专利名称：链霉菌2－硝基丙烷双加氧酶基因及应用的制作方法
技术领域：
本项发明属于应用环境微生物领域，具体地说，通过分子生物学技术从圈卷产色链霉菌中克隆到一个新的基因，其编码的产物是一种2-硝基丙烷双加氧酶，在工业污染物硝基烷类的生物降解方面有极大的应用价值，可用于改善环境。
2.通过点杂交及Southern杂交，从该基因文库中克隆到1.5-kbDNA片段，对它进行了亚克隆及测序，用软件FramePlot2.3.1对所测定序列进行开放阅读框分析，其中含有一完整的开放阅读框，基因全长1092bp，G+C含量为74％。将此基因命名为2-硝基丙烷双加氧酶基因npD。
3.通过PCR技术扩增了末端含有NdeI和HindIII酶切位点的npD完整DNA片段，将它连接在大肠杆菌高表达载体pET23b的NdeI和HindIII酶切位点上，转化表达宿主菌BL21(DE3)(Studier F W，et al.J.Mol.Biol.1986，189113)，进行IPTG诱导表达。
4.对大肠杆菌中npD的表达产物，作了生物活性测定。以1-硝基丙烷、2-硝基丙烷、硝基乙烷和硝基甲烷为底物，以对氨基苯磺酸和α-萘胺进行显色反应，发现该酶除对硝基甲烷活力较低外，对其它三种底物的活力都很强。
5.采用葡聚糖凝胶柱和DEAE Sepharose Fast Flow柱层析，对npD的表达产物进行了纯化，获得了纯化的2-硝基丙烷双加氧酶NPD。它保持了很高的生物活性。
6.利用本发明构建的工程菌及其产生的酶生物降解环境中的重要污染物硝基烷类化合物，改善环境，它与其它的降解方法相比更高效、经济、安全。
line 1蛋白质分子量标准line 2BL21(DE3)/pET23b菌体蛋白提取物line 3-6BL21(DE3)/pNPD菌体蛋白提取物图5 npD基因在大肠杆菌中表达产物的生物活性测定A1-A3含有pET23b空载体的BL21(DE3)细胞破碎液对不同底物的作用B1-B3含有质粒pNPD的BL21(DE3)细胞破碎液对不同底物的作用C1-C3未接菌的培养液对不同底物的作用1底物为1-硝基丙烷2底物为2-硝基丙烷3底物为硝基乙烷取10ng-3μg DNA于沸水中变性10分钟，立即置冰/NaCl中3分钟；加入2μl六核苷酸混合物，2μl含digoxigemin-11-dUTP的dNTP混合物，加蒸馏水至19μl，最后加入1μl Klenow酶，37℃温育20小时后，加入2μl0.2M EDTA(pH8.0)终止反应。再加入2.5μl 4M LiCl，75μl预冷的无水乙醇，-20℃沉淀过夜，12000g离心10分钟，40μl预冷的70％乙醇洗一次，真空干燥，溶于50μl TE缓冲液中。为制备好的探针。1.2基因文库的构建按1％的接种量转接圈卷产色链霉菌7100的孢子悬浮液于YEME液体培养基(Hopwood D A，et al.Genetic Manipulation of Streptomyces.A Laborarory Manual，Norwich.John Innes Foundation.1985)中，28℃培养48小时，碱法提取总DNA，以EcoRI和NotI酶切，用地高辛标记好的探针在68℃进行Southern杂交，结果表明，用NotI酶切后的DNA片段适于构建基因文库，回收分子量为7.0kb左右的DNA片段，构建部分基因文库将回收的NotI酶切后DNA片段与经NotI酶切后的质粒载体M13-的线性片段混合后，在T4 DNA连接酶作用下，16℃连接过夜，并转化大肠杆菌JM109(Sambrook J，et al.Molecular Cloning.A Laboratory Manual.1989)感受态细胞，挑取白色转化子，接种到含氨苄青霉素的LB固体培养基上(Sambrook J，et al.Molecular Cloning.A Laboratory Manual.1989)，37℃培养过夜，提取质粒，挑选含有大小合适的插入片段的重组质粒。
将上述质粒DNA用TE缓冲液稀释10倍后，直接点在尼龙膜上，用前述标记的探针进行点杂交，挑出点杂交中阳性信号较强的几个菌落，LB液体培养基振荡培养过夜后，碱法提取质粒，并以NotI酶切质粒，转移到尼龙膜上后，进行Southern杂交验证。挑出含有目的插入片段的重组质粒，命名为pTH1101。通过亚克隆技术确定目的基因存在于1.5-kb的DNA片段中。1.3目的基因的DNA序列测定及分析将上述1.5-kb的DNA片段亚克隆至M13-的SstII酶切位点，从转化子中挑选正反两个方向插入的重组质粒，分别命名为pTH1103和pTH1104，用于DNA双链测序。
将pTH1103和pTH1104分别用3’延长端的限制性内切酶ApaI完全酶切，再用5’延长端的限制性内切酶HindIII完全酶切，将两次酶切后的质粒用无水乙醇沉淀后，离心，重新溶于双蒸水中，取约6μg DNA，加入巯基乙醇及700u外切核酸酶III(ExoIII)，32℃从线性质粒DNA的末端进行逐步缩小，每1分钟取一次样品，分6次取完后，每个时间点的样品中加入5单位的绿豆核酸酶(Mung Bean Nuclease)，30℃作用30分钟，将DNA末端切平，最后DNA用无水乙醇沉淀过夜。离心后，80％乙醇洗一次，真空干燥后溶于TE中，加入T4 DNA连接酶，22℃自身连接，转化大肠杆菌JM109感受态细胞，挑选分子量大小位于原重组质粒和M13-载体之间的质粒，挑出测序所用的亚克隆，使大小相差约200-250bp，随后将这些质粒转化大肠杆菌JM101。
得到的转化子单菌落转接至2×YT液体培养基中(Sambrook J，et a1.Molecular Cloning.A laboratory manual.1989)，在帮助噬菌体K07的作用下，制备单链DNA，在每个反应中加入1μg/μl的单链DNA 2μl，用T7测序试剂盒进行DNA序列测定，结果如
图1。用软件FramePlot2.3.1对所测定序列分析，发现它含有一完整的开放阅读框，其基因全长1092bp(如图1)，编码363个氨基酸残基(如图2)。2.npD基因在大肠杆菌中的表达2.1 npD基因片段的PCR扩增以5’-GAC ATA TGT CCT CCG CGC TGA-3’和5’-GG AAG CTT TCACCC CTT ACG GGA-3’为引物，在以下条件下进行PCR扩增反应体系50％甘油4μl，去离子水8.7μl，缓冲液2μl，dNTP 2μl，引物1、引物2各1μl，pfu酶0.3μl，模板1μl，液体石蜡10μl。
PCR扩增条件a.95℃ 变性3minb.95℃ 变性1.5min，42℃ 退火1.5min，72℃延伸2.5min，进行5个循环；c.95℃ 变性1.5min，60℃延伸1.5min，72℃退火2.5min，做30个循环；d.72℃ 延伸10min，冷却至室温，0.8％琼脂糖凝胶电泳检测2.2重组质粒pNPD的构建(如图3)通过PCR扩增，得到含有NdeI和HindIII酶切位点的1.1-kb的DNA片段，此片段在T4 DNA连接酶的作用下，与经EcoRV酶切后的质粒M13-，22℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5α(Hanahan.J.Mol.Biol.1983，166557)，得到正确的重组质粒pTH1105。
质粒pTH1105以NdeI和HindIII酶切，回收1.1-kb的小片段，连接到经NdeI和HindIII酶切的质粒pET23b上(Novagen公司)，得到了正确的重组质粒pNPD，将此质粒转化入宿主菌BL21(DE3)。2.3 npD基因在大肠杆菌中的诱导表达将含有质粒pNPD的BL21(DE3)菌株接种在LB液体培养基中(含100μg/ml氨苄青霉素)，37℃摇床培养过夜(220rpm)，作为种子液使用。
将种子液按照1％的接种量转接到新鲜的LB液体培养基中含(100μg/ml氨苄青霉素)，37℃，220rpm摇床培养2.5～3小时。
加入IPTG(终浓度0.1mM)，继续摇床培养3小时。于5000rpm下离心3min，取沉淀(菌体)。用于SDS-PAGE检测目的蛋白带的表达及生物活性检测。SDS-PAGE检测的结果表明在37kD附近有一条目的蛋白带，与预期大小一致(如图4)。3.npD基因表达产物生物活性的测定将菌体用0.2M pH7.0磷酸缓冲液悬浮，进行细胞超声波破碎(100W，15min)，10000rpm离心15min，，取上清，得到酶储备液。测定其活性后发现含重组质粒的细胞破碎液产生阳性反应，即迅速出现明显的紫红色，而只含有空载体pET23b的对照菌株及未接菌的空白对照无此颜色反应。表明npD基因的表达产物能够将底物氧化。以不同的硝基烷类化合物为底物，发现它对1-硝基丙烷、2-硝基丙烷、硝基乙烷都有不同程度的生物活性，对硝基甲烷的活性较低(如图5)。实施例22-硝基丙烷双加氧酶的分离纯化和生物活性将获得的菌体破碎液，进行葡聚糖凝胶柱层析，以0.01M磷酸缓冲液(pH7.0)洗脱，合并活性部分，并进行DEAE Sepharose Fast Flow柱层析。分别以2-3倍柱体积的0.2M和0.3M的氯化钠洗涤，最后用0.4M的氯化钠洗脱，活性部分再经过DEAE Sepharose Fast Flow反复柱层析，以SDS-PAGE检测纯度。结果表明，经过以上纯化过程，获得了纯度和活性都很好的目的蛋白NPD。
将0.05μg酶液、0.4mM底物100μl及800μl 0.2M磷酸缓冲液(pH7.0)混合后，于37℃作用5分钟，以200μl 5mM硫酸铜终止反应。加入对氨基苯磺酸(0.33％)0.5ml和α-萘胺(0.05％)0.5ml显色15分钟，在λ540nm处检测O.D值。结果表明，npD基因的表达产物能够将多种硝基烷类化合物氧化，它对1-硝基丙烷、2-硝基丙烷、硝基乙烷仍然有不同程度的生物活性。
NpD的DNA核苷酸序列表CCGCGAGGAA CGGCCCCAGG GCAGTTCAGC CGGGGCAGCA GGGTCTGTTC TCGCGACTGATGACTCGTTC AACGGCCGCT GAGCATGTGG GCGCCTCCGG GGTGTGCCGG GGGCGTCTCARBSGGGTCGTTCC GGGGGATGCC CCGATTCCGG CCGGTCGGAA GGACGTGACA CCATGCGGTC起始密码子→ATGTCCTCCG CGCTGACCGA TCTCTTTCCC CTCCCGATCG TGCAGGCACC CATGGCGGGCGGAGTCTCCG TCCCGCAGCT CGCCGCCGCC GTCTGCGAGG CCGGCGGCTC GGGGTTCCTCGCCGCCGGGT ACAAGACCGC CGACGGGATG TACCAGGAGA TCAAGCGGTT GCGCGGGCTCACGGGCCGCC CGTTCGGCGT CAACGTGTTC ATGCCGCAGC CCGAGCTCGC GGAGTCCGGCCGCCGTCGAG GTCTACGCCC ACCAGCTGGC CGGCGAGGCG CCTGGTACGA GACCGAGCTGGGCGACCCGG ACGGCGGCCG GGACGACGGC TACGACGCCA AGCTCGCCGT CCTGCTCGATGACCCGGTCC CGGTGGTCTC CTTCCACTTC GGCGTGCCGG ACCGCGAGGT CATCGCGCGGCTGCGCCGGG CCGGGACGCT CACCCTGGTC ACCGCCACCA CCCCGGAGGA GGCCCGCGCGGTCGAGGCGG CCGGGGCGGA CGCGGTGATC GCGCAGGGCG TGGAGGCCGGCGGACACCAGGGCACCCACC GCGACTCGTC CGAGGACGAC GGCGCCGGCA TCGGGCTGCT GTCGCTTCTCGCGCAGGTCC GCGAGGCCGT GGACATCCCG GTCGTCGCCG CCGGCGGCAT CATGCGCGGCGGCCAGATCG CCGCCGTCCT CGCGGCCGGC GCCGACGCGG CCCAGCTCGG CACCGCCTTCCTCGCCACCG ACGAGTCCGG CGCGCCCGGC CCGCACAAAC GGGCGCTGAC CGACCCCCTCTTCGCGCGCA CCCGGCTGAC CCGCGCCTTC ACCGGCCGCC CGGCCCGCTC ACTGGTCAACCGCTTCCTGC GCGAGCACGG CCCGTACGCG CCCGCCGCCT ACCCGGACGT CCACCACCTCACCTCGCCGC TGCGCAAGGC CGCCGCGAAG GCCGGTGACG CGCAGGGCAT GGCGCTGTGGGCGGGACAGG GCCACCGGAT GGCCCGGGAG CTGCCGGCCG GACGCGTGGT GGAGGTGCTGGCGGCGGAAC TCGGCCAGGC CCGGACAGCG TTGTCGGACG CATCCCGTGA GAACGAGTCC终止密码子CGTAAGGGGT GAGGGCGCGT GACCGCTCCC GTCTTCGTGG TGGAGCACTT CGAGCCGGACCGACCGGTAG CTCCTGGAGG CGCCGAGGGC CGCCACGCCG TCTCCGTGAA GCGCTGCGCCCGGCGAGGAG GTCGTCCTCA CCGACGGCGC CGGGCTAGCG CTGGCCGAGG TGACCGGCACCGAGGGCAAG GACCGCTGGT CGTCCGCATG GACCCGGTGA CCGAGGAACC GGCGCCGAACCGCGTGGAGC TCAATCGCCT ATAGTGAGTCNpD的DNA核苷酸序列所推导的363个氨基酸组成MSSALTDLFPLPIVQAPMAGGVSVPQLAAAVCEAGGSGFLAAGYKTADGMYQEIKRLRGLTGRPFGVNVFMPQPELAESGRRRGLRPPAGRRGAWYETELGDPDGGRDDGYDAKLAVLLDDPVPVVSFHFGVPDREVIARLRRAGTLTLVTATTPEEARAVEAAGADAVIAQGVEAGGHQGTHRDSSEDDGAGIGLLSLLAQVREAVDIPVVAAGGIMRGGQIAAVLAAGADAAQLGTAFLATDESGAPGPHKRALTDPLFARTRLTRAFTGRPARSLVNRFLREHGPYAPAAYPDVHHLTSPLRKAAAKAGDAQGMALWAGQGHRMARELPAGRVVEVLAAELGQARTALSDASRENESRKG
权利要求
1.一种编码2-硝基丙烷双加氧酶基因npD的DNA核苷酸序列如下所示CCGCGAGGAA CGGCCCCAGG GCAGTTCAGC CGGGGCAGCA GGGTCTGTTC TCGCGACTGATGACTCGTTC AACGGCCGCT GAGCATGTGG GCGCCTCCGG GGTGTGCCGG GGGCGTCTCARBSGGGTCGTTCC GGGGGATGCC CCGATTCCGG CCGGTCGGAA GGACGTGACA CCATGCGGTC起始密码子→ATGTCCTCCG CGCTGACCGA TCTCTTTCCC CTCCCGATCG TGCAGGCACC CATGGCGGGCGGAGTCTCCG TCCCGCAGCT CGCCGCCGCC GTCTGCGAGG CCGGCGGCTC GGGGTTCCTCGCCGCCGGGT ACAAGACCGC CGACGGGATG TACCAGGAGA TCAAGCGGTT GCGCGGGCTCACGGGCCGCC CGTTCGGCGT CAACGTGTTC ATGCCGCAGC CCGAGCTCGC GGAGTCCGGCCGCCGTCGAG GTCTACGCCC ACCAGCTGGC CGGCGAGGCG CCTGGTACGA GACCGAGCTGGGCGACCCGG ACGGCGGCCG GGACGACGGC TACGACGCCA AGCTCGCCGT CCTGCTCGATGACCCGGTCC CGGTGGTCTC CTTCCACTTC GGCGTGCCGG ACCGCGAGGT CATCGCGCGGCTGCGCCGGG CCGGGACGCT CACCCTGGTC ACCGCCACCA CCCCGGAGGA GGCCCGCGCGGTCGAGGCGG CCGGGGCGGA CGCGGTGATC GCGCAGGGCG TGGAGGCCGGCGGACACCAGGGCACCCACC GCGACTCGTC CGAGGACGAC GGCGCCGGCA TCGGGCTGCT GTCGCTTCTCGCGCAGGTCC GCGAGGCCGT GGACATCCCG GTCGTCGCCG CCGGCGGCAT CATGCGCGGCGGCCAGATCG CCGCCGTCCT CGCGGCCGGC GCCGACGCGG CCCAGCTCGG CACCGCCTTCCTCGCCACCG ACGAGTCCGG CGCGCCCGGC CCGCACAAAC GGGCGCTGAC CGACCCCCTCTTCGCGCGCA CCCGGCTGAC CCGCGCCTTC ACCGGCCGCC CGGCCCGCTC ACTGGTCAACCGCTTCCTGC GCGAGCACGG CCCGTACGCG CCCGCCGCCT ACCCGGACGT CCACCACCTCACCTCGCCGC TGCGCAAGGC CGCCGCGAAG GCCGGTGACG CGCAGGGCAT GGCGCTGTGGGCGGGACAGG GCCACCGGAT GGCCCGGGAG CTGCCGGCCG GACGCGTGGT GGAGGTGCTGGCGGCGGAAC TCGGCCAGGC CCGGACAGCG TTGTCGGACG CATCCCGTGA GAACGAGTCC终止密码子CGTAAGGGGT GAGGGCGCGT GACCGCTCCC GTCTTCGTGG TGGAGCACTT CGAGCCGGACCGACCGGTAG CTCCTGGAGG CGCCGAGGGC CGCCACGCCG TCTCCGTGAA GCGCTGCGCCCGGCGAGGAG GTCGTCCTCA CCGACGGCGC CGGGCTAGCG CTGGCCGAGG TGACCGGCACCGAGGGCAAG GACCGCTGGT CGTCCGCATG GACCCGGTGA CCGAGGAACC GGCGCCGAACCGCGTGGAGC TCAATCGCCT ATAGTGAGTC。
2.根据权利要求1所述的2-硝基丙烷双加氧酶基因核苷酸序列所推导的363个氨基酸组成如下所示MSSALTDLFPLPIVQAPMAGGVSVPQLAAAVCEAGGSGFLAAGYKTADGMYQEIKRLRGLTGRPFGVNVFMPQPELAESGRRRGLRPPAGRRGAWYETELGDPDGGRDDGYDAKLAVLLDDPVPVVSFHFGVPDREVIARLRRAGTLTLVTATTPEEARAVEAAGADAVIAQGVEAGGHQGTHRDSSEDDGAGIGLLSLLAQVREAVDIPVVAAGGIMRGGQIAAVLAAGADAAQLGTAFLATDESGAPGPHKRALTDPLFARTRLTRAFTGRPARSLVNRFLREHGPYAPAAYPDVHHLTSPLRKAAAKAGDAQGMALWAGQGHRMARELPAGRVVEVLAAELGQARTALSDASRENESRKG。
3.根据权利要求2所述的由363个氨基酸组成的蛋白，是一种硝基烷类双加氧酶。
4.一种重组质粒pNPD。
5.一种含有权利要求4所述的重组质粒的重组微生物。
6.一种根据权利要求5所述的重组微生物是大肠杆菌BL21(DE3)菌株。
7.根据权利要求2或3或4或5或6，任选一项中所述的涉及有关2-硝基丙烷双加氧酶在氧化硝基烷类中的应用。
全文摘要
本项发明属于应用环境微生物领域，具体地说，通过分子生物学技术从圈卷产色链霉菌(Streptomycesansochromogenes 7100)中克隆到一个新的基因，其编码的产物是一种2－硝基丙烷双加氧酶，在工业污染物硝基烷类的生物降解方面有极大的价值，可用于改善环境。
文档编号C12N15/53GK1403576SQ0114201
公开日2003年3月19日 申请日期2001年9月6日 优先权日2001年9月6日
发明者谭华荣, 张集慧, 马文勃 申请人:中国科学院微生物研究所