专利名称：利用家蚕杆状病毒体外表达系统合成蛋白质的方法
技术领域：
本发明涉及一种蛋白质的合成方法，该方法利用家蚕杆状病毒体外表达系 统合成蛋白质的方法。
背景技术：
目前，已广泛利用基因重组技术并使用酵母活细胞、昆虫细胞等表达系统 (以下简称细胞系统)作为蛋白质的生产方法。但是，活细胞由于其功能保 留而表现出外源蛋白质消失的倾向，并且由于活细胞中细胞毒性蛋白质的表达 阻止了细胞生长而存在许多不能被容易表达的蛋白质。而体外表达系统相对而 言没有上述细胞系统蛋白质合成上的限制，并能在不伤害生物体的情况下合成 蛋白质。另外由于蛋白质的生产不伴有培养等操作，因而与细胞系统相比，可 在短时间内合成蛋白质。此外，由于体外表达系统还用来大规模生产由不被生 物体利用的氨基酸序列组成的蛋白质，因而有望成为有前途的表达方法。
杆状病毒表达系统可使高表达的外源蛋白在细胞内进行正确折叠、二硫键 的搭配及寡聚物的形成提供良好的环境，可使表达产物在结构及功能上接近天 然蛋白。在杆状病毒极晚期基因表达过程中，有种高效表达的蛋白，是pio蛋 白高效表达的极晚期蛋白为P10蛋白。P10基因现在已被定位和克隆这个基 因的启动子具有较强的启动能力，使外源基因能高水平表达。目前，利用杆状 病毒P10基因启动子进行体外蛋白表达的方法还未有报道。
发明内容
针对现有技术的不足之处，本发明的一种利用家蚕杆状病毒体外表达系统
合成蛋白质的方法在家蚕杆状病毒提取液中加入pUC19-P10-GFP重组质粒及 蛋白酶抑制剂，25-29'C水浴，即得目的蛋白的表达。
所述家蚕杆状病毒提取液的制备方法包括取蚕蛹，接种杆状病毒，待
蚕蛹发病后，冰上匀浆，吸取匀浆液于L5 ml EP管中，-80°C、 2(TC反复冻 融3次，4 。C， 18000 rpm离心15-30 min，取上清，重复两次后，35000 rpm 超速离心30-60 min，吸取上清至新的1. 5 ml EP管中，用500 ul管子分装， 每管50 ul，即用或存放于液氮中。
所述家蚕杆状病毒提取液的制备方法包括接种杆状病毒于家蚕细胞， 待细胞发病后，_80°C、 20。C反复冻融3次，4 。C， 18000 rpm离心15-30 min，重复两次后，35000 rpm超速离心30-60 min，取上清至新的1. 5 ml EP 管中，用500 ul管子分装，每管50 ul，即用或存放于液氮中。
所述pUC19-P10-GFP重组质粒的制备方法包括 (O以家蚕杆状病毒基因组DNA为模板，PCR扩增P10启动子序列，PCR 所用的两种引物为
L-l: 5，-atgaatcctgccggccgctccgtgtacggg-3， EcoRI位点； 2: 5，-gtggatccgatgatattgcagtcagtttgg-3， BamHI位点；
(2) 以质粒pEGFP-Nl为模板，PCR扩增GFP报告基因序列，PCR所用的 两种引物为
L-3: 5'-atggatccgtatgcatggtgagcaag-3'; BamHI位点； 4: 5'- tcgcatgcttacttgtacagctc-3'; Pael位点；
(3) 将P10启动子序列片段和质粒pUC19进行EcoRI、 BamHI双酶切，37 'C反应2小时后分别回收酶切产物，再进行连接；转化至感受态细胞E.coli DH5a，得到pUC19-P10载体；
(4) 分别对GFP序列和载体pUC19-P10进行BamHI、 Pael双酶切，37°C 反应2小时后分别回收酶切产物，再进行连接；转化至感受态细胞E.coli DH5a，得到pUC19-P10-GFP重组质粒。
所述的蛋白酶抑制剂为PMSF蛋白酶抑制剂。
本发明的有益之处在于传统的蛋白表达方法有两个途径， 一是原核表 达，它具有许多的优点，如表达周期短，成本低，但有些基因在原核系统中的
持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用，目的蛋白常以包涵体形式表达，导 致产物纯化困难，且不利于蛋白形成正确的构象；二是真核表达，它能诱导基 因高效表达，且能严格调控基因表达，但它受细胞培养的限制。本发明所述的 方法不受细胞的限制，可在短时间内(3 — 6小时内)合成蛋白质，以溶解状态 存在，这有利于蛋白的分离纯化，同时它属于真核表达体系，有利于蛋白形成 正确的构象。
图l、本发明的实施例的重组质粒pUC19-P10-GFP。 图2、本发明的实施例的蛋白表达电泳图2: M，标准分子量蛋白；1， 0小时取样；2， 3小时取样；3， 6小时取 样；4， 12小时取样。
具体实施例方式
一、 家蚕杆状病毒提取液的准备
1、 用家蚕蚕蛹制备杆状病毒提取液
取蚕蛹若干，接种家蚕杆状病毒(BraNPV，购自上海生化研究所)，待蚕 蛹发病后，冰上匀浆，吸取匀浆液于1.5 ml EP管中，-80°C、 20。C反复冻融3 次，4 °C， 18000 rpm离心20 min，取上清，重复两次后，35000 rpm超速离 心30 min，吸取上清至新的1.5 ml EP管中，用500 ul管子分装，每管50 ul，即为杆状病毒提取液，即用或存放于液氮中。
2、 用家蚕Bm5细胞制备杆状病毒提取液
接种杆状病毒(BmNPV，购自上海生化研究所)于家蚕Bm5细胞，待细胞 发病后，-80°C、 20。C反复冻融3次，4 。C， 18000 rpm离心20 min，重复两 次后，35000 rpm超速离心30 min，取上清至新的1. 5 ml EP管中，用500 ul 管子分装，每管50ul，即为杆状病毒提取液，即用或存放于液氮中。
二、 重组质粒的构建 1.引物设计
LI: 5， -at卵atcctgccggccgctccgtgtacggg-3， (EcoRI位点)
L2: 5， -gtggatccgatgatattgcagtcagtttgg-3， (BamHI位点) 绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein, GFP)报告基因的引物 L-3: 5'- atggatccgtatgcatggtgagcaag -3'; (BamHI位点) L-4: 5'- tcgcatgcttacttgtacagctc -3'。 (PaeI位点)
2.P10启动子序列的扩增
以家蚕杆状病毒基因组DAN (NC-001875)为模板，以L-1、 L一2为引物， PCR反应参数为94。C预变性5min， 94。C变性30s， 68。C复性延伸lmin， 30个循 环，68。C延伸5min。
在一个无菌的0.5ml离心管中，混合下列成分
10xPCR Buffer 10nl 25mmol MgC12 8|il
2. 5 mmol dNTPs 8|il L-1
L-2 l^il
模板 1^1 KOD-Plus DNA聚合酶 (T0Y0B0公司，日本)lpl 加无菌双蒸水至lOOiil
各组分混匀后，放入PCR仪中，按上述反应参数设计30个循环。待反应结 束后，电泳鉴定扩增片段，同时切胶回收目的片段，获得P10启动子。
3. GFP报告基因序列的扩增
以质粒pEGFP-Nl (GE公司，Genbank U55762)为模板，PCR反应参数为94。C 预变性5min， 94'C变性30s， 68'C复性延伸lmin， 30个循环，68。C延伸5min。 在一个无菌的0.5ml离心管中，混合下列成分 10xPCR Buffer 10^1 25mmol MgC12 8|il 2. 5 ,1 dNTPs 8^1 L-3 l^il
L-4 模板
KOD-Plus DNA聚合酶(T0Y0B0公司，日本) 加无菌双蒸水至100pl
各组分混匀后，放入PCR仪中，按上述反应参数设计30个循环。待反应结 束后，电泳鉴定扩增片段，同时切胶回收目的片段。 4. pUC19-P10载体的构建
分别对P10启动子序列片段和质粒pUC19 (promega公司)进行&oy I、 5aMH双酶切，37'C反应2小时后分别回收酶切产物，再进行连接。 在一个无菌的0.2ml离心管中，混合下列成分
P10启动子序列片段 2pl
质粒pUC19 0.5^1
2xRapid Ligation buffer 5(il
T4 DNA ligase (购自promage公司) lpl
加无菌双蒸水至10pl，混匀。25i:反应lh后，反应混合物转化至感受态细 胞E.coli DH5a中。挑取单菌落，提取质粒，进行酶切初步鉴定，经测序，序 列完全正确，得pUC19-P10载体。
5. pUC19-P10-GFP重组质粒的制备
分别对GFP序列和质粒pUC19-P10进行勘WI、尸ael双酶切，37。C反应2小时 后分别回收酶切产物，再进行连接。
在一个无菌的0. 2ml离心管中，混合下列成分
GFP序列片段 2pl
质粒pUC19-P10 0. 5^1
2xRapid Ligation buffer 5(al
T4 DNA ligase (购自promage公司) ljxl
加无菌双蒸水至10pl，混匀。25。C反应lh后，反应混合物转化至感受态 细胞E.coli DH5a中。挑取单菌落，提取质粒，进行酶切初步鉴定，经测序， 序列完全正确，得pUC19-P10-GFP重组质粒(图l)。
本发明仅以P10启动子、GFP为例，但P10启动子可以用多角体 (polyhedrin)启动子代替，GFP也可用其他可用于分子标记的基因代替，如 绿色荧光蛋白。
三、反应体系
在家蚕杆状病毒提取液中加入pUC19-P10-GFP重组质粒或含有外源基因的 pUC19-P10-GFP重组质粒、PMSF蛋白酶抑制剂，25-29。C水浴，分0， 3h， 6h， 12h， 18h， 24h取样。见图2，在3小时后蛋白的表达量就可达到所需的量，6 小时表达.量最大，随后，蛋白表达量将会降低。
三、电泳检测表达产物
电泳结束后，在荧光显微镜下观察，在488nm激发波长下观察绿色荧光蛋 白GFP的表达，或用考染法观测蛋白的表达。结果表明(图2)，约在6小时 蛋白表达量较大。
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然， 本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从 本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范 围。
SEQ ID NO 1:
30 atgaatcctg
SEQ ID NO 2:
30 gtggatccga
SEQ ID NO 3: 26 atggatccgt SEQ ID NO 4:
23 tcgcatgctt
ccggccgctc
tgatattgca atgcatggtg acttgtacag
序列表
cgtgtacggg gtcagtttgg
3gC犯g
etc
权利要求
1、一种利用家蚕杆状病毒体外表达系统合成蛋白质的方法，其特征在于在家蚕杆状病毒提取液中加入pUC19-P10-GFP重组质粒及蛋白酶抑制剂，25-29℃水浴，即得目的蛋白的表达。
2、 根据权利要求1所述的利用家蚕杆状病毒体外表达系统合成蛋白质的方 法，其特征在于所述家蚕杆状病毒提取液的制备方法包括取蚕蛹，接种杆状 病毒，待蚕蛹发病后，冰上匀浆，吸取匀浆液于1.5mlEP管中，-8(TC、 20°C 反复冻融3次，4°C， 18000rpm离心15-30min，取上清，重复两次后，35000 rpm超速离心30-60 min，吸取上清至新的L5 ml EP管中，用500 ul管子分 装，每管50 ul，即用或存放于液氮中。
3、 根据权利要求1所述的利用家蚕杆状病毒体外表达系统合成蛋白质的方 法，其特征在于所述家蚕杆状病毒提取液的制备方法包括接种杆状病毒于家 蚕细胞，待细胞发病后，-80°C、 20。C反复冻融3次，4 。C， 18000 rpm离心15-30 min，重复两次后，35000 rpm超速离心30-60 min，取上清至新的1.5 ml EP 管中，用500 ul管子分装，每管50 ul，即用或存放于液氮中。
4、 根据权利要求l所述的利用家蚕杆状病毒体外表达系统合成蛋白质的方 法，其特征在于所述pUC19-P10-GFP重组质粒的制备方法包括(1) 以家蚕杆状病毒基因组DNA为模板，PCR扩增P10启动子序列，PCR所用的两种引物为5，-atgaa"tcctgccggccgctccg"tgtacggg-3' EcoRI位点； L-2.' 5'-gtggatccgatgatattgcagtcagtttgg-3， BamHI位点；(2) 以质粒pEGFP-Nl为模板，PCR扩增GFP报告基因序列，PCR所用的两 种引物为L-3: 5'-atggatccgtatgcatggtgagcaag-3'; BamHI位点；L-4: 5'- tcgcatgcttacttgtacagctc-3'; Pael位点；(3) 将P10启动子序列片段和质粒pUC19进行EcoRI、 BamHI双酶切，37 "C反应2小时后分别回收酶切产物，再进行连接；转化至感受态细胞E.coli DH5a，得到pUC19-P10载体；(4) 分别对GFP序列和载体pUC19-P10进行BamHI、 Pael双酶切，37"C反 应2小时后分别回收酶切产物，再进行连接；转化至感受态细胞E.coUDH5a， 得到pUC19-P10-GFP重组质粒。
5、根据权利要求1所述的利用家蚕杆状病毒体外表达系统合成蛋白质的方 法，其特征在于所述的蛋白酶抑制剂为PMSF蛋白酶抑制剂。
全文摘要
本发明公开了一种利用家蚕杆状病毒体外表达系统合成蛋白质的方法在家蚕杆状病毒提取液中加入pUC19-P10-GFP重组质粒及蛋白酶抑制剂，25-29℃水浴，即得目的蛋白的表达。本发明所述的方法不受细胞的限制，可在短时间内(3-6小时内)合成蛋白质，以溶解状态存在，这有利于蛋白的分离纯化，同时它属于真核表达体系，有利于蛋白形成正确的构象。
文档编号C12N15/866GK101358205SQ20081012047
公开日2009年2月4日 申请日期2008年8月29日 优先权日2008年8月29日
发明者吕正兵, 夏佳音, 张耀洲, 清 盛, 聂作明, 健 陈, 琴 陈 申请人:浙江理工大学