专利名称：：利用家蚕后部丝腺体外表达系统合成蛋白质的方法
技术领域：
：本发明涉及一种蛋白质的合成方法，该方法利用了家蚕后部丝腺体外表达系统。
背景技术：
：目前，已广泛利用基因重组技术并使用酵母活细胞、昆虫细胞等表达系统(下文中往往称为"细胞系统")作为蛋白质的生产方法。但是，活细胞由于其功能保留而表现出外源蛋白质消失的倾向，并且由于活细胞中细胞毒性蛋白质的表达阻止了细胞生长而存在许多不能被容易表达的蛋白质。而体外表达系统相对而言没有上述细胞系统蛋白质合成上的限制，并能在不伤害生物体的情况下合成蛋白质。另外由于蛋白质的生产不伴有培养等操作，因而与细胞系统相比，可在短时间内合成蛋白质。此外，由于体外表达系统还用来大规模生产由不被生物体利用的氨基酸序列组成的蛋白质，因而有望成为有前途的表达方法。家蚕(Bombyxmori)是一种具有强大泌丝能力的昆虫。蚕丝蛋白由丝素(fibroin,Fib)禾卩丝胶(sericin，Ser)组成。丝素由重链(heavychain,fib-H)、轻链(lightchain,fib-L)和FhxPP25(fibrohexamerin)以摩尔比6:6:1组成。形成茧层的丝蛋白主要在家蚕幼虫5龄中、后期合成。在短短的45天内，后部丝腺每个细胞合成丝素约300"g，亦即2条后部丝腺(大约1000多个细胞)每小时合成丝素2mg左右，平均每秒钟合成6X108丝素分子，比肝细胞合成血清白蛋白快60倍以上。如此高的蛋白合成强度，在其他动物细胞内是罕见的。因此，丝蛋白基因启动子是具有较强时空特异性和强大启动能力的天然启动子。家蚕丝素蛋白轻链基因fib-L具有在后部丝腺组织专一性、高效性表达的特点。可以利用其启动子构建能够表达外源基因的丝腺生物工厂。
发明内容针对现有技术的不足之处，本发明提供一种利用家蚕后部丝腺体外表达系统合成蛋白质的方法。本发明的一种利用家蚕后部丝腺体外表达系统合成蛋白质的方法，在家蚕后部丝腺组织提取液中加入pUC19-FL-GFP-PolyA重组质粒或插有外源基因的pUC19-FL-GFP-PolyA重组质粒或pUC19-FL-PolyA质粒或插有外源基因的pUC19-FL-PolyA质粒及蛋白酶抑制剂，25。C29X:水浴，即得目的蛋白的表达。所述家蚕后部丝腺组织提取液的制备方法包括(1)取四龄或五龄家蚕，将家蚕浸于75%乙醇中麻醉，解剖取出丝腺，置于0.9c/。的生理盐水或PBS中，取后部丝腺，一80一6CTC保存；(2)取以上保存的后部丝腺，置于匀浆器中，加入生理盐水或PBS，冰上匀浆；取匀浆液于1.5mlEP管中，2°C6°C，1000014000rpm离心1015min，取上清，重复三次，取上清，即为家蚕后部丝腺组织提取液。所述pUC19-FL-Po1yA质粒的制备方法包括(1)以家蚕基因组DNA为模板，L-l和L-2为引物，PCR扩增出fib-L启动子序列，经EcoRI和BamHI双酶切后定向克隆至载体pUC19中，获得重组质粒pUC19-FL;1l-1:5'-ccggaa/ttccgactcgccaagttacgtc-3';H_ggcggatccccgggtaccgagctcgtggtctgttatgtgacc-3'(2)以家蚕基因组DNA为模板，L-3和L-4为引物，PCR扩增出fib-LpolyA(1)，经SalI和Hindin双酶切后定向克隆至pUQ9-FL中fib-L启动子下游，获得重组质粒pUC19-FL-PolyA;L-3:5'_gcggtcgacctgcaggcatgccaaattgtgtttgcgttagg-3';1v-4:5'-gccaagcttcactgtccaatccaccgtc-3'。所述pUC19-FL-GFP-PolyA重组质粒的制备方法包括(1)以家蚕基因组DNA为模板，L-l和L-2为引物，PCR扩增出fib-L启动子序列，经EcoRI和BamHI双酶切后定向克隆至载体pUC19中，获得重组质粒pUC19-FL;L-l:5'-ccggaattccgactcgccaagttacgtc-3';L-2:5'-ggcggatccccgggtaccgagctcgtggtctgttatgtgacc—3';(2)以家蚕基因组DNA为模板，以L-5和L-6为引物，PCR扩增出fib-LpolyA(2);L-5:5'-gagctgtacaagtaacaaattgtgtttgcg-3';L-6:5'-gccaagcttcactgtccaatccaccgtc-3';(3)，以质粒pEGFP-Nl为模板，以L-7和L-8为引物，PCR扩增GFP报告基因序列；L-7:5'-ccggtcgacctgcaggcatgcatggtgagcaagggc-3';L-8:5'-cgcaaacacaatttgttacttgtacagctc-3';(4)以fib-LpolyA(2)禾叩FP报告基因序列为模板，以L-7和L-6为引物，利用重叠PCR的方法扩增出带有fib-LpolyA(2)禾口GFP报告基因序列的片段，即GFP-PolyA，经SalI和HindlII双酶切后定向克隆至重组质粒pUC19-FL中，获得重组质粒pUC19-FL-GFP-PolyA，L-6:5'-gccaagcttcactgtccaatccaccgtc-3';L-7:5Lccggtcgacctgcaggcatgcatggtgagcaagggc-3'。本发明的有益之处在于本发明是在25X:29'C条件下表达蛋白，低温(常规是在37°C)条件有利于表达蛋白以溶解状态生成，减少包含体的形成，利于蛋白的分离纯化。同时，本发明所述的方法不受细胞的限制，可在短时间内合成蛋白质。图1、本发明的实施例的重组质粒pUC19-FL-PolyA;图2、本发明的实施例的重组质粒pUC19-FL-GFP-PolyA;图3、本发明的实施例的检测蛋白表达的电泳图中M，标准分子量蛋白；1，0小时取样；2，3小时取样；3，6小时取样；4，12小时取样；5，18小时取样。具体实施例方式本发明选取四龄或五龄时期的家蚕，解剖获得家蚕后部丝腺后，置于匀浆器中，加入适量生理盐水或PBS，冰上匀浆，离心获得上清液，即为家蚕后部丝腺提取液。将家蚕后部丝腺提取液在25。C29。C水浴中孵育，分0，3h，6h，12h，18h，24h取样，用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定此系统是否具有合成蛋白的能力。重组质粒的构建1、重组质粒pUC19-FL-PolyA以家蚕基因组DNA(GenbankM76430)为模板，L-1和L-2为引物，PCR扩增出fib-L启动子序列(约605bp)，经EcoRI和BamHI双酶切后定向克隆至载体pUC19(promega公司)中，获得重组质粒pUC19-FL。同样以家蚕基因组DNA(GenbankM76430)为模板，L-3和L-4为引物，PCR扩增出fib-L的polyA加尾信号(约286bp)，经SalI和HindlII双酶切后定向克隆至pUC19-FL中fib-L启动子下游，获得重组质粒pUC19-FL-PolyA(图1)。2、重组质粒pUC19-FL-GFP-PolyA以家蚕基因组DNA(GenbankM76430)为模板，以L-5和L-6为引物，PCR扩增出fib-L的polyA加尾信号序列(约286bp)，即fib-LpolyA(2);以质粒pEGFP-Nl(GenbankU55762)为模板，以L-7和L-8为引物，PCR扩增GFP报告基因序列(约720bp)。随后以fib-LpolyA(2)和GFP报告基因序列(GenbankM76430和GenbankU55762)为模板，以L-7和L-6为引物，利用重叠PCR的方法扩增出带有fib-LpolyA(2)禾卩GFP报告基因序列的融合序列GFP-PolyA，GFP-PolyA经SalI和HindlII双酶切后定向克隆至重组质粒pUC19-FL中，获得重组质粒pUC19-FL-GFP-PolyA(图2)。利用家蚕后部丝腺体外表达系统合成蛋白。反应体系在家蚕后部丝腺组织提取液中加入pUC19-FL-PolyA重组质粒或pUC19-FL-GFP-PolyA重组质粒或插有外源基因的pUC19-FL-PolyA重组质粒或pUC19-FL-GFP-PolyA重组质粒，加入蛋白酶抑制剂，25。C29。C水浴，分0，3h，6h，12h，18h,24h取样。利用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测蛋白表达。实施例一、家蚕丝腺的准备取四龄或五龄家蚕，将家蚕浸于75%乙醇中麻醉30秒后取出，用大头针固定家蚕头部和尾部于腊盘上，腹面朝上，用解剖剪刀将其腹部剪开，把皮肤左右展开，用大头针固定。用解剖摄铗住直肠，一面向头部方向提起，一面剪断攀着的气管和肌肉。除掉消化管后，这样左右两部的丝腺就露出来了，用镊子将丝腺取出，置于0.9c/。的生理盐水或PBS中。随后用剪刀将前中部丝腺和后部丝腺分开。一7(TC保存备用。二、家蚕后部丝腺提取液的制备取10条蚕的后部丝腺，置于匀浆器中，加入lml生理盐水或PBS,冰上匀浆；吸取匀浆液于1.5mlEP管中，4°C，12000rpm离心10min，取上清，重复三次；吸取上清至新的1.5mlEP管中，用500ul管子分装，每管50ul，即为家蚕后部丝腺提取液，即用或存放于液氮中。三、家蚕后部丝腺基因组DNA的提取从8条5龄幼蚕中取出后部丝腺，加液氮捣碎，力Q2mL上述所得的家蚕后部丝腺提取液(10mmol/LTris-HC1(pH8,0)，0.1mmol/LEDTA(pH8.0)，1%SDS，500mmol/LNaCl)，混匀后加蛋白酶K(promega)(使终浓度达250ug/mL),5(TC静置1224h，加入等体积的酚，缓慢地来回颠倒10min，离心，取上清液，加RNA酶(sigma)，于37。C静置30min;先后加入等体积的酚氯仿(1:1)和氯仿异戊醇各抽提l次，取上清液加2倍体积的无水乙醇沉淀DNA，用细玻璃棒小心缠绕出DNA,70%乙醇洗1次，37。C干燥后，溶于TE缓冲液中。四、重组质粒的构建参照GenBank中已公开的家蚕fib-L全序列(Genbank:M76430)，合成克隆启动子序列用的一对引物L-1(5'-CCGGAATTCCGACTCGCCAAGTTACGTC-3'，下划线表示EcoRI位点)L-2(5'-GGCGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGTGGTCTGTTATGTGACC-3含BamHI位点)；合成克隆fib-LpolyA加尾信号序列用的两对PCR引物L-3(5'-GCGGTCGACCTGCAGGCATGCCAAATTGTGTTTGCGTTAGG-3'，含SalI位点)L-4(5'-GCCAAGCTTCACTGTCCAATCCACCGTC-3'，含HindIII位点)L-5(5'-GAGCTGTACAAGTAACAAATTGTGTTTGCG-3')L-6(5'-GCCAAGCTTCACTGTCCAATCCACCGTC-3'，含HindIII位点)。参照质粒pEGFP-Nl(GenbankU55762)序列，合成克隆绿色荧光蛋白(GreenFluorescentProtein,GFP)报告基因用的一对PCR引物L-7(5'-CCGGTCGACCTGCAGGCATGCATGGTGAGCAAGGGC-3'，含SalI位点)L-8(5'-CGCAAACACAATTTGTTACTTGTACAGCTC-3')。1、fib-L启动子序列的扩增以家蚕基因组DNA(GenbankM76430)为模板，PCR反应参数为94。C预变性3min，94。C变性30s，68。C复性延伸lmin，30个循环，68。C延伸5min。在一个无菌的0.5ml离心管中，混合下列成分10xPCRBuffer10^125mmolMgC128(^12.5mmoldNTPs8|ilL-lL-2l^il模板KOD-PlusDNA聚合酶(T0Y0B0公司，日本)ljil加无菌双蒸水至100pl，各组分混匀后，放入PCR仪中，按上述反应参数设计30个循环。待反应结束后，电泳鉴定扩增片段，同时切胶回收目的片段。2、fib-L的polyA加尾信号序列(l)的扩增以家蚕基因组DNA(GenbankM76430)为模板，PCR反应参数为94"C预变性3min，94。C变性30s，68。C复性延伸lmin，30个循环，68。C延伸5min。在一个无菌的0.5ml离心管中，混合下列成分10xPCRBuffer10^125mmolMgC128^12.5mmoldNTPs8ji1L-3L-4模板41KOD-PlusDNA聚合酶(TOYOBO公司，日本)l卩l加无菌双蒸水至10(V1，各组分混匀后，放入PCR仪中，按上述反应参数设计30个循环。待反应结束后，电泳鉴定扩增片段，同时切胶回收目的片段，获得fib-LpolyA(l)。3、fib-L的polyA加尾信号序列(2)的扩增以家蚕基因组DNA(GenbankM76430)为模板，PCR反应参数为94。C预变性3min，94。C变性30s，68。C复性延伸lmin，30个循环，68。C延伸5min。在一个无菌的0.5ml离心管中，混合下列成分10xPCRBuffer10^125mtno1MgC128|il2.5mmoldNTPs8^1L-5L-6模板KOD-PlusDNA聚合酶(TOYOBO公司，日本)l^il加无菌双蒸水至100^a，各组分混匀后，放入PCR仪中，按上述反应参数设计30个循环。待反应结束后，电泳鉴定扩增片段，同时切胶回收目的片段。该目的片段可作为模板fib-LpolyA(2)用于后续实以质粒pEGFP-Nl(GenbankU55762)为模板，PCR反应参数为94°C预变性3min,94。C变性30s，68。C复性延伸lmin，30个循环，68。C延伸5min。在一个无菌的0.5ml离心管中，混合下列成分10xPCRBuffer10|il25mmolMgC128(il2.5mmoldNTPs8[dL-7ljilL-8l^il模板1^1KOD-PlusDNA聚合酶(T0Y0B0公司，日本)加无菌双蒸水至10(HU，各组分混匀后，放入PCR仪中，按上述反应参数设计30个循环。待反应结束后，电泳鉴定扩增片段，同时切胶回收目的片段。该目的片段可作为模板GFP用于后续实验。5、fib-LpolyA(2)和GFP报告基因序列的融合，构建GFP-PolyAPCR反应参数为94。C预变性3min，94。C变性30s，68。C复性延伸lmin，30个循环，68""C延伸5min。在一个无菌的0.5ml离心管中，混合下列成分10xPCRBuffer10|il25mmolMgCl28(il2,5,1dNTPs8(ilL-7L-6模板fib-LpolyA(2)1^1模板GFP(获自前面步骤4)l^ilKOD-PlusDNA聚合酶(T0Y0B0公司，日本)lpl加无菌双蒸水至lOOiil，各组分混匀后，放入PCR仪中，按上述反应参数设计30个循环。待反应结束后，电泳鉴定扩增片段。因为GFP报告基因的下游引物L-8设计时加入了fib-L的polyA(2)加尾信号序列5'端的部分序列，所以PCR扩增出的GFP报告基因的3'端序列与fib-L的polyA加尾信号序列5'端序列存在重叠，fib-L的polyA加尾信号序列的下游引物L-5设计时加入了GFP报告基因5'端的部分序列，所以PCR扩增出的fib-L的polyA加尾信号序列的3'端序列与GFP报告基因的5'端序列存在重叠，利用PCR方法就可以扩增出fib-L的polyA加尾信号序列和GFP报告基因的融合序列，构建得GFP-PolyA。6、重组质粒pUC19-FL的构建将步骤l中PCR扩增出的fib-L启动子序列片段连接到质粒pUC19(TAKARA，宝生物)上。先分别对fib-L启动子序列片段和质粒pUC19进行^^a、AaMH双酶切，37'C反应2小时后分别回收酶切产物，再进行连接。在一个无菌的0.2ml离心管中，混合下列成分fib-L启动子序列片段2pl质粒pUC190.5pl2xRapidLigationbuffer5^1T4DNAligase(购自promage公司)1^1加无菌双蒸水至1(V1，混匀。25。C反应lh后，反应混合物转化至感受态细胞E.coliDH5a中。挑取单菌落，提取质粒，进行酶切初步鉴定，经测序，序列完全正确。7、重组质粒pUC19-FL-PolyA的构建分别对fib-LpolyA(l)和质粒pUC19—FL进行6kZI、历7dll双酶切，37°C反应2小时后分别回收酶切产物，再进行连接。将PCR扩增出的polyA加尾信号序列连接到质粒pUC19-FL上。在一个无菌的0.2ml离心管中，混合下列成分fib-LpolyA(l)2^1质粒pUC19-FL0.5^12xRapidLigationbuffer5jilT4腿ligase(购自promage公司)加无菌双蒸水至10pl，混匀。25。C反应lh后，反应混合物转化至感受态细胞E.coliDH5a中。挑取单菌落，提取质粒，进行酶切初步鉴定，经测序，序列完全正确。8、重组质粒pUC19-FL-GFP-PolyA的构建将PCR扩增出的融合片段GFP-PolyA连接到质粒pUC19-FL上。分别对质粒pUC19—FL和融合片段GFP-PolyA进行6^TI、历'/7oIII双酶切，37'C反应2小时后分别回收酶切产物，再进行连接。在一个无菌的0.2ml离心管中，混合下列成分融合片段GFP-PolyA2jil质粒pUC19-FL0.5^12xRapidLigationbuffer5(ilT4DNAligase(购自promage公司)l^il加无菌双蒸水至10)al，混匀。25。C反应lh后，反应混合物转化至感受态细胞E.coliDH5a中。挑取单菌落，提取质粒，进行酶切初步鉴定，经测序，序列完全正确。9、外源基因插入载体pUC19-FL-Po1yA或pUC19-FL-GFP-Po1yA将目的基因扩增出来，同时在目的基因的两端加入酶切位点("s/dn、Wsl、^TI三者任选两个)，再同时对目的基因和载体(pUC19-FL-PolyA或pUC19-FL-GFP-PolyA)进行双酶切，回收酶切产物，在T4连接酶的作用下即可将目的基因连接到载体中。五、利用家蚕后部丝腺体外表达系统合成蛋白质的方法在装有50ul家蚕后部丝腺组织提取液的离心管中加入约lngpUC19-FL-GFP-PolyA重组质粒(或插有外源基因的pUC19-FL-GFP-PolyA重组质粒或插入外源基因的pUC19-FL-PolyA重组质粒)及蛋白酶抑制剂，25"C—29"C水浴，分0，3h，6h，12h，18h，24h取样检测蛋白的表达。见图3，3小时就有蛋白表达，6小时最佳，18小时后蛋白表达明显降低，有可能是表达的蛋白降解。六、表达产物的检测电泳法(见《分子克隆》)检测蛋白的表达。电泳结束后，在荧光显微镜下观察，在488nm激发波长下观察绿色荧光蛋白GFP的表达。如果所用的载体为带有外源目的基因的pUC19-FL-PolyA重组质粒，则采用考染法观测目的蛋白的表达。最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的具体实施例子。显然，本发明不限于以上实施例子，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。序列表<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>权利要求1、一种利用家蚕后部丝腺体外表达系统合成蛋白质的方法，其特征在于在家蚕后部丝腺组织提取液中加入pUC19-FL-GFP-PolyA重组质粒或插有外源基因的pUC19-FL-GFP-PolyA重组质粒或pUC19-FL-PolyA质粒或插有外源基因的pUC19-FL-PolyA质粒及蛋白酶抑制剂，25℃～29℃水浴，即得目的蛋白的表达。2、根据权利要求l所述的利用家蚕后部丝腺体外表达系统合成蛋白质的方法，其特征在于所述家蚕后部丝腺组织提取液的制备方法包括(1)取四龄或五龄家蚕，将家蚕浸于75%乙醇中麻醉，解剖取出丝腺，置于0.9c/。的生理盐水或PBS中，取后部丝腺，一80一6CTC保存；(2)取以上保存的后部丝腺，置于匀浆器中，加入生理盐水或PBS，冰上匀浆；取匀桨液于1.5mlEP管中，2。C6。C，1000014000rpm离心1015min，取上清，重复三次，取上清，即为家蚕后部丝腺组织提取液。3、根据权利要求l所述的利用家蚕后部丝腺体外表达系统合成蛋白质的方法，其特征在于所述pUC19-FL-PolyA质粒的制备方法包括(1)以家蚕基因组DNA为模板，L-1和L-2为引物，PCR扩增出fib-L启动子序列，经EcoRI和BamHI双酶切后定向克隆至载体pUC19中，获得重组质粒pUC19-FL;L-1:5'_ccggaattccgactcgccaagttacgtc-3';L-2:5'_ggcggatccccgggtaccgagctcgtggtctgttatgtgacc-3';(2)以家蚕基因组DNA为模板，L-3和L-4为引物，PCR扩增出fib-LpolyA(1)，经SalI和HindlII双酶切后定向克隆至pUC19-FL中fib-L启动子下游，获得重组质粒pUC19-FL-Po1yA;5'—gcggtcgacctgcaggcatgccaaattgtgtttgcgttagg-3';卜4:5'_gccaa_gcttcactgtccaatccaccgtc_3'。4、根据权利要求l所述的利用家蚕后部丝腺体外表达系统合成蛋白质的方法，其特征在于所述pUC19-FL-GFP-PolyA重组质粒的制备方法包括(1)以家蚕基因组DNA为模板，L-l和L-2为引物，PCR扩增出fib-L启动子序列，经EcoRI和BamHI双酶切后定向克隆至载体pUC19中，获得重组质粒pUC19-FL;L—1:5'-ccggaattccgactcgccaagttacgtc—3';H5'-ggcggatccccgggtaccgagctcgtggtctgttatgtgacc-3';(2)以家蚕基因组DNA为模板，以L-5和L-6为引物，PC財广增出fib-LpolyA(2);5'-gagctgtacaagtaacaaattgtgtttgcg-3';L—6:5'-gccaagcttxactgtccaatccaccgtx—3';(3)，以质粒pEGFP-Nl为模板，以L-7和L-8为引物，PCR扩增GFP报告基因序列；7-5'-ccggtcgacctgcaggcatgcatggtgagcaagggc-3';L—8:5'—cgcaaacacaatttgttacttgtacagctc—3';(4)以fib-LpolyA(2)和GFP报告基因序列为模板，以L-7和L-6为引物，利用重叠PCR的方法扩增出带有fib-LpolyA(2)禾BGFP报告基因序列的片段，即GFP-PolyA，经SalI和HindlII双酶切后定向克隆至重组质粒pUC19-FL中，获得重组质粒pUC19-FL-GFP-Po1yA，L—6:5'-gccaagcttcactgtccaatccaccgtc-3';7:5'—ccggtcgacctgcaggcatgcatggtgagcaagggc-3'。全文摘要本发明公开了一种利用家蚕后部丝腺体外表达系统合成蛋白质的方法，在家蚕后部丝腺组织提取液中加入pUC19-FL-GFP-PolyA重组质粒或插有外源基因的pUC19-FL-GFP-PolyA重组质粒或pUC19-FL-PolyA质粒或插有外源基因的pUC19-FL-PolyA质粒及蛋白酶抑制剂，25℃～29℃水浴，即得目的蛋白的表达。本发明的有益之处在于本发明是在25℃～29℃条件下表达蛋白，低温(常规是在37℃)条件有利于表达蛋白以溶解状态生成，减少包含体的形成，利于蛋白的分离纯化。同时，本发明所述的方法不受细胞的限制，可在短时间内合成蛋白质。文档编号C12N15/79GK101358196SQ20081012047公开日2009年2月4日申请日期2008年8月29日优先权日2008年8月29日发明者吕正兵,夏佳音,张耀洲,清盛,聂作明,健陈,琴陈申请人:浙江理工大学