包含在植物中具有活性并且操作性地连 接至编码一个或更多个轮状病毒结构性蛋白质的第二核苷酸序列的第二调控区，并且所述 第三核酸包含在植物中具有活性并且操作性地连接至编码一个或更多个轮状病毒结构性 蛋白质的第三核苷酸序列的第三调控区，
[0059] 其中当在步骤b)中培育植物或植物的部分时，所述第二核酸、或所述第二和第三 核酸被表达。
[0060] 方法（D)中的一个或更多个结构性蛋白质可以是轮状病毒蛋白质VP2、VP4或 VP6。所述第一或第二核苷酸序列编码的一个或更多个轮状病毒结构性蛋白质可以是VP2 或VP6。所述第三核苷酸序列编码的一个或更多个轮状病毒结构性蛋白质可以是VP4。可 以使用蛋白酶，例如，胰蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、糜蛋白酶样蛋白酶、枯 草杆菌蛋白酶，将VP4切割成VP5和VP8。蛋白酶可以在植物内共表达，或者在收获、纯化或 两者期间加入。
[0061] 本发明提供了通过如上所述的方法（A)、方法（B)、方法（C)、方法（D)或它们的组 合产生的RLP。所述RLP可以包含一个或更多个轮状病毒结构性蛋白质，其可以包含植物特 异性N-聚糖或经修饰的N-聚糖。
[0062] 本发明包括含有有效剂量的RLP和可药用载体的组合物，所述RLP是通过如刚才 所述的方法（A)、方法（B)、方法（C)、方法（D)或它们的组合制备的，用于诱导免疫应答。 [0063] 本发明还包括在受试者中诱导对轮状病毒感染的免疫性的方法，所述方法包括将 如刚才所述的RLP施用于受试者。可以将RLP经口、皮内、鼻内、肌内、腹膜内、静脉内或皮 下施用于受试者。
[0064] 本发明还提供了植物材料，所述植物材料包含通过如上所述的方法（A)、方法 (B)、方法（C)、方法（D)或它们的组合产生的RLP。可以将植物材料用于在受试者中诱导对 轮状病毒感染的免疫性。植物材料还可以作为食品补充剂被混合。
[0065] 在如上所述的方法（方法A、B、C或D)中，植物或植物的部分还可以与编码沉默抑 制子的另一核酸序列一起施用，或者还可以包含编码沉默抑制子的另一核酸序列。
[0066] 此外，本发明还提供了在植物中产生轮状病毒结构性蛋白质的方法（E)，所述方法 包括：
[0067]a)将下述核酸引入至植物或植物的部分，所述核酸包含在植物中具有活性并且操 作性地连接至编码一个或更多个轮状病毒结构性蛋白质的核苷酸序列的调控区；
[0068]b)在允许所述核酸瞬时表达的条件下培育所述植物或植物的部分，由此产生一个 或更多个轮状病毒结构性蛋白质。
[0069] 本
【发明内容】
不意味着描述了本发明的全部特征。

【专利附图】

【附图说明】
[0070] 通过参考附图进行的下列描述，本发明的这些和其它特征将变得更明显，其中：
[0071] 图1显示了轮状病毒结构和基因-蛋白质分配。（A)轮状病毒颗粒的透射电子显微 结果（比例条表示IOOnm)。（B)病毒衣壳蛋白质的组织，其包括内部、中间与外部。（C)按 照大小与功能排列的轮状病毒dsRNA片断。可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离dsRNA(D)。 通过⑶中的dsRNA片断表示（C)中的蛋白质。图片来自：Crawford等人，1997 (A),Swiss InstituteofBioinformatics，2008(B)和GreenbergandEstes,2009(D)。
[0072] 图2显示了轮状病毒的细胞进入与复制。当轮状病毒进入细胞时，VP4与VP7丢 失，从而形成双层颗粒（DLP)。dsRNA的转录开始，从而导致VP2、VP4、VP6与VP7的翻译。 在病毒工厂（也称作病毒原质）产生了具有复制酶活性的子代核心。在这些子代核心中发 生后期转录。在病毒工厂（virusfactories)的周围，这些核心被VP6包覆，从而形成出芽 并穿过内质网膜的未成熟DLP，获得经ER驻留病毒糖蛋白NSP4与VP7修饰的瞬时脂膜；这 些包膜的颗粒还包含VP4。当颗粒朝ER潴泡（cisternae)内部移动时，瞬时脂膜和非结构 性蛋白质NSP4丢失，而病毒表面蛋白VP4与VP7重排以形成最外病毒蛋白质层，从而产生 成熟的具有感染性的三层颗粒（参见SwissInstituteofBioinformatics(ViralZone): viralzone.expasy.org/viralzone/all_by_species/107.html)〇
[0073]图 3 显示了农杆菌载体pTRAc、pTRAkc-rbcsl-cTP与pTRAkc-ERH。P35SS，具有重 复转录增强子的CaMV35S启动子；CHS,查耳酮合酶（chalconesynthase)的5'非翻译区； pA35S，CaMV35S多腺苷酸化信号；SAR，烟草Rb7基因的骨架结合区（scaffoldattachment region) ;LB与RB,T-DNA整合的左边界与右边界；ColElori，大肠杆菌（E.coli)的复制起 点；RK2ori，农杆菌（Agrobacterium)的复制起点；bla，氨节青霉素/羧节青霉素抗性bla 基因；LPH，来自鼠mAb24重链的信号肽序列；his6,6XHis标记序列；SEKDEL，ER-驻留信 号序列；rbcsl-cTP，来自马铃薯（Solanumtuberosum)的Rubisco小亚单位基因（rbcSl) 的叶绿体转运肽序列；nptII，卡那霉素抗性nptII基因；Pnos与pAnos，胭脂氨酸合酶 (nopalinesynthase)基因的启动子与多腺苷酸化信号（Maclean等人，2007)。
[0074] 图4显示了轮状病毒克隆和浸润（infiltration)流程的概况。
[0075] 图5显示了质外体蛋白质提取流程。（A)对植物细胞与质外体位置的阐示。VP蛋 白质表达于胞质溶胶中，并且靶向质外体（红色箭头）。（B)-在时间试验后，将植物叶片 用PBS真空浸润（1)，并且置于穿孔离心柱中（2)，然后在2ml微量离心管（Eppendorf)中 离心以收集汁液（3)。
[0076] 图6显示了对7天内在植物叶细胞区室中的轮状病毒VP6蛋白质表达的Western 印迹分析。使用小鼠抗轮状病毒VP6抗体（1:5000)以对膜进行探测。（+)和（-)分别表 示在有或没有沉默抑制子的情况下的表达。红线表示VP6蛋白质在多个分析样品中的位置 (?40kDa)。VP6的表达和提取效率在细胞质中是最佳的。
[0077] 图7显示了Western印迹,其展示了在第3天、在本塞姆氏烟草（N.benthamiana) 植株叶片的细胞质中经组氨酸标记的轮状病毒蛋白质的各自的表达。+ve-细菌表达的轮 状病毒VP2 ;M-分子量标志物；VP-轮状病毒衣壳蛋白质。VP7浸润导致叶片（b)黄化。
[0078] 图8显示了在第3天、祀向多个本塞姆氏烟草（N.benthamiana)植物叶细胞区 室的轮状病毒VP2(a)和VP4(b)的表达。使用分别针对VP2与VP4的鸡抗轮状病毒血清 (1:2000)来探测蛋白质。cTp-叶绿体；ER-内质网；pTRAc-细胞质；A-质外体；阴性对 照（_ve)-仅用沉默抑制子浸润的植物；（a)中的阳性对照组（+ve)-细菌表达的VP2,（b) 中的阳性对照组-细菌表达的VP4;(_与+)有或没有沉默抑制子；M-分子量标志物。箭 头表示所关注的蛋白质条带的位置。
[0079] 图9显示了对在本塞姆氏烟草（N.benthamiana)叶片的细胞质中共表达的 VP2/6/4的第3天提取物的Western印迹分析。用鸡抗轮状病毒血清（抗VP2 (1/5000)与 抗VP4(l/5000))和小鼠抗VP6抗体（1:5000)的混合物探测蛋白质。用沉默抑制子完成重 组农杆菌的浸润。阴性对照（_ve)-仅用沉默抑制子浸润的整株植物；M-分子量标志物。
[0080] 图10显示了经乙酸铀酰（uranylacetate)染色的第3天细胞质提取的轮状病毒 蛋白质的电子显微镜图。（a)具有沉默抑制子的阴性蛋白质样品提取物；(b)VP6蛋白质提 取物；（c)VP2/6蛋白质提取物和（d)VP2/6/4蛋白质提取物。比例条= 200nm。所有检测的 RLP的直径均在70-100nm之间。（b)中的箭头表示VP6鞘/垫（sheath/mat)。（C)中的箭 头表示aRLP的一个实例。所有蛋白质均是在存在沉默抑制子的情况下表达的。所有蛋白 质均用小鼠抗VP6抗体（1:2000)捕获。
[0081] 图11显示了共表达的VP2/6与VP2/6/4的蔗糖梯度纯化（a)。经蔗糖梯度纯化的 VP2/6(b)和VP2/6/4(c)的斑点印迹。将蛋白质提取物加载到蔗糖梯度（10-60%)上并超 速离心。通过用（b)小鼠抗VP6抗体（1:5000)和（c)鸡抗VP2和VP4血清（1:5000)探测 来分析级分。
[0082] 图12显示了对VP2/6的级分的Western印迹分析（a)，对级分VP2/6的级分16与 17的SDS-PAGE考马斯染色凝胶照片（b)，和对级分16与17的Western印迹分析（C)。在 Western印迹法（a)中使用小鼠抗VP6(1:5000)和鸡抗VP2血清（1:5000)，并且在（c)中 仅使用小鼠抗VP6(1:5000)。（a)与（c)中的阴性对照（_ve)-细菌表达的VP4,（b)中的 阴性对照（_ve)-用沉默抑制子浸润和用蔗糖梯度纯化的植物；粗制的-未纯化的VP2/6 提取物；（a)中的阳性对照（+ve) _细菌表达的VP2,（b)与（c)中的阳性对照（+ve)-植 物表达的VP6 ;VP6-SF9 -在SF9昆虫细胞中表达的已知浓度的VP6蛋白质。箭头表示所讨 论的蛋白质条带。
[0083] 图13显示了对经蔗糖密度梯度纯化的VP2/6的级分中总可溶性蛋白质的测定。 (a) -IgG标准曲线，（b) - 750nm下读取的级分的吸光度读值。关注的点：级分16至19。
[0084] 图14显示了对细胞质共表达的VP2/6/4级分的蔗糖密度梯度分析。在750nm读 取原始吸光度读值，以验证先前在VP2/6/4的斑点印迹上检测的蛋白质峰。
[0085] 图15显示了经蔗糖密度梯度纯化的VP2/6颗粒的透射式电子显微镜照片。（a)和 (b) 两者显示在铜网上观察到的两种不同的截面。被检测的所有RLP的直径均在70-100nm 之间。用小鼠抗VP6抗体（1:2000)捕获样品。比例条代表200nm。
[0086] 图16a显示了轮状病毒VP2的氨基酸序列（SEQIDNO:1)和核苷酸序列（SEQID NO: 13和14)。图16b显示了轮状病毒VP4的氨基酸序列（SEQIDNO:2)和核苷酸序列 (SEQIDNO:15和16)。图16c显示了轮状病毒VP6的氨基酸序列（SEQIDNO:3)和核苷 酸序列（SEQIDN0:17和18)。图16d显示了轮状病毒VP7的氨基酸序列（SEQIDN0:4) 和核苷酸序列（SEQIDNO:19和20)。
[0087] 图 17A显示了引物IF-WA_VP2(opt).sl+3c的核苷酸序列（SEQIDNO:21)。图 17B 显示了引物IF-WA_VP2(opt).sl-4r的核苷酸序列（SEQIDNO:22)。图17C显示了构建体 1191的示意图。用于质粒线性化的SacII与StuI限制酶位点被注释在示意图上。
[0088] 图18显示了构建体1191从左t-DNA边界至右t-DNA边界（下划线）的核苷酸序 列（SEQIDN0:23)。具有质体蓝素-P19-质体蓝素沉默抑制子表达盒的2X35S/CPMV-HT/ NOS。
[0089] 图19显示了编码来自轮状病毒AWA株的VP2 (opt)的核苷酸序列（SEQIDNO: 45)。
[0090] 图20显示了来自轮状病毒AWA株的VP2的氨基酸序列（SEQIDNO:25)。
[0091] 图21显示了构建体1710号的示意图。
[0092] 图22A显示了构建体193的示意图。用于质粒线性化的SacII与StuI限制酶位 点被注释于示意图上。图22B显示了构建体193的核苷酸序列（SEQIDNO:26)。构建体 193以从左t-DNA边界至右t-DNA边界的形式被显示（下划线）。2X35S/CPMV-HT/N0S以携 带质体蓝素-P19-质体蓝素沉默抑制子表达盒的方式进入BeYDV(m)+复制酶扩增系统。
[0093] 图23显示了表达盒1710的核苷酸序列（SEQIDNO:27)。表达盒1710号以从 2父355启动子至勵5终止子的形式被显示。来自轮状病毒4 14株的￥?2(〇?〇以下划线表 /Jn〇
[0094] 图24显示了构建体1711号的示意图。
[0095]图 25A显示了引物IF-WA_VP6(opt).sl+3c的核苷酸序列（SEQIDNO:28)。图 25B显示了引物IF-WA_VP6(opt).sl-4r的核苷酸序列（SEQIDN0:29)。图25c显示了从 2X35S启动子至NOS终止子的表达盒1713号（SEQIDNO:30)。来自轮状病毒AWA株的 VP6 (opt)以下划线表示。图25d显示了编码来自轮状病毒AWA株的VP6 (opt)的核苷酸序 列（SEQIDNO:46)。
[0096] 图26显示了来自轮状病毒AWA株的VP6的氨基酸序列（SEQIDNO:31)。
[0097] 图27显示了构建体1713号的示意图。
[0098] 图28显示了表达盒1714号的从2X35S启动子至NOS终止子的核苷酸序列（SEQ IDNO: 32)。来自轮状病毒AWA株的VP6 (opt)以下划线表示。
[0099] 图29显示了构建体1714号的示意图。
[0100]图 30A显示了引物IF-Rtx_VP4(opt).sl+3c的核苷酸序列（SEQIDNO:33)。图 30B显示了引物IF-Rtx_VP4(opt).sl-4r的核苷酸序列（SEQIDNO:34)。
[0101] 图31A显示了表达盒1731号的从2X35S启动子至NOS终止子的核苷酸序列（SEQ IDNO:35)。来自轮状病毒ARotarix株的VP4(opt)以下划线表示。图31B显示了来自 RVA/Vaccine/USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]株的轮状病毒AVP4 的经优化的编 码序列（SEQIDN0:47)。图31C显示了表达盒1730号的从2X35S启动子至NOS终止子的 核苷酸序列（SEQIDNO:44)。来自轮状病毒ARotarix株的VP4 (opt)以下划线表示。
[0102] 图32显示了来自轮状病毒ARotarix株的VP4的氨基酸序列（SEQIDNO:36)。
[0103] 图33A显示了构建体1730号的示意图。图33B显示了构建体1731号的示意图。
[0104]图 34A显示了引物IF-Rtx_VP7(opt).sl+3c的核苷酸序列（SEQIDNO:37)。图 34B显示了引物IF-Rtx_VP7(opt).sl-4r的核苷酸序列（SEQIDNO:38)。图 34C显示了 从2X35S启动子至NOS终止子的表达盒1733号的核苷酸序列。来自轮状病毒A疫苗USA/ Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]株的VP7 以下划线表示（SEQIDN0:24)。图 34D显 示了编码来自轮状病毒A疫苗USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]株的VP7的核苷酸 序列（SEQIDN0:48)。图 34E显示了来自RVA/Vaccine/USA/Rotarix-A41CB052A/1988/ G1P1A[8]株的轮状病毒AVP7的经优化的编码序列（SEQIDNO:54)。
[0105] 图 35 显示了来自轮状病毒A疫苗USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]株的 VP7的氨基酸序列（SEQIDNO:39)。
[0106] 图36显示了构建体1733号的示意图。
[0107] 图 37 显示了引物IF-Rtx_VP7(opt).s2+4c的核苷酸序列（SEQIDNO:40)。
[0108] 图38显示了构建体1192的示意图。用于质粒线性化的SacII与StuI限制酶位 点被注释于示意图上。
[0109] 图39显示了构建体1192从左t-DNA边界至右t-DNA边界的核苷酸序列（下划 线）（SEQIDN0:41)。具有质体蓝素-P19-质体蓝素沉默抑制子表达盒的2X35S/CPMV-HT/ PDISP/N0S被示出。
[0110] 图40A显示了表达盒1735号的从2X35S启动子至NOS终止子的核苷酸序 列（SEQIDNO:42)。来自轮状病毒A疫苗USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8] 株的roiSP/VP7(opt)以下划线表示。图40B显示了编码来自轮状病毒A疫苗USA/ Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]株的PDISP/VP7(opt)的核苷酸序列（SEQIDNO:49)。
[0111] 图 41 显示了来自轮状病毒A疫苗USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]株的 TOISP/VP7 的氨基酸序列（SEQIDNO:43)。
[0112] 图42显示了构建体1735号的示意图。
[0113] 图 43A显示了来自RVA/Simian-tc/ZAF/SAll-H96/1958/G3P5B[2]株的轮状病毒A VP4 的编码序列（SEQIDN0:50)。图 43B显示了来自RVA/Simian-tc/ZAF/SAll-H96/1958/ G3P5B[2]株的轮状病毒AVP4的经优化的编码序列（SEQIDN0:51)。图43C显示了来自 RVA/Simian-tc/ZAF/SAll-H96/1958/G3P5B[2]株的轮状病毒AVP7 的编码序列（SEQID NO:52)。图 43D显示了来自RVA/Simian-tc/ZAF/SAll-H96/1958/G3P5B[2]株的轮状病毒 AVP7的经优化的编码序列（SEQIDNO:53)。
[0114] 图 44A显示 了引物IF-TrSP+Rtx_VP7(opt).sl+3c的核苷酸序列（SEQIDNO: 55)。图 44B显示了引物IF-Rtx_VP7(opt).sl-4r的核苷酸序列（SEQIDNO:56)。图 44C 显示了来自RVA/Vaccine/USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]株的轮状病毒AVP7 的经优化的编码序列的核苷酸序列（SEQIDNO:57)。图44D显示了表达盒1734号的从 2X35S启动子至NOS终止子的核苷酸序列（SEQIDN0:58)。来自轮状病毒A疫苗USA/ Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]株的VP7以下划线表示。图44E显示了来自轮状病毒 A疫苗USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]株的TrSp-VP7 的氨基酸序列（SEQIDNO: 59)。图44F显示了构建体1734号的示意图。
[0115] 图45显示了通过碘克沙醇（iodixanol)密度梯度离心对包含VP2和VP6的类轮状 病毒颗粒的纯化。图45A为对离心前的加载物以及级分1至10进行的考马斯染色SDS-PAGE 分析（级分1在管底部）。箭头显示了轮状病毒抗原的位置。图45B为使用兔多克隆抗轮 状病毒抗体对与（A)中相同的级分进行的Western印迹分析。图45C为使用兔多克隆抗 VP2抗体对与（A)中相同的级分进行的Western印迹分析。
[0116] 图46显示了通过碘克沙醇密度梯度离心对包含VP2、VP6和VP7的类轮状病毒颗 粒的纯化。图46A为对离心前的加载物以及级分1至10进行的考马斯染色SDS-PAGE分析 (级分1在管底部）。箭头显示了轮状病毒抗原的位置。图46B为与（A)中级分相同的使 用兔多克隆抗轮状病毒抗体的Western印迹分析。图46C为与（A)中级分相同的使用兔多 克隆抗VP7抗体的Western印迹分析。
[0117] 图47显示了通过碘克沙醇密度梯度离心的包含VP2、VP4、VP6和VP7的类轮状病 毒颗粒的纯化。图47A为离心前的加载物以及级分1至10的考马斯染色SDS-PAGE分析 (级分1在管底部）。箭头显示了轮状病毒抗原的位置。图47B为使用兔多克隆抗轮状病 毒抗体对与（A)中相同的级分进行的Western印迹分析。图47C为使用兔多克隆抗VP7抗 体对与（A)中相同的级分进行的Western印迹分析。
[0118] 图48显示了通过抗VP4特异性ELISA对包含VP2、VP4、VP6和VP7的经纯化的类 轮状病毒颗粒中VP4含量的评价。
[0119] 图49显示了包含VP2和VP6(左侧部分）和包含VP2、VP4、VP6和VP7(右侧部分） 的经纯化的类轮状病毒颗粒的低温电子显微镜图像。

【具体实施方式】
[0120] 以下是关于优选实施方式的说明。
[0121] 本发明涉及包含一个或更多个轮状病毒结构性蛋白质（即类轮状病毒颗粒、轮状 病毒VLP或RLP)的类病毒颗粒（VLP)以及在植物中生产类轮状病毒颗粒（RLP)的方法。因 此，类轮状病毒颗粒（RLP)可以包含一个或更多个轮状病毒结构性蛋白质。RLP可以是双层 或三层的。
[0122] 本发明部分地提供了在植物中产生类轮状病毒颗粒（RLP)的方法。所述方法可以 包括将包含下述调控区的一个或更多个核酸引入至植物或植物的部分，所述调控区在植物 中具有活性并且操作性地连接至编码一个或更多个轮状病毒结构性蛋白质的核苷酸序列。 这之后在允许所述核酸瞬时表达的条件下培育所述植物或植物的部分后，由此产生了RLP。
[0123] 此外，本发明部分地提供了在植物中产生类轮状病毒颗粒（RLP)疫苗候选物的方 法。所述方法可以包括：将第一核酸、第二核酸和第三核酸引入至该植物、植物的部分或植 物细胞中，所述第一核酸包含在该植物中具有活性并且操作性地连接至编码第一轮状病毒 结构性蛋白质的第一核苷酸序列的第一调控区，所述第二核酸包含在该植物中具有活性并 且操作性地连接至编码第二轮状病毒结构性蛋白质的第二核苷酸序列的第二调控区，所述 第三核酸包含在该植物中具有活性并且操作性地连接至编码第三轮状病毒结构性蛋白质 的第三核苷酸序列的第三调控区。这之后在允许所述第一、第二和第三核酸瞬时表达的条 件下培育所述植物、植物的部分或植物细胞，由此产生了RLP。RLP可以是单层、双层或三层 的。
[0124] "轮状病毒结构性蛋白质"可以表示从轮状病毒分离的轮状病毒结构性蛋白质序 列的所有或一部分，它存在于任何天然或变异型轮状病毒株或分离株中。因此，术语轮状病 毒结构性蛋白质等包括在病毒生命周期期间通过突变产生的或者应答于选择性压力（例 如，药物疗法，宿主细胞趋性的扩张或感染性等）而产生的天然轮状病毒结构性蛋白质序 列变体。如本领域技术人员所理解的，还可以使用重组技术产生这些轮状病毒结构性蛋白 质序列及其变体。
[0125] 此外，结构性蛋白质可以包括衣壳蛋白（例如，VP2与VP6)和/或表面蛋白质（例 如，VP4)。所述结构性蛋白质还可以包括例如VP7。
[0126] 轮状病毒结构性蛋白质的非限制性实例为轮状病毒蛋白质VP2、VP4、VP6和VP7， 以及VP2、VP4、VP6和VP7的片段。可以根据本发明使用的VP2、VP4、VP6和VP7、或VP2、 VP4、VP6和VP7蛋白质的片段的非限制性实例包括来自轮状病毒株G9P[6]、轮状病毒AWA 株、轮状病毒A疫苗USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]株与轮状病毒SAl1株的那些 VP2、VP4、VP6 与VP7 蛋白质。
[0127]VP2结构性蛋白质的实例被示于SEQIDNO:1与SEQIDNO:25的氨基酸序列中， 但这不应被认为是限制性的。此外，VP2结构性蛋白质可以包括SEQIDNO:1、SEQIDNO: 25示出的序列，或与它们具有至少约90-100%序列相似度（包括在这些范围内的任何百分 比相似度，如与它们具有91、92、93、94、95、96、97、98、99%的序列相似度）的序列。另外， VP2结构性蛋白质可以由SEQIDN0:13、14、25或45示出的核苷酸序列编码，或由与它们 具有至少约80-100%序列相似度（包括在这些范围内的任何百分比相似度，如与它们具有 81、 82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99% 的序列相似度）的序 列的编码。
[0128]VP4结构性蛋白质的实例被示于SEQIDNO:2与SEQIDNO:36的氨基酸序列中， 但这不应被认为是限制性的。此外，VP4结构性蛋白质可以包括SEQIDNO:2、SEQIDNO: 36示出的序列，或与它们具有至少约90-100 %序列相似度（包括在这些范围内的任何百分 比相似度，如与它们具有91、92、93、94、95、96、97、98、99%的序列相似度）的序列。另外， VP4结构性蛋白质可以由SEQIDN0:15、16、47、50或51示出的核苷酸序列编码，或由与它 们具有至少约80-100%序列相似度（包括在这些范围内的任何百分比相似度，如与它们具 有 81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99% 的序列相似度）的 序列编码。
[0129]VP6结构性蛋白质的实例被示于SEQIDNO:3与SEQIDNO:31的氨基酸序列中， 但这不应被认为是限制性的。此外，VP6结构性蛋白质可以包括SEQIDNO:3、SEQIDNO: 31示出的序列，或与它们具有至少约90-100%序列相似度（包括在这些范围内的任何百分 比相似度，如与它们具有91、92、93、94、95、96、97、98、99%的序列相似度）的序列。另外， VP6结构性蛋白质可以由SEQIDNO:17、18或46示出的核苷酸序列编码，或由与它们具有 至少约80-100%序列相似度（包括在这些范围内的任何百分比相似度，如与它们具有81、 82、 83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99%的序列相似度）的序列编 码。
[0130]VP7结构性蛋白质的实例被示于SEQIDNO:4与SEQIDNO:39的氨基酸序列中， 但这不应被认为是限制性的。此外，VP7结构性蛋白质可以包括SEQIDNO:4、SEQIDNO: 39和SEQIDNO:43示出的序列，或与它们具有至少约90-100%序列相似度（包括在这些范 围内的任何百分比相似度，如与它们具有91、92、93、94、95、96、97、98、99%的序列相似度） 的序列。另外，VP7结构性蛋白质可以由SEQID勵：19、20、48、49、52、53或54示出的核 苷酸序列编号，或由与它们具有至少约80-100%序列相似度（包括在这些范围内的任何百 分比相似度，如与它们具有 81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、 99 %的序列相似度）的序列编码。
[0131] 可以通过使用BLASTP与TBLASTN程序（其采用BLAST(基本局部比对搜寻工 具）2.0算法）来计算氨基酸序列相似度或同一性。用于计算氨基酸序列相似度或同一性 的技术是本领域技术人员公知的，并且，BLAST算法的使用被描述于ALTSCHUL等人（1990,J Mol.Biol. 215:403-410)和ALTSCHUL等人（1997,NucleicAcidsRes. 25:3389-3402)中。
[0132] 术语"类病毒颗粒（VLP) "或"VLP"指下述结构，所述结构自组装而成并且包含一 个或更多个结构性蛋白质（如，例如，轮状病毒结构性蛋白质，例如但不限于VP2、VP4、VP6 和/或VP7结构性蛋白质）。包含轮状病毒结构性蛋白质的VLP还可被称为"轮状病毒VLP"、 "类轮状病毒颗粒（RVLP) "、"类轮状病毒颗粒（RLP) "、"类轮状病毒颗粒"、"RVLP"或"RLP"。 VLP或RLP通常在形态上和抗原性上与感染中产生的病毒粒子相似，但缺少足以复制的遗 传信息并因而是非感染性的。可以在适合的宿主细胞（包括植物宿主细胞）中生产VLP。 在从宿主细胞提取并在适合条件下分离并进一步纯化后，可以将VLP纯化为完整结构。RLP 可以是单层、双层或三层的RLP。可以通过表达一个轮状病毒结构性蛋白质（如VP2或VP6) 获得单层的RLP。可以通过表达二个轮状病毒结构性蛋白质（如，例如，通过共表达VP2与 VP6两者）获得双层的RLP，这可在有或没有VP4的情况下进行。可以通过至少三个轮状病 毒结构性蛋白质的同时表达（例如，VP2、VP6与VP7的共表达）获得三层的RLP，这可在有 或没有VP4的情况下进行。VP4的共表达导致产生了带有刺突的颗粒，其与天然轮状病毒类 似。可以将VP4加工或切割以产生VP5和VP8。这种加工可以使用内源蛋白酶或通过共表 达合适的蛋白酶（例如，胰蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、糜蛋白酶样蛋白酶、 枯草杆菌蛋白酶）发生于宿主内。备选地，可以在RLP提取流程的任何步骤期间或者在RLP 纯化之后，通过加入适合的蛋白酶（例如，胰蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、糜 蛋白酶样蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶）加工VP4,以产生VP5和VP8。
[0133] 每种轮状病毒结构性蛋白质具有不同的特性和大小，并且对于组装成RLP所需 的量不同。术语"轮状病毒VLP"、"轮状病毒类病毒颗粒（RVLP) "、"轮状病毒类病毒颗粒 (RLP) "、"轮状病毒类病毒颗粒"、"RVLP"或"RLP"是指包含一个或更多个轮状病毒结构性 蛋白质的类病毒颗粒（VLP)。轮状病毒结构性蛋白质的实例可以包括但不限于VP2、VP4(或 者VP5和VP8)、VP6和VP7结构性蛋白质。
[0134] 本发明还提供了在植物中产生RLP的方法，其中编码第一轮状病毒结构性蛋白质 (例如，VP2或VP6蛋白质）的第一核酸（第一核酸）、与编码第二轮状病毒结构性蛋白质 (例如，VP6或VP2蛋白质）的第二核酸共表达。此外，编码第三轮状病毒结构性蛋白质（例 如，VP4或VP7)的第三核酸可以与第一和第二核酸共表达，从而在植物中共表达第一、第二 核酸和第三核酸。第一核酸、第二核酸与第三核酸可以在相同步骤中被引入至植物中，或者 可以顺序引入至植物中。通过共表达编码适合的蛋白酶（例如，胰蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白 酶、丝氨酸蛋白酶、糜蛋白酶样蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶）的核酸，可以在宿主内对VP4进行 加工或切割，以产生VP5和VP8。备选地，可以在RLP提取的任何步骤期间或者在RLP纯化 之后，通过加入可满足的（satiable)蛋白酶（例如，胰蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶、丝氨酸 蛋白酶、糜蛋白酶样蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶）来加工VP4。
[0135] 此外，可以用编码第四轮状病毒结构性蛋白质（例如，VP7或VP4蛋白质）的第四 核酸进一步转化表达第一核酸（编码第一轮状病毒结构性蛋白质）、第二核酸（编码第二轮 状病毒结构性蛋白质）与第三核酸（编码第三轮状病毒结构性蛋白质）的植物，从而使得 第一、第二核酸、第三和第四核酸在植物中共表达。通过共表达编码适合的蛋白酶（例如， 胰蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、糜蛋白酶样蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶）的核 酸，可以在宿主内对VP4进行加工或切割，以产生VP5和VP8。备选地，可以在RLP提取的任 何步骤期间或者在RLP纯化之后，通过加入可满足的蛋白酶（例如，胰蛋白酶、胰蛋白酶样 蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、糜蛋白酶样蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶）来加工VP4。
[0136]此外，可以将表达编码一个或更多个轮状病毒结构性蛋白质（例如，VP2或VP6蛋 白质）的第一核酸的第一植物与表达编码一个或更多个轮状病毒结构性蛋白质（例如但不 限于VP6或VP2蛋白质）的第二核酸的第二植物杂交，以产生共表达分别编码VP2和VP6、或 分别编码VP6和VP2的第一与第二核酸的子代植物（第三植物）。此外，可以将表达分别编 码VP2和VP6、或分别编码VP6和VP2的第一与第二核酸的第三植物与表达编码一个或更多 个轮状病毒结构性蛋白质（例如但不限于VP4或VP7)的第三核酸的第四植物杂交，以产生 共表达分别编码VP2、VP6、和VP4或VP7的第一、第二和第三核酸的进一步的子代植物（第 五植物）。可以使用宿主蛋白酶，或者通过在第一、第二、第三或第四植物之一中共表达编码 适合的蛋白酶（例如，胰蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、糜蛋白酶样蛋白酶、枯 草杆菌蛋白酶）的核酸，在植物内对VP4进行加工或切割，以产生VP5和VP8。备选地，可以 在RLP提取的任何步骤期间或者在RLP纯化之后，通过加入可满足的蛋白酶（例如，胰蛋白 酶、胰蛋白酶样蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、糜蛋白酶样蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶）来加工VP4。
[0137]如以下更详细说明的，可以通过表达编码一个或更多个轮状病毒结构性蛋白质 (例如但不限于VP2、VP6或VP7)的核酸（第一核酸）在植物中生产RLP。可以在植物中共 表达编码第二轮状病毒结构性蛋白质（例如但不限于VP7、VP6或VP2)的第二核酸。此外， 可以在植物中共表达编码第三轮状病毒结构性蛋白质（例如但不限于VP6、VP7或VP2)的 第三核酸。核酸、第二核酸与第三核酸可以在相同步骤中被引入至植物中，或者它们可以被 顺序引入至植物中。核酸、第二核酸与第三核酸可以以瞬时方式或以稳定方式被引入至植 物中。
[0138]此外，可以用编码第二轮状病毒结构性蛋白质（例如但不限于VP6或VP7)的第二 核酸来转化表达编码第一轮状病毒结构性蛋白质（例如，VP2蛋白质）的第一核酸的植物， 从而使得第一核酸与第二核酸两者在植物中共表达。可以用编码第三轮状病毒结构性蛋白 质（例如但不限于VP7或VP6)的第三核酸对所述植物进行进一步的转化。
[0139]备选地，可以用编码VP2蛋白质的第一核酸来转化表达VP6或VP7蛋白质（第二 核酸）的植物，从而使得第一核酸与第二核酸两者在植物中共表达。可以用编码第三轮状 病毒结构性蛋白质（例如但不限于VP7或VP6)的第三核酸对所述植物进行进一步的转化。
[0140]另外，可以用编码第三轮状病毒结构性蛋白质（例如，VP4或VP7)的第三核酸来 转化表达编码第一和第二轮状病毒结构性蛋白质（例如，VP2和VP6蛋白质）的第一和第 二核酸的植物。通过共表达编码适合的蛋白酶（例如，胰蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶、丝氨 酸蛋白酶、糜蛋白酶样蛋白酶、枯草杆菌蛋白酶）的核酸，可以对VP4进行加工或切割，以产 生VP5和VP8。备选地，可以在RLP提取的任何步骤期间或者在RLP纯化之后，通过加入可 满足的蛋白酶（例如，胰蛋白酶、胰蛋白酶样蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、糜蛋白酶样蛋白酶、枯 草杆菌蛋白酶）来加工VP4。
[0141] 本发明还提供了在植物中产生RLP的方法，所述方法包括将一个或更多个核酸引 入至植物、植物的部分或植物细胞中，所述一个或更多个核酸编码一个或更多个轮状病毒 结构性蛋白质、并且操作性地连接至在植物中具有活性的调控区、和一个或一个以上区室 靶向序列和/或扩增元件。然后，在允许所述一个或更多个核酸表达的条件下培养植物、 植物的部分或植物细胞，由此产生RLP。所述一个或更多个轮状病毒结构性蛋白质可以是 VP2、VP4 (或VP5 和VP8)、VP6、VP7,VP2、VP4 (或VP5 和VP8)、VP6、VP7 的片段或其组合。
[0142] 本发明还提供了包含一个或更多个轮状病毒结构性蛋白质的RLP，所述轮状病毒 结构性蛋白质例如但不限于VP2、VP4(或VP5和VP8)、VP6、VP7或其组合。可以通过如本 发明所提供的一个或更多个方法产生RLP。
[0143] 可以使用任何适合的方法，例如密度梯度离心或尺寸排除色谱来检测RLP的出 现。可以通过例如电子显微镜或通过尺寸排除色谱来评估RLP的结构和大小。
[0144] 对于尺寸排除色谱而言，可以通过在提取缓冲液中将经冷冻-挤压的植物材料样 品勻楽化（PoIytron)，来从植物组织中提取总可溶性蛋白质，并通过离心除去不溶材料。用 冰冷的丙酮或PEG进行沉淀也可能是有益的。对可溶性蛋白质进行定量，并将提取物通过 Sephacryl?柱，例如Sephacryl?S500柱。可以使用BlueDextran2000作为校准标准 品。在色谱法后，可以通过免疫印迹法进一步分析级分，以确定级分的蛋白质补体（protein complement) 〇
[0145] 例如，分离的级分可以是上清液（如果通过离心、沉积或沉淀）或滤液（如果通过 过滤），并且富集了蛋白质或超结构蛋白质，如例如纳米管，纳米球，或较高阶、较高分子量 的颗粒，如单层（si)、双层（dl)或三层（tl)的RLP。
[0146] 可以通过例如额外的离心步骤、沉淀、色谱步骤（例如，尺寸排除色谱、离子交换 色谱、亲和色谱）、切向流过滤或它们的组合，对经分离的级分进行进一步加工，以对蛋白 质、超结构蛋白质或较高阶的颗粒进行分离、纯化、浓缩或它们的组合。可以通过例如天然 或SDS-PAGE、使用适当检测抗体的免疫分析、毛细管电泳、电子显微镜或对本领域技术人员 显而易见的任何其它方法确认纯化的蛋白质、超结构蛋白质或较高阶颗粒（如RLP)的存 在。
[0147] 根据本发明产生的RLP可纯化或部分纯化自植物、植物的部分或植物材料，或者 其可以使用如本领域技术人员所知的方法作为经口疫苗施用。
[0148]RLP纯化可以包括梯度离心，例如，蔗糖、碘克沙醇、OptiPr印"或氯化铯（CsCl)密 度梯度可用于从经转化的植物的生物质来纯化或部分纯化RLP。如例如图45中所示，可以 使用碘克沙醇步骤梯度或碘克沙醇连续梯度来纯化RLP和/或表达的轮状病毒结构性蛋白 质。
[0149] 已显示钙（Ca2+)浓度对三层颗粒（TLP)向双层颗粒（DLP)转化很重要，并且其是 毒株依赖性的（参见，例如Martin等人.JournalofVirology,Jan2002,该文献通过引 用并入本文）。外衣壳蛋白质从TLP的完全丢失（TLP脱帽作用）在[Ca2+]纳摩尔的范围 中发生。因此，RLP的纯化和/或提取可以在存在钙的情况下进行，并且梯度离心步骤可以 在存在钙的情况下进行，例如，在存在CaCl2的情况下进行。例如，CaC12的浓度可以在ImM 至IOOOmM之间，或者可以是它们之间的任何量，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、 15、20、25、30、40、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、50、600、650、700、750、800、 850、900、950mM或者它们之间的任何量。
[0150] 可以对植物或植物碎片进行最小程度的加工。术语"最小程度的加工"指下述植 物材料，例如，被部分纯化以获得植物提取物、匀浆、植物匀浆部分等（即最小程度地加工） 的、包含所关注的蛋白质和/或RLP的植物或其部分。部分纯化可包括但不限于破坏植物 细胞结构，由此产生包含可溶性植物成分、以及不溶性植物成分（可以通过例如但不限于 离心、过滤或其组合分离）的组合物。在这方面，可以使用真空或离心提取而容易地获得在 叶片或其它组织的细胞间隙内分泌的蛋白质，或者组织可在压力下被提取，这通过滚筒或 研磨等进行，以从细胞间隙内挤压或释放蛋白质。最小程度的加工还可以包括对可溶性蛋 白质的粗提物的制备，因为这些制备可能将具有来自次级植物产物的可忽略的污染。此外， 最小程度的加工可以包括从叶片对可溶性蛋白质进行水溶液提取，然后用任何适合的盐进 行沉淀。其它方法可以包括大规模浸渍和汁液提取，以使得提取物能够直接使用。可以使 用任何适合的方法（例如，机械提取或生化提取）来纯化或提取RLP。
[0151] 一个或更多个轮状病毒结构性蛋白质可以以相对每公斤植物鲜重而言高达2g的 量被合成。例如，合成的结构性蛋白质的量可以在相对每公斤植物鲜重而言1至2g之间， 或者是它们之间的任何量，如相对每公斤鲜重而言为I. 〇、l. 1、1. 2、1. 3、1. 4、1. 5、1. 6、1. 7、 1.8、1.9、2g或者它们之间的任何量。例如，结构性蛋白质可以以相对每公斤植物鲜重而言 高达1.54g的量合成。
[0152] 此外，RLP可以以相对每公斤植物鲜重而言高达I. 5g的量被合成。例如，合成的 RLP的量可以为相对每公斤植物鲜重而言0. 5至I. 5g之间，或者是它们之间的任何量，如相 对每公斤植物鲜重而言为 〇. 5、0. 6、0. 7、0. 8、0. 9、1. 0、1. 1、1. 2、1. 3、1. 4、1. 5g。例如，RLP 可以以相对每公斤植物鲜重而言高达I.Ig的量被合成。
[0153] 可以通过例如动态光散射（DLS)或电子显微镜（EM)技术来测量上文定义的RLP 的尺寸（即直径），该尺寸通常在50至IlOnm之间，或者为它们之间的任何尺寸。例如，完 整RLP结构的尺寸可以在约70nm至约IlOnm的范围内，或者是它们之间的任何尺寸，例如， 75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、IOOnm、105nm或者是它们之间的任何尺寸。
[0154] 本发明还提供了包含下述核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码一个或更多个 轮状病毒结构性蛋白质并操作性地连接至在植物中具有活性的调控区。可以针对例如人密 码子的使用或植物密码子的使用对核苷酸序列进行优化。此外，一个或更多个轮状病毒结 构性蛋白质可以操作性地连接至一个或一个以上的扩增元件。另外，一个或更多个轮状病 毒结构性蛋白质可以操作性地连接至一个或一个以上的区室靶向序列。通过所述核苷酸序 列编码的一个或更多个轮状病毒结构性蛋白质可以是例如VP2、VP4、VP6或VP7。此外，通 过所述核苷酸序列编码的一个或更多个轮状病毒结构性蛋白质可以来自例如，组A至组G 的任何轮状病毒，但更优选地来自组A的轮状病毒。此外，通过所述核苷酸序列编码的一个 或更多个轮状病毒结构性蛋白质可以来自具有从Gl至G27和从Pl至P34 (更优选地从Gl 至G19和从Pl至P27)的G-型与P-型的任何组合的基因型的任何轮状病毒株，包括但不 限于GlP[8]、G2P[4]、G2P[8]、G3P[8]、G4P[8]、G9P[6]、G9P[8]、轮状病毒AWA株、轮状病 毒A疫苗USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]株或轮状病毒SAll株。
[0155] 对本发明中提到的核酸序列而言，如果所述核酸序列与一条或一条以上如本文所 定义的核苷酸序列或核苷酸序列的互补序列在严格杂交条件下杂交，则所述核酸序列可以 是与所述序列或所述序列的互补序列"基本同源的"、"基本相似的"或"基本同一的"。对复 数条序列而言，当核苷酸中的至少约70%、或70%至100%之间、或它们之间的任何量（例 如，70、72、74、76、78、80、82、84、86、88、90、92、94、96、98、100%或它们之间的任何量）在核 苷酸序列的给定长度上匹配时，所述序列是"基本同源的"、"基本相似的"或"基本同一的"， 但前提是这些同源序列显示出该序列的或如本文所述的编码产物的一种或一种以上的性 质。
[0156] 例如，本发明提供了经分离的多核苷酸，其包含编码一个或更多个轮状病毒结构 性蛋白质的核酸，所述轮状病毒结构性蛋白质与例如SEQIDNO:13、14、15、16、17、18、19、 20、45、46、47、49、50、51、52、53、54 中所定义的序列具有至少 60%、65%、70%、75%、80%、 85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %,99 %, 100%或者它们之间的任何量的同一性。所述多核苷酸可以是通过本领域中已知的任何方 法进行了人密码子优化的多核苷酸。
[0157] 此外，本发明提供了包含轮状病毒结构性蛋白质的RLP，所述轮状病毒结构性蛋 白质是例如通过下述核酸编码的，所述核酸与例如SEQIDNO:13、14、15、16、17、18、19、 20、45、46、47、49、50、51、52、53、54 中所定义的序列具有至少 60%、65%、70%、75%、80%、 85 %,86 %,87 %,88 %,89 %,90 %,91 %,92 %,93 %,94 %,95 %,96 %,97 %,98 %,99 %, 100 %或它们之间的任何量的同一性。
[0158] 可以使用核苷酸序列比较程序来确定所述序列相似度或同一性，如DNASIS内所 提供的（其中使用例如但不限于下列参数：缺口罚分（GAPpenalty)为5、#顶部对角线 为5、固定缺口罚分为10、k元（ktuple)为2、浮动缺口（floatinggap)为10,以及窗口 尺寸为5)。但本领域还公知其它用于比较的序列比对方法，例如Smith&Waterman的算法 (1981，Adv.Appl.Math.2:482)、Needleman&Wunsch的算法（J.Mol.Biol. 48:443, 1970)、 Pearson&Lipman的算法（1988,Proc.Nat'I.Acad.Sci.USA85:2444)以及这些算法 的计算机化实施（GAP、BESTFIT、FASTA与BLAST，可通过NIH获得），或通过手动比对 和目视检查（参见，例如，CurrentProtocolsinMolecularBiology,Ausubel等人 主编.1995supplement)，或使用严格条件下的Southern或Northern杂交法（参见， Maniatis等人于MolecularCloning(ALaboratoryManual),ColdSpringHarbor Laboratory，1982中记载的）。优选地，基本同源的序列在分子的给定长度上显示出至少约 80 %，并且最优选地至少约90 %的序列相似度。
[0159] -种此类严格杂交条件的实例可以是在65°C下在4XSSC中杂交过夜（约16-20 小时），然后在65°〇下以0.1\55(：清洗1小时，或者在651：下以0.1\55(：清洗两次，每次 20或30分钟。备选地，一种示例性严格杂交条件可以是在42°C下在50%甲酰胺、4XSSC中 杂交过夜（16-20小时），然后在65°〇下以0.1\55(：清洗1小时，或者在651：下以0.1\55〇 清洗两次，每次20或30分钟；或者可以是在65 °C下在Church磷酸盐水性缓冲液（7% SDS;0. 5MNaP04缓冲液，pH7. 2 ;10mMEDTA)中杂交过夜（16-20小时），并在50°C下以 0. 1XSSC、0. 1%SDS清洗两次，每次20或30分钟，或在65°C下以2XSSC、0. 1%SDS清洗 两次，每次20或30分钟（针对独特的序列区域）。
[0160] 可以将编码轮状病毒结构性多肽的核酸描述为"轮状病毒核酸"、"轮状病毒核苷 酸序列"、"轮状病毒核酸"或"轮状病毒核苷酸序列"。例如，可以将包含一个或更多个轮状 病毒结构性蛋白质或轮状病毒结构性多肽的类病毒颗粒描述为"轮状病毒VLP"、"RVLP"或 "RLP"，但这不应被视为限制。
[0161] 多种生物在延伸的肽链中显示出使用特定密码子来编码特定氨基酸插入的偏好。 密码子优选或密码子偏好（生物之间密码子使用的差异）由遗传密码的简并度承担，并且 被很好地记录于多种生物中。密码子偏好通常与信使RNA(mRNA)的翻译效率相关，其进而 被认为取决于要翻译的密码子的性质以及特定转运RNA(tRNA)分子的可用性等等。细胞中 所选择的tRNA的优势通常是对肽合成中最常使用的密码子的反映。因此，可以基于密码子 优化对基因进行调整，以实现在给定的生物中的最优基因表达。优化编码异源表达的蛋白 质的核苷酸序列的过程可能是提高表达产量的重要步骤。优化的要求可以包括提高宿主生 产外来蛋白质的能力的步骤。
[0162] "密码子优化"被定义为：通过用在另一生物或物种的基因中可能更常用或最常用 的密码子代替天然序列的至少一个、大于一个或显著数量的密码子来修饰核酸序列，以提 高在所关注的细胞中的表达。多种物种显示出对特定氨基酸的某些密码子的特定偏好。
[0163] 本发明包括已经经过密码子优化的合成多核苷酸序列，例如，已经针对人密码子 使用或植物密码子使用优化过的序列。然后，可以在植物中表达经密码子优化的多核苷酸 序列。更具体地，可以在植物中表达针对人密码子的使用或植物密码子的使用优化过的序 列。在不希望被理论束缚的情况下，认为针对人密码子优化过的序列提高了序列的鸟嘌 呤-胞嘧啶含量（GC含量），并且改善了在植物中的表达产量。
[0164] 本领域中已知存在不同的密码子优化技术，用于改善翻译低效的蛋白质编码区的 翻译动力学。这些技术主要依赖于鉴定针对特定宿主生物的密码子使用。如果在该生物中 应表达特定基因或序列，那些此类基因和序列的编码序列将被修饰，从而用宿主生物中更 常用的密码子代替所关注序列的密码子。
[0165] 可以在包含基于病毒的DNA或RNA表达系统的表达系统中表达轮状病毒结构性蛋 白质或多肽，所述表达系统例如但不限于基于豇豆花叶病毒（comovirus)的表达盒和基于 双生病毒（geminivirus)的扩增元件。
[0166] 如本文所述的表达系统可以包括基于二分病毒（bipartitevirus)或带有二分 基因组（bipartitegenome)的病毒的表达盒。例如，二分病毒可以是紅豆花叶病毒科 (Comoviridaefamily)的。紅豆花叶病毒科的属包括紅豆花叶病毒属（Comovirus)、懦传 病毒属（Nepovirus)、豆科病毒属（Fabavirus)、搜桃挫叶病毒属（Cheravirus)和温州蜜 柑矮缩病毒属（Sadwavirus)。SEs?花叶病毒属包括紅S?花叶病毒（CPMV)、紅3?严重花叶 病毒（CPSMV)、南瓜花叶病毒（SqMV)、红三叶草斑驳病毒（RCMV)、菜豆荚斑驳病毒（BPMV)、 芜菁环斑病毒（TuRSV)、蚕豆真花叶病毒（BBtMV)、蚕豆染色病毒（BBSV)、萝卜花叶病毒 (RaMV)。包含可以用于本发明的多个方面的增强子元件的豇豆花叶病毒RNA-2序列的实例 包括但不限于：CPMVRNA-2(GenBank登录号No.NC_003550)、RCMVRNA-2(GenBank登录号 No.NC_003738)、BPMVRNA-2(GenBank登录号No.NC_003495)、CPSMVRNA-2(GenBank登录 号No.NC_003544)、SqMVRNA-2(GenBank登录号No.NC_003800)、TuRSVRNA-2(GenBank登 录号No.NC_013219.I)、BBtMVRNA-2(GenBank登录号No?⑶810904)、BBSVRNA2(GenBank 登录号No.FJ028650)、RaMV(GenBank登录号No.NC_003800)。
[0167] 二分豇豆花叶病毒RNA基因组的片断指RNA-I与RNA-2。RNA-I编码参与复制的 蛋白质，而RNA-2编码细胞-细胞运动所需的蛋白质以及两个衣壳蛋白。可以使用任何适 合的基于豇豆花叶病毒的盒，包括CPMV、CPSMV、SqMV、RCMV或BPMV，例如，所述表达盒可以 基于CPMV。
[0168] "表达盒"指下述核苷酸序列，所述核苷酸序列包含所关注的核酸，所述核酸处于 用于在宿主细胞中转录所述所关注的核酸的适合的启动子或其它调控元件的控制下，并且 可操作地（操作性地）连接至所述适合的启动子或其它调控元件。
[0169] 表达系统还可以包含来自双生病毒（geminivirus)的扩增元件，例如，来自豆类 黄矮病毒（BeYDV)的扩增元件。BeYDV属于Mastreviruses属（其适应于双子叶植物）。 BeYDV是具有单链环状DNA基因组的单分病毒（monopartite)，并且它可以通过滚环机制复 制至非常高的拷贝数。BeYDV来源的DNA复制子载体系统已被用于在植物中进行快速、高产 量的蛋白质生产。
[0170] 如本文所使用的，术语"扩增元件"指包含双生病毒基因组的一个或更多个长基因 间区（longintergenicregion)或长基因间重复（longintergenicrepeat,LIR)的至 少一部分的核酸片断。如本文所使用的，"长基因间区"或"长基因间重复"指包含rep结 合位点的长基因间区的区域，所述rep结合位点能够介导通过双生病毒Rep蛋白质进行的 切除和复制。在一些方面，包含一个或更多个LIR的核酸片断还可以包含双生病毒基因组 的短基因间区或小基因间区（SIR)。如本文所使用的，"短基因间区"或"小基因间区"指 互补链（Mastrevirus的短IR(SIR))。可以在本文中使用任何适合的来源于双生病毒的扩 增元件。参见，例如，W02000/20557;W02010/025285;ZhangX?等人（2005，Biotechnology andBioengineering,Vol.93,271-279),HuangZ?等人（2009,Biotechnologyand Bioengineering，Vol. 103,706-714),HuangZ?等人（2009,Biotechnologyand Bioengineering,Vol. 106,9-17);以上文献通过引用并入本文）。如果在构建体中使用了 多于一个LIR，例如，两个LIR，那么启动子、CMPV-HT区和所关注的核酸序列以及终止子 被两个LIR中的每个围住。此外，扩增元件可以例如来源于Halley-Stott等人.（2007) ArchivesofVirologyl52:1237-1240 中公开的序列，其以GenBank登录号DQ458791(其 通过引用并入本文）登记。包含LIR的核酸片段是连接的核苷酸2401?2566与1?128。 包含SIR的核酸片段是核苷酸1154?1212。
[0171] 如本文所述，通过烟草本塞姆氏（Nicotianabenthamiana)叶片的农杆菌渗入进 行的对来源于豆类黄矮病毒（BeYDV)的载体和R印/RepA供给载体的共递送导致了高效的 复制子扩增和强大的蛋白质生产。
[0172] 基于豇豆花叶病毒的表达盒和来源于双生病毒的扩增元件可以包含于不同的载 体上，或者，各组成部分可以被包含在一个载体中。如果使用两个载体，则可以将第一和第 二载体同时或分别引入至植物细胞中。
[0173] 还可以将病毒复制酶包括在如本文所述的表达系统中，以提高所关注的核酸的 表达。复制酶的非限制性实例是编码BeYDVR印与R印A的BeYDV复制酶（pREPllO) (C2/ Cl;Huang等人，2009,Biotechnol.Bioeng. 103,706-714 ;该文献通过引用并入本文）。在 Halley-Stott等人.（2007)ArchivesofVirology152:1237-1240 中公开了复制酶的另 一个非限制性实例，其以GenBank登录号DQ458791(其通过引用并入本文）登记。包含 Cl:C2基因的核酸片断是核苷酸1310至2400。
[0174] "共表达"指两条或两条以上核苷酸序列在大致相同的时间被表达于植物内和该 植物的相同组织内。然而，核苷酸序列不必在完全相同的时间表达。相反，两条或更多条核 苷酸序列以使编码产物有机会相互作用的方式表达。使用瞬时表达系统可以共表达两条 或超过两条的核苷酸序列，其中在两条序列均表达的条件下在大致相同的时间将两种或更 多种序列引入到植物内。备选地，可以使用以瞬时方式引入平台植物的编码所关注蛋白质 (例如，一个或更多个轮状病毒结构性蛋白质）的其它序列，以稳定的方式转化包含核苷酸 序列之一的平台植物。
[0175] 蛋白质的正确折叠对蛋白质的稳定性、多聚体的形成、RLP的形成与功能可能是重 要的。蛋白质的折叠可以受一种或多种因素的影响，这些因素包括但不限于：蛋白质的序 列，蛋白质的相对丰度，细胞内拥挤程度，可以与折叠、部分折叠或未折叠的蛋白质结合或 与它们瞬时相关的辅因子的可用性。此外，表达蛋白质的植物内的区室或亚区室可影响蛋 白质的折置和表达水平。
[0176] 可以在转基因植物中通过农杆菌浸润将一个或更多个轮状病毒结构性蛋白质的 表达靶向至特定的植物细胞区室和/或亚区室。区室或亚区室可以例如为质体、内质网 (ER)、叶绿体或质外体。在不希望受理论束缚的情况下，区室或亚区室靶向可以将蛋白质向 所靶向的区室或亚区室中的积累提高至超过细胞质积累。区室或亚区室积累可以保护蛋白 质免于被细胞质中存在的蛋白酶降解和/或允许其积累至更高的浓度而不影响植物细胞 的功能。
[0177] 因此,可以对表达盒或载体加以改变，以使其适合将载体或从载体表达的轮状病 毒结构性蛋白质或多肽引导至植物中的目标区室或亚区室。
[0178] 例如，可以通过使得表达的轮状病毒结构性蛋白质或多肽包括能够与质体的类囊 体膜相互作用的部分（特别地，类囊体膜的转运机制），对表达盒或载体加以改变，以使其 适合于靶向质体。这种相互作用可以导致轮状病毒结构性蛋白质或多肽从表达它的细胞质 输入至质体。在不希望受理论束缚的情况下，从细胞质的输入机制对于蛋白质的正确折叠 来说可能是重要的。应当理解，可对表达盒或载体加以改变，以使得其适合于靶向质体本 身从而成为经转化的状态，并且轮状病毒结构性蛋白质或多肽的表达可以完全在质体内发 生。
[0179] 术语"靶向序列"指靶向序列可以包括在载体或表达盒中。可以将此类靶向序列 翻译成将载体或其产物引导至植物中的目标区室或亚区室（例如，质体）的肽。例如，用于 将蛋白质靶向至质体的质体信号肽（在本领域中还称为"质体转运肽"）在本领域中是已知 的。可以使用的质体转运肽的非限制性实例是rbcsl-cTP。叶绿体转运肽序列的适合的实 例为来自例如马铃薯（Solanumtuberosum)的Rubisco小亚单位基因（rbcSl)。
[0180]因此，轮状病毒结构性蛋白质或多肽可以包括与多肽或蛋白质的其余部分相同来 源或异源的信号肽。术语"信号肽"在本领域中是公知的，并且通常是指短的（约5-30个氨 基酸的）氨基酸序列，其通常被发现于多肽的N端，可以指导新翻译的多肽转位至特定细胞 器，协助多肽链的特定结构域相对于其它结构域的定位。作为非限制性实例，所述信号肽可 以将蛋白质的转位靶向至内质网，和/或协助新生多肽的N端近端结构域相对于膜锚定结 构域的定位，从而辅助成熟蛋白质（例如，轮状病毒结构性蛋白质，但这不应被视为限制） 的切割和折置。
[0181] 信号肽（SP)可以是对蛋白质或病毒蛋白质而言天然的，或者信号肽可以是相对 于要表达的蛋白质或病毒蛋白质的一级序列而言异源的。例如，轮状病毒结构性蛋白质的 天然信号肽可以用于在植物系统中表达轮状病毒结构性蛋白质。
[0182] 信号肽也可以是非天然的，例如，来自蛋白质、病毒蛋白质或除轮状病毒蛋白质之 外的病毒的天然结构性蛋白质，或者来自植物、动物或细菌的多肽。可以使用的信号肽的非 限制性实例是苜蓿（alfalfa)的蛋白质二硫键异构酶（PDISP)(登录号No.Z11499的核苷 酸32-103)。此外，信号肽可完全缺失或被截短。截短或其各种词性形式表示从信号肽上缺 失了 1%、5%、10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、 75%、80 %、85%、90 %、95%、100 %或它们之间的任何量的氨基酸残基。优选地，截短的氨 基酸残基是连续的，并且截短从第二个甲硫氨酸向前发生。
[0183] 本发明由此提供了包含天然、非天然信号肽或截短的信号肽的轮状病毒结构性蛋 白质，如，例如VP2、VP4、VP6和/或VP7,以及提供了编码这些轮状病毒结构性蛋白质的核 酸。
[0184] 可以在经本发明所述的核苷酸序列、构建体或载体转化的任何适合的植物宿主中 表达本发明的一个或多于一个的遗传构建体。适合的宿主的实例包括但不限于农作物，包 括苜猜、油菜籽、芸苔属（Brassicaspp.)、玉米、烟草属（Nicotianaspp.)、马铃薯、人参、 豌豆、燕麦、水稻、大豆、小麦、大麦、向日葵、棉花等。
[0185] 可以使用1、2、3、4或5个二元质粒载体将编码轮状病毒结构性蛋白质的核苷酸序 列转移进植物宿主中。因此，每个二元质粒载体可以包含1、2、3、4或5个编码轮状病毒结 构性蛋白质的核苷酸序列。
[0186] 本发明的一个或更多个遗传构建体还可以包含3'非翻译区。3'非翻译区指包含 下述DNA片断的基因部分，所述DNA片断含有多腺苷酸化信号和能够使mRNA加工或基因 表达有效进行的任何其它调节信号。多腺苷酸化信号的特征一般在于使得向mRNA前体的 3'端添加多腺苷酸链得以有效进行。多腺苷酸化信号通常通过与标准形式5'AATAAA-3' 的同源性的存在来识别，但是变异也不少见。适合的3'区的非限制性实例是含有以下基 因的多腺苷酸化信号的3'经转录的非翻译区，所述基因为：农杆菌（Agrobacterium)致瘤 (Ti)质粒基因（如胭脂氨酸合酶（NOS)基因）、植物基因（如大豆贮藏蛋白基因）、核酮 糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚单位的基因（ssRUBISCO;US4962028,其通过引用并入本文）、 在US7125978(其通过引用并入本文）中描述的用于调控质体蓝素表达的启动子。
[0187] 需要时，本发明的一个或更多个遗传构建体还可以包含其它增强子（翻译增强子 或转录增强子）。增强子可以位于将要转录的序列的5'或3'。增强子区域是本领域技术 人员公知的，其可以包含ATG起始密码子、邻近序列（adjacentsuquences)等。起始密码 子存在时，其可以处于符合编码序列的阅读框的状态（"框内的"），以提供经转录的序列的 正确翻译。
[0188] 可以使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电穿孔等 将本发明的构建体引入到植物细胞中。关于这些技术的综述,参见例如Weissbachand Weissbach,MethodsforPlantMolecularBiology,AcademyPress,NewYorkVIII，pp 421-463(1988);GeiersonandCorey，PlantMolecularBiology，第 2 版.（1988);和 MikiandIyer,FundamentalsofGeneTransferinPlants，InPlantMetabolism，第2 版，DT.Dennis,DHTurpin,DDLefebrve,DBLayzell(eds),Addisonffesly,LangmansLtd.London,pp. 561-579(1997)。其它方法包括直接DNA摄入、脂质体的使用、电穿孔（例如，使 用原生质体）、显微注射、微弹轰击（microprojectile)或晶须（whiskers)、以及真空渗入 (vacuuminfiltration)。参见，例如，Bilang等人（Gene100:247-250 (1991))、Scheid等人 (Mol.Gen.Genet. 228:104-112, 1991)、Guerche等人（PlantScience52:111-116, 1987)、 Neuhause等人（Theor.ApplGenet. 75:30-36，1987)、Klein等人（Nature 327:70-73(1987));Howell等人（Science208:1265, 1980)、Horsch等人（Science 227:1229-1231，1985)、DeBlock等人（PlantPhysiology91:694-701，1989)、Methodsfor PlantMolecularBiology(WeissbachandWeissbach主编，AcademicPressInc.，1988)、 MethodsinPlantMolecularBiology(SchulerandZielinski主编,Academic PressInc. ,1989)、LiuandLomonossofT(JVirolMeth, 105:343-348,2002)、美国 专利No. 4945050 ;5036006 ;和5100792,1995年5月10日提交的美国专利申请序列号 No. 08/438666和1992年9月25日提交的美国专利申请序列号No. 07/951715(以上所有文 献通过引用并入本文）。
[0189] 瞬时表达
[0190] 在不希望受理论束缚的情况下，不同的轮状病毒结构性蛋白质的蛋白质浓度和比 例对于RLP的组装效率来说可能是重要的。因此，感染的多重性和时间对于控制植物中的 蛋白质浓度以及RLP的整体组装效率来说可能是重要的。
[0191] 本发明的构建体可以在植物或植物的部分中瞬时表达。依赖于重组农杆 菌（Agrobacteriumtumefaciens)在植物、植物的部分或植物细胞中的染色体外 (epichromosomal)表达的瞬时表达系统可以用于表达被祀向至多个细胞区室或亚区室的 轮状病毒结构性蛋白质。瞬时表达系统允许实现高的生产速度。此外，在重组农杆菌于植 物中浸润后的数天内，可以获得大量蛋白质（Rybicki，2010;Fischer等人，1999)。还可表 达长基因序列，并且使得多于一个基因在相同细胞中同时表达，从而允许多聚体蛋白质高 效组装（Lombardi等人，2009)。
[0192] 编码轮状病毒结构性蛋白质的核苷酸序列可被转移至植物宿主中，至1、2、3、4或 5 个转化的农杆菌（Agrobacteriumtumefaciens)菌株。
[0193] 然而，在瞬时表达期间，转录后基因沉默可能会限制植物中异源蛋白质的表达。沉 默抑制子（例如，但不限于来自番爺斑萎病毒（Tomatospottedwiltvirus)的Nss)的 共表达可以用于抵消转基因mRNA的特异性降解（Brigneti等人，1998)。备选的沉默抑制 子在本领域中是公知的，并且可以按本文所述的那样被使用（Chiba等人，2006,Virology 346:7-14;该文献通过引用并入本文），例如但不限于HcPro、TEV-pl/HC-Pro(烟草蚀刻 病毒-pl/HC-Pro)、BYV-p21、番茄丛矮病毒的pl9(TBSVpl9)、番茄皱缩病毒的衣壳蛋白 质（TCV-CP)、黄瓜花叶病毒的2b(CMV-2b)、马铃薯病毒X的p25(PVX-p25)、马铃薯病毒M 的pll(PVM-pll)、马铃薯病毒S的pll(PVS-pll)、蓝莓枯萎病毒pl6(BScV-pl6)、柑橘速 衰病毒的p23 (CTV-p23)、葡萄藤卷叶联合病毒-2的p24 (GLRaV-2p24)、葡萄藤病毒A的 plO(GVA-plO)、葡萄藤病毒B的P14(GVB-pl4)、白芷潜伏病毒的plO(HLV-plO)或大蒜普通 潜伏病毒的P16(GCLV-pl6)。因此，沉默抑制子（例如，HcPro、TEV-pl/HC-Pro、BYV-p21、 TBSVpl9、TCV-CP、CMV-2b、PVX-p25、PVM-pll、PVS-pll、BScV-pl6、CTV-p23、GLRaV-2p24、 GBV-pl4、HLV-plO、GCLV-pl6或GVA-plO)可以与一个或更多个轮状病毒结构性蛋白质（例 如，VP2、VP4、VP6或它们的组合）一起共表达，以进一步确保植物或植物的部分内高水平的 蛋白质广生。
[0194] 本发明还提供了如上所述的方法，其中，其它的（第二、第三、第四或第五）核苷 酸序列在植物内表达，编码沉默抑制子的其它的（第二、第三、第四或第五）核苷酸序列操 作性地与在植物中具有活性的其它的（第二、第三、第四或第五）调控区连接。编码沉默 抑制子的核苷酸序列可以是例如Nss、HcPro、TEV-pl/HC-Pro、BYV-p21、TBSVpl9、TCV-CP、 CMV-2b、PVX-p25、PVM-pll、PVS-pll、BScV-pl6、CTV-p23、GLRaV-2p24、GBV-pl4、HLV-plO、 GCLV-p16 或GVA-plO。
[0195] 如下所述，可以使用瞬时表达方法来表达本发明所述的构建体（参见Liuand Lomonossoff, 2002,JournalofVirologicalMethods, 105:343-348;该文献通过引用并 入本文）。备选地，可以使用基于真空的瞬时表达方法，如Kapila等人，1997 (该文献通过引 用并入本文）所述。这些方法可以包括（例如，但不限于）农杆菌接种（Agro-inoculation) 或农杆菌浸润（Agro-infiltration)、注射器浸润（syringeinfiltration)的方法，但还可 以如上文所述使用其它瞬时方法。通过农杆菌接种、农杆菌浸润或注射器浸润，包含所期望 的核酸的农杆菌混合物进入组织细胞间隙，例如，叶、植物气生部分（包括茎、叶以及花）、 植物其它部分（茎、根、花）或整株植物。在穿过表皮后，农杆菌感染t-DNA拷贝并将其转 移至细胞。t-DNA以游离方式被转录，mRNA被翻译，从而导致在被感染的细胞中产生所关注 的蛋白质，但t-DNA穿进核内是瞬时的。
[0196] 为协助鉴别经转化的植物细胞，可以对本发明的构建体进行进一步的操作， 以包括进植物可选择标志物。有用的可选择标志物包括提供对化学物质的抗性的酶， 所述化学物质例如抗生素，例如，庆大霉素、潮霉素、卡那霉素；或除草剂，如草胺磷 (phosphinothrycin)、草甘膦、氯磺隆等。类似地，可以使用能产生可通过颜色变化（如 GUS(P-葡萄糖苷酸酶））或发光性（如萤光酶素和GFP)来鉴别的化合物的酶。
[0197] 含有本发明的遗传构建体的转基因植物、植物细胞或种子也被认为是本发明的一 部分。从植物细胞再生整株植物的方法在本领域中也是已知的。一般地，在适合的培养基 中培养经转化的植物细胞，所述培养基可以包含选择性试剂（如抗生素），其中可选择标志 物用于辅助鉴别经转化的植物细胞。一旦形成愈伤组织，则可以根据已知方法通过使用适 合的植物激素促使芽形成，并将所述芽转移至生根培养基中以再生植物。然后，所述植物可 被用于建立重复世代，这可从种子实现或使用营养生殖技术实现。转基因植物还可以不使 用组织培养而产生。
[0198] 在本申请中，术语"调控区"、"调控元件"或"启动子"的使用表示反映核酸的一部 分，所述部分通常（但非总是）位于基因的蛋白质编码区的上游，该编码区可包含DNA或 RNA、或DNA与RNA两者。当调控区为活性的、并且与所关注的基因处于操作性结合的状态 下或与所关注的基因操作性地连接时，这可实现所关注的基因的表达。调控元件可以能够 介导器官特异性，或控制发育或时序基因活化。"调控区"可以包含启动子元件、展示出基础 启动子活性的核心启动子元件、具有应答于外部刺激的诱导性的元件、介导启动子活性的 元件，如负调控元件或转录增强子。如本文所使用的，"调控区"还可包含转录后具有活性的 元件，例如，调节基因表达的调控元件，如翻译和转录增强子、翻译和转录抑制子、上游激活 序列以及mRNA不稳定性决定子（mRNAinstabilitydeterminants)。后者这些元件中的若 干可以位于接近编码区的位置。
[0199] 在本公开文本的上下文中，术语"调控元件"或"调控区"典型地表示通常（但非 总是）位于结构性基因的编码序列上游（5'）的DNA序列，其通过提供对RNA聚合酶和/ 或转录所需的其它因子的识别以在特定位点开始，来控制编码区的表达。然而，应当理解， 位于内含子内的其它核苷酸序列或序列的3'也可能有助于对所关注的编码区的表达的调 控。提供对RNA聚合酶或其它转录因子的识别以确保在特定位点起始化的调控元件的实例 是启动子元件。大部分但非全部的真核生物启动子元件均包含TATA盒、包含腺苷与胸苷核 苷酸碱基对的保守核酸序列（其通常位于转录起始位点上游约25个碱基对处）。启动子元 件包含负责转录起始的基础启动子元件，以及修饰基因表达的其它调控元件（如上文列出 的）。
[0200] 存在若干种类型的调控区，包括发育调控型、诱导型或组成型的那些。发育调控 型的或控制基因处于其控制下的差异表达的调控区在该器官或组织的发育期间的特定 时间、在某些器官或器官组织内被激活。然而，一些发育调控型的调控区可优选在特定 发育阶段在某些器官或组织内具有活性，它们还可以以发育调控的方式而具有活性，或 者在植物内的其它器官或组织中也以基础水平存在。组织特异性调控区的实例（例如， see-特异性调控区）包括napin启动子和cruciferin启动子（Rask等人，1998,J.Plant Physiol. 152:595-599;Bilodeau等人，1994,PlantCell14:125-130)。叶特异性启动子 的实例包括质体蓝素启动子（参见US7, 125, 978,其通过引用并入本文）。
[0201] 诱导型调控区是应答于诱导剂而能够直接或间接激活一个或更多个DNA序列或 基因的转录的调控区。在不存在诱导剂时，所述DNA序列或基因将不会被转录。典型地， 特异性结合至诱导型调控区以激活转录的蛋白因子可以以非活性形式存在，其然后以通过 诱导剂被直接或间接转化为活性形式。然而，所述蛋白因子也可以不存在。所述诱导剂可 以是化学试剂，如蛋白质、代谢产物、生长调节剂、除草剂或酚类化合物，或者是通过热、冷、 盐或毒性元素直接施加的或通过病原体或疾病媒介（如病毒）的作用间接施加的生理应 激。可以通过向所述细胞或植物外部施用诱导剂，而将含有诱导型调控区的植物细胞暴露 于诱导剂，例如，通过喷洒、浇水、加热或类似方法来进行。诱导型调控元件可以来源于植物 基因或非植物基因（例如，Gatz,C.andLenk,LR.P.，1998,TrendsPlantSci. 3, 352-358 ; 其通过引用并入）。可能的诱导型启动子的实例包括但不限于四环素诱导型启动子 (Gatz,C.，1997,Ann.Rev.PlantPhysiol.PlantMol.Biol. 48, 89-108 ;其通过引用并 入）、类固醇诱导型启动子（Aoyama.T.andChua,N.H.，1997,PlantI. 2, 397-404 ;其通过 引用并入）和乙醇诱导型启动子（Salter，M.G.等人，1998，PlantJournal16,127-132; Caddick，M.X?等人，1998,NatureBiotech. 16, 177-180,其通过引用并入），细胞分裂 素诱导的IB6 和CKI1 基因（Brandstatter,I.andK.ieber,I.I.，1998，PlantCell 10, 1009-1019 ;Kakimoto,T.，1996,Science274, 982-985 ;其通过引用并入）和生长素诱 导型元件DR5(Ulmasov，T.等人，1997,PlantCell9, 1963-1971;其通过引用并入）。
[0202] 组成型调控区在植物的多个部分中并且在整个植物发育过程中连续指导基因 表达。已知的组成型调控元件的实例包括与下述基因或转录本相关的启动子，所述基 因或转录本为：CaMV35S转录本（Odell等人，1985,Nature, 313:810-812)，水稻肌动 蛋白l(Zhang等人，1991，PlantCell, 3:1155-1165)、肌动蛋白 2(An等人，1996，Plant J.，10:107-121)或tms2 (U.S. 5, 428, 147,其通过引用并入本文），和磷酸丙糖异构化酶 I(Xu等人，1994,PlantPhysiol. 106:459-467)基因，玉米泛素 1 基因（Cornejo等人， 1993,PlantMol.Biol. 29:637-646)，拟南芥泛素 1 和 6 基因（Holtorf等人，1995,Plant Mol.Biol. 29:637-646)，和烟草翻译起始因子 4A基因（Mandel等人，1995,PlantMol. Biol.29:995-1004)。
[0203] 如本文所使用的术语"组成型"不必然表明处于组成型调控区控制下的基因在所 有细胞类型中均以相同水平表达，而是意味着所述基因在广泛的细胞类型中表达，尽管经 常观察到丰度差异。组成型调控元件可以与其它序列偶联，以进一步增强它们操作性地连 接的核苷酸序列的转录和/或翻译。例如，CPMV-HT系统来源于豇豆花叶病毒（CPMV)的非 翻译区域，并且展示出相关编码序列增强的翻译。"天然的"表示核酸或氨基酸序列是天然 存在的，或是"野生型"的。"操作性地连接的"表示特定序列（例如，所关注的编码区和调 控元件）直接或间接相互作用，以发挥预期的功能，如介导或调节基因表达。操作性地连接 的序列的相互作用可例如通过与所述操作性地连接的序列相互作用的蛋白来介导。
[0204] 在植物内生产的RLP可以诱导包含植物特异性N聚糖的轮状病毒VP7结构性蛋白 质。因此，本发明还提供了包含具有植物特异性N聚糖的VP7的RLP。
[0205] 此外，对植物中N-聚糖的修饰是已知的（参见，例如U.S. 60/944, 344;其通过引 用并入本文），并且可以产生具有经修饰的N-聚糖的VP7。可以获得包含经修饰的糖基化模 式的VP7 (例如，具有降低的岩藻糖基化、木糖基化、或岩藻糖基化与木糖基化两者的N-聚 糖），或者可以获得具有经修饰的糖基化类型的VP7 (其中蛋白质缺少岩藻糖基化、木糖基 化或两者，并且包含提高的半乳糖苷化）。此外，对翻译后修饰的调节（例如，末端半乳糖的 添加）可以导致表达的VP7的岩藻糖基化和木糖基化较之表达VP7的野生型植物而言有所 降低。
[0206] 例如（但不应被视为限制），可以通过将VP7以及编码￠-1. 4半乳糖基转移酶 (GalT)(例如但不限于哺乳动物GalT或人GalT，但还可以使用其他来源的GalT)的核苷酸 序列一起共表达，来实现具有经修饰的糖基化类型的VP7的合成。还可以将GalT的催化域 融合至N-乙酰葡糖氨基转移酶（GNTl)的CTS结构域（即胞质尾，跨膜结构域，茎区）以产 生GNTl-GalT杂交酶，并且该杂交酶可以与VP7共表达。VP7还可以与编码N-乙酰葡糖氨 基转移酶III(GnT-III)(其例如但不限于哺乳动物GnT-III或人GnT-III，还可以使用来自 其它来源的GnT-III)的核苷酸序列一起共表达。另外，还可以使用GNTl-GnT-III杂交酶， 其包含融合至GnT-III的GNTl的CTS。
[0207] 因此，本发明还提供了包含具有经修饰的N聚糖的VP7的RLP。
[0208] 在不希望受理论束缚的情况下，VP7上的植物N-聚糖的存在可以通过促进VP7与 抗原递呈细胞的结合来刺激免疫应答。Saint-Jore-Dupas等人（2007)已提出了使用植物 N聚糖来刺激免疫应答。
[0209] 在以下实施例中将进一步阐述本发明。
[0210] 实施例
[0211] 实施例1
[0212] 本塞姆氏烟草（N.benthamiana)植物叶片中轮状病毒蛋白质的表达和VLP的产生
[0213] 下列分析使用了来自G9P[6]轮状病毒株的轮状病毒衣壳蛋白质，并且评估了类 轮状病毒颗粒是否在本塞姆氏烟草（N.benthamiana)叶细胞的多个区室中形成。对烟草植 物叶片中VP2与VP6的共表达以及VP2、VP6、VP7与VP4的多种组合的共表达进行了研究。
[0214] 材料和方法
[0215] 质粒构建
[0216] 针对VP2、VP4、VP6与VP7的经植物密码子优化的轮状病毒cDNA是 由Geneart,Germany提供的。按照制造商的说明书，将质体DNA转化至DH5-a 化学感受态大肠杆菌（E.coli)细胞（E.cloni?,Lucigen)。在本研究中使用 了由RainerFischer(FraunhoferInstituteforMolecularBiologyand AppliedEcology,IME,Germany)提供的新型二元农杆菌载体pTRAc(细胞质）、 pTRAkc-rbcsl-cTP(靶向叶绿体）以及pTRAkc-ERH(靶向内质网）。另一种载体 pTRAkc-A(质外体）来源于通过在NcoI与XhoI位点进行的限制酶（RE)消化在多个克隆位 点对pTRAkc-ERH进行的修饰（图3)。这除去了组氨酸标签和KDEL序列（它们将蛋白质保 留在ER中）。作为替代，所述蛋白质被靶向至质外体。
[0217] 用Ncol/Xhol对VP2、VP4与VP6进行限制酶（RE)消化，并用Afllll/Xhol切割 VP7。限制酶AflllUNcoI与MluI具有相容的粘性末端。为了将DNA直接克隆进pTRAc、 pTRAkc-rbcs-cTP与pTRAkc-A，分别在AflIII/Xhol、Mlul/Xhol与Ncol/Xhol位点对每种 载体进行RE消化。根据标准规程进行载体中DNA的克隆，然后转化进化学感受态大肠杆 菌（E.coli)DH5-a细胞（E.cloni?，Lucigen)中。通过菌落PCR确认了所选的重组菌落。 为了在pTRAkc-ERH中克隆，通过PCR扩增加入NotI限制酶位点以代替四个轮状病毒cDNA 中每一个的终止密码子。用表1中详细说明的引物扩增cDNA。PCR反应条件包括：在95°C 下变性5分钟，然后是5次下述循环，所述循环为在95°C下变性30秒、在52°C下退火1分 钟和在72°C下延伸1. 5分钟。进行如下所示的另外20个循环：95°C下30秒、57°C下1分 钟、72°C下1. 5分钟，以及72°C下5分钟。然后，按照制造商的说明书，将扩增的片段克隆进 pGEM-T-Easy(Promega)。转化在化学感受态大肠杆菌（E.coli)DH5_a(E.cloni?,Lucigen) 中进行。然后在所选的菌落上进行菌落PCR，对其它三个构建体也这样进行。
[0218] 表1 :用于ER载体克隆的轮状病毒cDNA引物
[0219]

【权利要求】
1. 在植物、植物的部分或植物细胞中产生类轮状病毒颗粒（RLP)的方法，所述方法包 括： a) 将下述第一核酸、下述第二核酸和下述第三核酸引入至该植物、植物的部分或植物 细胞中，所述第一核酸包含在所述植物中具有活性并且操作性地连接至编码第一轮状病毒 结构性蛋白质的第一核苷酸序列的第一调控区，所述第二核酸包含在所述植物中具有活性 并且操作性地连接至编码第二轮状病毒结构性蛋白质的第二核苷酸序列的第二调控区，所 述第三核酸包含在所述植物中具有活性并且操作性地连接至编码第三轮状病毒结构性蛋 白质的第三核苷酸序列的第三调控区， b) 在允许所述第一、第二和第三核酸瞬时表达的条件下培育所述植物、植物的部分或 植物细胞，由此产生所述RLP。
2. 根据权利要求1所述的方法，其中在步骤a)中将下述第四核酸引入至所述植物、植 物的部分或植物细胞，所述第四核酸包含在所述植物中具有活性并且操作性地连接至编码 第四轮状病毒结构性蛋白质的第四核苷酸序列的第四调控区，并且，当在步骤b)中培育所 述植物、植物的部分或植物细胞时所述第四核酸被表达。
3. 根据权利要求1所述的方法，其中所述第一轮状病毒结构性蛋白质是VP2,所述第二 轮状病毒结构性蛋白质是VP6,并且所述第三轮状病毒结构性蛋白质是VP4。
4. 根据权利要求1所述的方法，其中所述第一轮状病毒结构性蛋白质是VP2,所述第二 轮状病毒结构性蛋白质是VP6,并且所述第三轮状病毒结构性蛋白质是VP7。
5. 根据权利要求2所述的方法，其中所述第一轮状病毒结构性蛋白质是VP2,所述第二 轮状病毒结构性蛋白质是VP6,所述第三轮状病毒结构性蛋白质是VP4,并且所述第四轮状 病毒结构性蛋白质是VP7。
6. 根据权利要求1或2所述的方法，其中在所述植物、植物的部分或植物细胞中表达其 它的核酸，并且其中所述其它的核酸包含在所述植物中具有活性并且操作性地连接至编码 沉默抑制子的核苷酸序列的调控区。
7. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述核苷酸序列的密码子使用被调整为优选 的人密码子使用、提高的GC含量或其组合。
8. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述轮状病毒结构性蛋白质包含截短的、天然 的或非天然的信号肽。
9. 根据权利要求8所述的方法，其中所述非天然信号肽是蛋白质二硫键异构酶信号 (roi)肽。
10. 根据权利要求1所述的方法，其中所述第一、第二或第三核苷酸序列或它们的组合 被操作性地连接至豇豆花叶病毒（CPMV)调控区。
11. 根据权利要求2所述的方法，其中所述第一、第二、第三或第四核苷酸序列或它们 的组合被操作性地连接至豇豆花叶病毒（CPMV)调控区。
12. 根据权利要求1或2所述的方法，还包括以下步骤： c) 收获所述植物、植物的部分或植物细胞，和 d) 从所述植物、植物的部分或植物细胞纯化所述RLP，其中所述RLP的大小在70-100nm 的范围内。
13. 根据权利要求12所述的方法，其中在存在钙的情况下纯化所述RLP。
14. 通过根据权利要求1或2所述的方法产生的RLP，其中所述RLP至少包含VP4轮状 病毒结构性蛋白质。
15. 通过根据权利要求3所述的方法产生的RLP，其中所述RLP是双层RLP。
16. 通过根据权利要求4或5所述的方法产生的RLP，其中所述RLP是三层RLP。
17. 根据权利要求1或2所述的方法，其中所述轮状病毒结构性蛋白质选自轮状病毒 株 G9P[6]、轮状病毒 A WA 株、轮状病毒 A 疫苗 USA/Rotarix-A41CB052A/1988/G1P1A[8]株 以及轮状病毒SA11株。
18. 根据权利要求3、4和5中任一项所述的方法，其中编码VP2的核苷酸序列包含与由 SEQ ID N0:13、SEQ ID N0:14或SEQ ID N0:45所定义的核苷酸序列的80%至100%的同 一性。
19. 根据权利要求3、4和5中任一项所述的方法，其中编码VP6的核苷酸序列包含与由 SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18或SEQ ID N0:46所定义的核苷酸序列的80%至100%的同 一性。
20. 根据权利要求4和5中任一项所述的方法，其中编码VP7的核苷酸序列包含与由 SEQ ID NO : 19、20、48、49、52、53、54或57所定义的核苷酸序列的80 %至100 %的同一性。
21. 根据权利要求3和5中任一项所述的方法，其中编码VP4的核苷酸序列包含与由 SEQ ID勵：15、16、47、50或51所定义的核苷酸序列的80%至100%的同一性。
22. 根据权利要求3、4和5中任一项所述的方法，其中VP2是通过下述氨基酸序列编码 的，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO :1或SEQ ID NO :25所定义的氨基酸序列的80%至 100%的同一性。
23. 根据权利要求3、4和5中任一项所述的方法，其中VP6是通过下述氨基酸序列编码 的，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO :3或SEQ ID NO :31所定义的氨基酸序列的80%至 100%的同一性。
24. 根据权利要求4和5中任一项所述的方法，其中VP7是通过下述氨基酸序列编码 的，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO :4、39、43或59所定义的氨基酸序列的80%至100% 的同一'I"生。
25. 根据权利要求3和5中任一项所述的方法，其中VP4是通过下述氨基酸序列编码 的，所述氨基酸序列包含与SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :36所定义的氨基酸序列的80%至 100%的同一性。
26. 根据权利要求1所述的方法，其中所述第一、第二或第三核酸序列或它们的组合包 含在所述植物中具有活性的下述调控区，所述调控区被操作性地连接至一个或一个以上的 豇豆花叶病毒增强子、连接至一个或一个以上的扩增元件、以及连接至编码轮状病毒结构 性蛋白质的核苷酸序列，并且其中，将编码复制酶的第四核酸引入至所述植物、植物的部分 或植物细胞。
27. 根据权利要求2所述的方法，其中所述第一、第二、第三或第四核酸序列或它们的 组合包含在所述植物中具有活性的下述调控区，所述调控区被操作性地连接至一个或一个 以上的豇豆花叶病毒增强子、连接至一个或一个以上的扩增元件、以及连接至编码轮状病 毒结构性蛋白质的核苷酸序列，并且其中，将编码复制酶的第五核酸引入至所述植物、植物 的部分或植物细胞。
28. 根据权利要求1所述的方法，其中所述第一、第二或第三核苷酸序列或它们的组合 还被操作性地连接至区室靶向序列。
29. 根据权利要求2所述的方法，其中所述第一、第二、第三或第四核苷酸序列或它们 的组合还被操作性地连接至区室靶向序列。
30. 在植物、植物的部分或植物细胞中产生类轮状病毒颗粒（RLP)的方法，所述方法包 括： a) 将下述核酸引入至植物、植物的部分或植物细胞，所述核酸包含在所述植物中具有 活性并且操作性地连接至编码一个或更多个轮状病毒结构性蛋白质的第一核苷酸序列的 调控区， b) 在允许所述第一核酸瞬时表达的条件下培育所述植物、植物的部分或植物细胞，由 此产生所述RLP。
31. 根据权利要求30所述的方法，其中在步骤a)中将第二核酸引入至所述植物、植物 的部分或植物细胞，所述第二核酸包含在所述植物中具有活性并且操作性地连接至编码一 个或更多个轮状病毒结构性蛋白质的第二核苷酸序列的第二调控区，并且，当在步骤b)中 培育所述植物、植物的部分或植物细胞时所述第二核酸被表达。
32. 根据权利要求31所述的方法，其中在步骤a)中将第三核酸引入至所述植物、植物 的部分或植物细胞，所述第三核酸包含在所述植物中具有活性并且操作性地连接至编码一 个或更多个轮状病毒结构性蛋白质的第三核苷酸序列的第三调控区，并且当在步骤b)中 培育所述植物、植物的部分或植物细胞时所述第三核酸被表达。
33. 根据权利要求30-32中任一项所述的方法，其中所述一个或更多个轮状病毒结构 性蛋白质选自包含VP2、VP4、VP6和VP7的组。
34. 根据权利要求30-33中任一项所述的方法，其中在所述植物、植物的部分或植物细 胞中表达其它的核苷酸序列，所述其它的核苷酸序列编码沉默抑制子，并且所述其它的核 苷酸序列操作性地连接至在所述植物中具有活性的调控区。
35. 根据权利要求30-34中任一项所述的方法，其中所述一个或更多个轮状病毒结构 性蛋白质来自轮状病毒株G9P [6]。
36. 根据权利要求30-35中任一项所述的方法，其中所述核苷酸序列还被操作性地连 接至区室靶向序列。
37. 根据权利要求28、29和36中任一项所述的方法，其中所述区室靶向序列将所述一 个或更多个轮状病毒结构性蛋白质引向所述植物细胞的内质网（ER)、叶绿体、质体或质外 体。
38. 根据权利要求37所述的方法，其中所述区室靶向序列编码质外体信号肽或质体信 号肽。
39. 根据权利要求30-38中任一项所述的方法，还包括以下步骤： c) 收获所述植物、植物的部分或植物细胞，和 d) 从所述植物、植物的部分或植物细胞纯化所述RLP，其中所述RLP的大小在70-1 OOnm 的范围内。
40. 在植物、植物的部分或植物细胞中产生类轮状病毒颗粒（RLP)的方法，所述方法包 括： a) 提供包含下述核酸的植物、植物的部分或植物细胞，所述核酸包含在所述植物中具 有活性并且操作性地连接至编码一个或更多个轮状病毒结构性蛋白质的核苷酸序列的调 控区； b) 在允许所述核酸瞬时表达的条件下培育所述植物、植物的部分或植物细胞，由此产 生所述RLP。
41. 在植物、植物的部分或植物细胞中产生类轮状病毒颗粒（RLP)的方法，所述方法包 括： a) 提供将下述第一核酸、下述第二核酸和下述第三核酸包含进植物、植物的部分或植 物细胞中的植物、植物的部分或植物细胞，所述第一核酸包含在所述植物中具有活性并且 操作性地连接至编码第一轮状病毒结构性蛋白质的第一核苷酸序列的第一调控区，所述第 二核酸包含在所述植物中具有活性并且操作性地连接至编码第二轮状病毒结构性蛋白质 的第二核苷酸序列的第二调控区，所述第三核酸包含包含在所述植物中具有活性并且操作 性地连接至编码第三轮状病毒结构性蛋白质的第三核苷酸序列的第三调控区；和 b) 在允许所述第一、第二和第三核酸瞬时表达的条件下培育所述植物、植物的部分或 植物细胞，由此产生所述RLP。
42. 根据权利要求41所述的方法，其中在步骤a)中向所述植物、植物的部分或植物细 胞提供第四核酸，所述第四核酸包含在所述植物中具有活性并且操作性地连接至编码第四 轮状病毒结构性蛋白质的第四核苷酸序列的第四调控区，并且，当在步骤b)中培育所述植 物、植物的部分或植物细胞时所述第四轮状病毒结构性蛋白质被表达。
43. 通过根据权利要求30至42中任一项所述的方法产生的RLP，其中所述RLP至少包 含VP4轮状病毒结构性蛋白质。
44. 组合物，所述组合物包含有效剂量的用于在受试者中诱导免疫应答的根据权利要 求14、15、16和43中任一项所述的RLP，和可药用载体。
45. 在受试者中诱导对轮状病毒感染的免疫性的方法，所述方法包括施用根据权利要 求44所述的组合物。
46. 根据权利要求45所述的方法，其中将所述组合物经口、皮内、鼻内、肌内、腹膜内、 静脉内或皮下施用至受试者。
47. 植物材料，所述植物材料包含通过根据权利要求1至13和17至42中任一项所述 的方法产生的RLP。
48. 在植物、植物的部分或植物细胞中产生轮状病毒结构性蛋白质的方法，所述方法包 括： a) 将下述核酸引入至所述植物、植物的部分或植物细胞，所述核酸包含在所述植物中 具有活性并且操作性地连接至编码一个或更多个轮状病毒结构性蛋白质的核苷酸序列的 调控区； b) 在允许所述核酸瞬时表达的条件下培育所述植物、植物的部分或植物细胞，由此产 生一个或更多个轮状病毒结构性蛋白质。
49. 根据权利要求48所述的方法，其中所述核苷酸序列还操作性地连接至区室靶向序 列。
50. 根据权利要求48所述的方法，其中所述一个或更多个轮状病毒结构性蛋白质是 VP2、VP4、VP6 或 VP7。
【文档编号】A61P31/14GK104284978SQ201380024759
【公开日】2015年1月14日 申请日期:2013年5月10日 优先权日:2012年5月11日
【发明者】M-A·达奥斯特, N·兰德里, P-O·拉沃伊, 新井正明, 浅原尚美, D·L·R·穆特法, I·I·希泽洛斯, E·P·里比基 申请人:麦迪卡格公司, 田边三菱制药株式会社