专利名称：一种用蚕生产抗血栓药物的方法
技术领域：
本发明涉及到通过家蚕杆状病毒表达系统用蚕幼虫和蛹制备Annexin V和低分子量尿激酶的融合蛋白的方法，本发明还涉及用蚕幼虫和蛹生产Annexin V和低分子量尿激酶的融合蛋白制备抗血栓药物的方法。
本发明提供了含有Annexin V和低分子量尿激酶的质粒pUC-UKAV，以中国人肾细胞细胞mRNA为模板，通过RT-PCR扩增，在5’端引进BamHI酶切位点，在3’端引入XhoI位点和水蛭素多肽核苷酸序列，PCR产物克隆进pUC19的HindII位点，构建质粒pUC-UK；以含有人胎盘mRNA为模板，通过RT-PCR扩增AnnexinV的cDNA，在5’端引进XhoI酶切位点，在3’端引入EcoRI位点，PCR产物经Xho I和EcoRI酶切克隆进pUC-UK的XhoI和EcoRI位点，构建质粒pUC-UKAV，经测序证明其核苷酸序列完全正确。
本发明还提供了含Annexin V和低分子量尿激酶融合基因的杆状病毒转移质粒pBac-UKAV。将质粒pUC-UKAV先用BamHI和EcoRI酶切，克隆进入用BamHI和EcoRI酶切的pBacPAK8，构建含Annexin V和低分子量尿激酶融合基因转移质粒pBac-UKAV(
图1)。
本发明还提供了含Annexin V和低分子量尿激酶融合基因的重组昆虫杆状病毒BmBacUKAV。将转移质粒pBac-UKAV与家蚕野生病毒DNA进行共转染家蚕(Bombyx mori)细胞BmN，进行10轮空斑和Southern点杂交筛选出含AnnexinV和低分子量尿激酶融合基因的重组昆虫杆状病毒BmBacUKAV。该病毒已提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，地址在北京中关村，保藏日期为2001年7月2日，保藏编号为GMCC NO0595。
本发明还提供了Annexin V和低分子量尿激酶融合基因在家蚕幼虫和蛹中的表达产物。将重组杆状病毒BmBacUKAV感染BmN细胞进行病毒扩增，然后将扩增后的重组杆状病毒BmBacUKAV注射至五龄家蚕幼虫和蛹体内，分别取24、48、72、96和120小时的家蚕淋血巴，用纤维蛋白-琼脂糖平板法测定表明表达产物具有明显的纤溶活性，可被尿激酶的单克隆抗体所中和，在感染的第六天血淋巴中的尿激酶活性达到6×104IU/ml以上，在感染的第六天蛹血淋巴的活性达到8×104IU/ml。抗凝实验表明，表达产物也具有Annexin V的抗凝活性。膜结合特异性研究表明，Annexin V与低分子量尿激酶融合蛋白对活化的血小板的亲和力与Annexin V相同。
本发明还提供了在家蚕幼虫表达的Annexin V和低分子量尿激酶融合蛋白进行纯化。在感染的第六天收集蚕血清先经离心和硫酸铵沉淀后上Sephadex G100柱和MonoQ柱分离，每次收集样品均经ELISA测活，确定其活性存在，进一步用HPLC阳离子交换柱纯化，获得纯度为99％的重组蛋白。
本发明还将家蚕幼虫和蛹体表达Annexin V和低分子量尿激酶融合蛋白制成口服药物。在家蚕幼虫和蛹体表达Annexin V和低分子量尿激酶融合蛋白，经过过滤(100KD超滤)，30000rmp离心后经冷冻干燥后，以家蚕蛹为填充料配制成口服药物。
本发明还将家蚕幼虫和蛹体表达Annexin V和低分子量尿激酶融合蛋白进行了动物试验，取SD大鼠(由浙江医学科学院动物中心提供)50只，随机8分组，每组动物10只。先将大鼠以30g.L-1戊巴比妥钠按40mg.kg-1腹腔注射麻醉后，于腹正中线切开皮肤约3cm，开腹后分离下腔静脉，于左肾静脉下方用粗丝线结扎下腔静脉，缝合皮肤。结扎下腔静脉后2h开始静脉和口服给药，以尿激酶为阳性对照，每只大鼠给药容积为2ml。给药后1h处死动物，重新开腹，在结扎下方2cm处夹闭血管，剖开血管，取出血栓，称取血栓重量，计算溶栓百分率。剥离大鼠静脉血栓时发现，空白对照组的血栓基本上完全充满整段静脉血管。静脉注射和口服给予药液后，各组动物静脉血栓占管腔面积明显减少，结果见表1。结果显示静脉注射和口服给药均具备显著减少下腔静脉血栓湿重的作用，以大剂量组溶栓作用最大，溶栓率达35.2％，各剂量间显示出量效相关趋势。与尿激酶相比，本发明表达的蛋白不仅效果好，而且使用剂量显著少于尿激酶。
综合所述，本发明的优点如下与原核表达尿激酶在临床应用中有种种不足(例如缺乏血栓特异性或在体内半衰期较短，临床应用往往会出现出血等副作用)相比，在家蚕幼虫和蚕蛹中的表达产物具有更高的临床应用价值；家蚕是可以无菌大规模饲养经济昆虫，可以低成本地大规模饲养；蚕体中有多种天然蛋白质保护剂，对表达产物有保护作用，使基因表达产物十分稳定；家蚕生产的蛋白可以口服，为患者解除了注射的痛苦和被感染的威胁，产生Annexin V和低分子量尿激酶融合蛋白，既具有低分子量尿激酶的溶活性，而且对活化血小板也具有高亲和力，通过动物试验证明其抗血拴作用，使其成为一种新型血栓靶向性的溶栓药物，不仅效果好，而且使用剂量显著少于尿激酶。
剥离大鼠静脉血栓时发现，空白对照组的血栓基本上完全充满整段静脉血管。静脉注射和口服给予药液后，各组动物静脉血栓占管腔面积明显减少，结果见表1。结果显示，静脉注射和口服给药均具备显著减少下腔静脉血栓湿重的作用，以大剂量组溶栓作用最大，溶栓率达35.2％，各剂量间显示出量效相关趋势。与尿激酶相比，本发明表达的蛋白不仅效果好，而且使用剂量显著少于尿激酶。
表1 对结扎大鼠下腔静脉形成的静脉血栓的溶栓作用
**P＜0.01，*P＜0.0权利要求
1.一种用蚕生产抗血栓药物的方法其中所述人Annexin V和低分子量尿激酶融合蛋白是通过带人Annexin V和低分子量尿激酶融合基因的重组家蚕杆状病毒(Bombyx mori Nuclear polyhedrosis Virus)感染家蚕幼虫和蛹体内表达产生，所述的含有人Annexin V和低分子量尿激酶融合基因的重组家蚕杆状病毒为BmBacUKAV，该病毒已提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，地址在北京中关村，保藏日期为2001年7月2日，保藏编号为GMCC NO0596。
2.根据权利要求1所述的一种用蚕生产抗血栓药物的方法，其特征在于还包括分离，纯化家蚕表达的人Annexin V和低分子量尿激酶融合蛋白的步骤。
3.根据权利要求2所述的一种用蚕生产抗血栓药物的方法，其特征在于还包括以家蚕为填充剂制备口服药物的步骤。
4.根据权利要求1所述的一种用蚕生产抗血栓药物的方法，其特征在于还包括将表达人Annexin V和低分子量尿激酶融合蛋白的家蚕和蛹经冷冻干燥后制成口服药物的步骤。
5.根据权利要求1所述的一种用蚕生产抗血栓药物的方法，其特征在于BmBacUKAV是用昆虫杆状病毒转移质粒pBac-UKAV和野生病毒DNA进行共转染家蚕细胞经10轮空斑筛选和Southern杂交斑筛选获得。
6.根据权利要求1所述的一种用蚕生产抗血栓药物的方法，其特征在于所述昆虫杆状病毒转移质粒pBac-UKAV的构建是通过RT-PCR方法合成的人尿激酶和Annexin V基因片段，构建人Annexin V和低分子量尿激酶融合基因，将Annexin V和低分子量尿激酶融合基因克隆进入转移载体pBacPAK-8中，获得的重组转移载体质粒pBac-UKAV。
7.根据权利要求1所述的一种用蚕生产抗血栓药物的方法，其特征在于所述的人Annexin V和低分子量尿激酶融合基因在家蚕幼虫和蛹中的表达产物是通过重组杆状病毒BmBacUKAV注射至五龄家蚕幼虫和蛹体内表达产生。
全文摘要
本发明公开了一种用蚕生产抗血栓药物的方法，属于生物技术制药工程中的基因工程生产多肽类药物技术领域。通过家蚕杆状病毒表达系统(Bombyx moriNuclearpolyhedrosis Virus)重组带有人Annexin V和低分子量尿激酶的融合蛋白基因，获得重组病毒，该病毒已提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，地址在北京中关村，保藏日期为2001年7月2日，保藏编号为GMCC NO0595，将该重组病毒接种家蚕幼虫、蛹进行表达，经分离纯化，冷冻干燥，制成注射和口服药物，经动物试验，均具有显著的抗血栓作用，成为一种制备靶向性的溶栓药物的新型方法。与现有技术相比，原料易得，生产成本低，治疗效果良好，而且使用剂量显著少于尿激酶。
文档编号C12N15/85GK1404872SQ0114214
公开日2003年3月26日 申请日期2001年9月14日 优先权日2001年9月14日
发明者张耀洲, 金勇丰, 吴祥甫 申请人:浙江中奇生物药业股份有限公司