专利名称：抗血栓剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及阻止血栓发展或促进其溶解的抗血栓剂。
背景技术：
血栓症是本来必须在血管内保持流动性的血液因血小板等凝血、纤溶系统平衡失调引起的在机体血管内凝固的疾病。血栓在心脏冠脉内形成则引起心肌梗塞，在下肢静脉系等处形成则发生深部静脉血栓症。在重度感染和肿瘤等的影响下，凝血系统被异常激活，全身微血管内广泛发生血栓，则出现称作弥漫性血管内凝血综合征(以下称作DIC)的病状。其中，因重度感染等引起的DIC每每并发多脏器功能不全，预后极严重。这样，血栓症因发病部位不同而有极其不同的病症，因而开发了各种各样的治疗方法。在药物方面，对心肌梗塞和深部静脉血栓等，可用尿激酶、组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(以下称作t-PA)或肝素等，对于DIC，仍然可用肝素。然而，尿激酶存在所谓对纤维蛋白亲和性低的问题，而t-PA则价格高、半衰期极短，或在经皮冠脉内血栓溶解疗法和未梢静脉内直接投与t-PA的再开通疗法上存在易发生再闭塞等问题。还有为使肝素的药效得到发挥，抗凝血酶原III必须达到一定浓度等问题。而且，所用的这样的药物的共同之处在于引起严重出血的副作用。为了解决此问题，也已开发了合成抗蛋白酶药物，但未完全解决出血的副作用，却仍保留了半衰期极短等问题。
关于硫酸皮肤素，以往报告了肝素辅因子-II介导的抗凝血活性，而在纤溶活性上，硫酸皮肤素有促进t-PA游离的报告(Abbadi—ni M.et al.，Blood 1987，70，1858—1860)，硫酸皮肤素也有不影响t-PA量和纤溶活性的报告(Tripodi A.et al.，Thromb Res.1991 62，663—672)，但对纤溶系统的影响并不明了。
迄今，各种实验中使用或在作为医药开发中的硫酸皮肤素是从猪或牛的肠或皮肤而来的(Fareed J.et al.Recent Advances inBlood Coagulation，1993，6，169—187)，关于其他来源的硫酸皮肤素的活性则一无所知。
发明的描述本发明者们研究了硫酸皮肤素对纤溶系统的影响，发现硫酸皮肤素具有比该化合物不存在时增强血栓溶解的作用。本发明者们还发现，在给予机体后，可从抗凝和纤溶活性两方面均起作用来考虑抗血栓作用。即，对于抑制血栓形成，促进溶解作用等的综合作用，硫酸皮肤素中极限粘度为0.8 100ml/g以上的特定的硫酸皮肤素，或从鸡冠而来的特定的硫酸皮肤素，或构成二糖组成中ΔDi-OS为2％以上7％以下的特定的硫酸皮肤素、或用下面的测定法得到的平均分子量为2.5万道尔顿以上10万道尔顿以下的硫酸皮肤素，或特别是上述硫酸皮肤素中那些肝素或硫酸乙酰肝素含量极低的特定的硫酸皮肤素，作用极强，从而完成了本发明。
本发明涉及的上述硫酸皮肤素为有效成份的抗血栓剂，或硫酸皮肤素与组织血纤维蛋白溶酶原激活剂合用的抗血栓剂。
硫酸皮肤素以N-乙酰基-D-半乳糖胺-4-硫酸与由L-艾杜糖醛酸组成的二糖的重复结构为主，也含少量D-葡糖醛酸，硫酸含量、硫酸等的结合位置、D-葡糖醛酸含量等因动物品种和脏器而异。
硫酸皮肤素通常从牛、猪等哺乳动物肠粘膜、皮肤或鸡冠等生物原料制成。
本发明者们发现，从这些原料得到的硫酸皮肤素或其药理上可容许的盐，与其不存在时相比，提高了单链或双链t-PA的血纤维蛋白溶酶原激活作用。而且，在体内投与时，本发明的特定硫酸皮肤素，即极限粘度为0.8 100ml/g以上，较佳者为0.9—2.0 100ml/g的硫酸皮肤素，或得自鸡冠的硫酸皮肤素，或构成二糖组成中ΔDi-OS为2％以上7％以下，较佳者为3％以上6％以下的硫酸皮肤素，或后述Biochim.Biophys.Acta，1117，60—70，1992上记载的用凝胶过滤法测得平均分子量为2.5万以上10万以下道尔顿，较佳者为3万以上6万以下道尔顿的硫酸皮肤素，或特别是上述硫酸皮肤素中那些肝素或硫酸乙酰肝素含量极低的特定的硫酸皮肤素或其药理学上可容许的盐，与其他硫酸皮肤素相比，血中维持时间长，不仅纤溶活性，还有抗凝血作用，相加起来在总的抗血栓作用上显示出有效的药理效应。
硫酸皮肤素的药理学上容许的盐有钠盐、钾盐、锂盐、钙盐等，而通常以钠盐的形式给药。t-PA无论内因性或外因性、单链或双链、特别无论是天然型或基因重组型，均可。而且，无论其一部分氨基酸缺乏或添加氨基酸，只要具有血纤维蛋白溶酶原激活作用即可(参见EP-A-112122)。
硫酸皮肤素或其药理学上容许的盐(以下也称作DS)单独单次给药或单独连续给药都显示其药理活性。给药途径，静脉内注射，动脉内注射，冠脉内注射均好，也可皮下注射和肌肉注射等。在将DS与t-PA合用时，可将DS与t-PA以同一途径同时给药，也可分别给药。
在DS血浓度与t-PA血浓度可预期达到有效浓度以上时，除上述冠脉内给药、静脉内给药之外，也可进行皮下给药等。
在配制这些制剂时，可适当使用医药上容许的稳定剂、乳化剂或渗透压调节剂，pH调节剂等辅助剂。
给药量，在对成人单独使用DS时，一日总量为50—3000mg，将其与t-PA合用时，可使用DS 50—3000mg、t-PA 10000—500000 I.U.(国际单位)。它们的有效成份可一日单次或隔适当的间隔分成2次至数次给药。也可历时数日连续静注。
如上所述，DS或其药理学上容许的盐激活纤溶活性，可作为有用的血栓溶解促进剂加以利用。特别是本发明的特定的DS，即极限粘度为0.8 100ml/g以上2.0 100ml/g以下的DS，或来自鸡冠的DS，或构成二糖组成中ΔDi-OS为2％以上7％以下的DS，或以后面所述测定法测得平均分子量为2.5万以上10万以下道尔顿的DS，或上述DS中那些肝素或硫酸乙酰肝素含量极低的特定的DS或其药理学上容许的盐，其效果显著。而极限粘度超过2.0 100ml/g，平均分子量大于10万道尔顿的DS，在以特别高浓度使用时，粘稠度增高，恐有使血液流动变差之虞，故不理想。此外，若上述DS或药理学上容许的盐与t-PA合用，则能显著提高溶解血栓的作用，可使t-PA的用量减少，作为有用的血栓溶解剂，可用于血栓症的治疗和预防。
特别是，上述本发明的特定的DS或其药理学上容许的盐等向生物体内投与时，与其他DS或其药理学上容许的盐相比，有效血浓度维持时间长，显示预防血栓发展、抑制其生成或促进溶解的效应，对弥漫性血管内凝血综合征，多发性血栓所伴有的多脏器功能不全、深部静脉血栓症等能发挥优良的效果。该效果不仅在上述疾患，而且在不论是动脉系、毛细血管系、静脉系一切类型的血栓病上发挥出来，除了可用于治疗、预防外，还可在用于肾透析等体外循环时为了防止血液凝固的目的而加以使用。
除去了DS中混有的肝素(以下称作Hep)或硫酸乙酰肝素(以下称作HS)的DS(以下称作DS-H(—))作为注射剂在血管内或皮下或肌肉进行注射时，更能抑制出血等副作用的出现。特别是将DS-H(—)给血小板、凝血因子低下、具有出血倾向的患者投药时，出血等副作用的出现较低，安全性高。
附图简述
图1表示大鼠被投予来自鸡冠的硫酸皮肤素钠盐(见参考例1)(RCDS)与来自小肠的硫酸皮肤素钠盐(见参考例2)(BIDS)后硫酸皮肤素钠盐的血中持续时间(见实施例1)。
●为投予BIDS，○为投予RCDS，▲为投予BIDS-H(—)，□为投予RCDS-H(—)，X表示●○▲□重迭。
图2表示BIDS对单链组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(sc-tPA)激活血纤维蛋白溶酶原的促进作用，以促进率表示。
图3表示BIDS对双链组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(tc-tPA)激活血纤维蛋白溶酶原的促进作用，以促进率表示。
图4为以促进率表示的RCDS对SC-tPA激活血纤维蛋白溶酶原的促进作用。
图5为以促进率表示的RCDS对tc-tPA激活血纤维蛋白溶酶原的促进作用。
图6表示BIDS对血浆块的溶解促进作用。
实施发明的最佳情况下面列举参考例和实施例对本发明作具体的说明。
参考例1(1)从鸡冠制备DS将1kg鸡冠切碎后煮沸，在残渣中加入5g链霉蛋白酶(科研制药公司，商品名プロナ—ゼ)，50℃消化12小时。将消化液经硅藻土过滤，将滤液的pH调节至pH5.8—6.3，加入来自链霉菌属的透明质酸酶(生化学工业公司)1000TRU，50℃消化3小时。在消化液中添加食盐，调整为0.65M，加到用0.5M食盐溶液平衡过的DiaionHPA-10(三菱化成工业公司，商品名)阴离子交换树脂柱(3×20cm)上。依次用0.65M食盐溶液0.5升和1.1M食盐溶液0.3升洗净柱后，收集用1.8M食盐溶液洗脱的部分，减压浓缩。浓缩液用蒸馏水透析一夜，浓缩成10ml后，加5M氢氧化钠溶液调节终浓度至0.5M。将此碱溶液37℃保温90分钟后，冷却，加醋酸中和。在中和液中加入2倍量乙醇，生成的沉淀依次用70％乙醇、纯乙醇和乙醚洗净后，在五氧化二磷存在下减压干燥。
将5g干燥物在125ml水中放置一夜后，离心(10℃，10000rpm，15分钟)除去少量不溶物。加入10％乙酸钠水溶液125ml，在冰浴中加乙醇使终浓度为45％。于4℃放置20小时后离心，以90％乙醇、纯乙醇和乙醚依次洗净沉淀，在五氧化二磷存在下减压干燥，得DS钠盐精制品(以下称作RCDS)。
从鸡冠分离精制硫酸皮肤素，不受上述方法所限定，也可按特公昭60-9042、特公昭61-21241来进行。
(2)从DS去除肝素(Hep)和硫酸乙酰肝素(HS)DS中微量混入的Hep和HS的去除按以下方法之一进行。
1)离子交换色谱法将(1)中所得的RCDS 50g加在用1.1M NaCl进行平衡后的Diaion HPA11(三菱化成工业公司，商品名)阴离子交换树脂柱(4.5×27cm)上，用1.1M NaCl 8升洗净后，收集用1.5M NaCl 8升洗脱的部分，用旋转式蒸发器浓缩后，透析，以42％乙醇使其沉淀，冷冻干燥，得到除去Hep和HS的RCDS样品(RCDS-H(—))。
2)亚硝酸分解法按Shively和Conrad的方法(Biochemistry 15，3932—3942，1976)进行。即在-10℃下将亚硝酸钡·一水合物0.124mg/ml，400ml与1N硫酸400ml混合，3000rpm离心2分钟后，取上清液500ml。在0.1mg/ml浓度的RCDS500ml中加入上述上清液500ml，混合，室温下放置10分钟。在其中加入适量碳酸钠溶液进行中和，浓缩以下的操作与1)同样地进行，得到除去Hep和HS的RCDS样品(RCDS—H(—))。
参考例2来自牛小肠粘膜的DS的制备将牛小肠10kg切断，除去粪和脂肪后，回收粘膜。加氢氧化钠，调整到2.5N，3升，37℃提取2小时。将此提取液中和后经硅藻土过滤，滤液透析，离心除去形成的不溶物。在上清液中加入乙醇和5g乙酸钠，得沉淀物。将此沉淀物溶于0.65M食盐溶液，以后与参考例1同样地上阴离子交换树脂柱，依次用0.65M和1.1M食盐溶液洗净后，用1.5m食盐溶液洗脱。洗脱部分用蒸馏水透析，在透析内液中加入乙酸钙和乙酸，终浓度分别调整到5％和0.5M。在此液中加入乙醇，收集以15—30％(v/v)沉淀的部分。用离子交换树脂将沉淀物转变为钠盐，按与参考例1同样的方法洗净和干燥，得DS钠盐(以下称作BIDS)。
用与参考例1(2)2)同样的方法，从BIDS除去Hep或HS，得到BIDS-H(—))。
为了比较硫酸皮肤素的性质，来自猪肠粘膜的硫酸皮肤素，来自猪皮肤的硫酸皮肤素分别用Celsus Lab Inc制(コスモバイォ销售)、生化学工业公司制(销售，同)的产品进行研究。
参考例3来源不同的各种硫酸皮肤素的理化性质比较(a)平均分子量的测定DS的平均分子量按Arai等的方法(Biochim.biophys.Acta，1117，60—70，1992)测定。即以已知分子量的葡糖胺基聚糖为标准品，用高速液相色谱凝胶过滤，由洗脱部位决定。柱采用TSK凝胶G4000 PWXL、G3000PWXL和G2500PWXL(均为300×7.8mm内径，东ソ—社制)三连柱，溶剂采用0.2M氯化钠溶液，以0.6ml/分，检测采用示差折射。
(2)二糖组成分析DS硫酸基位置的分析按新生物化学实验讲座3、糖类II，第49—62页的记载进行。即，用软骨素酶ABC消化DS，将生成的含不饱和键的二糖(不饱和二糖)部分不经分离，用HPLC进行分析，以及将上述不饱和二糖部分用软骨素-6-硫酸酶处理，再作HPLC分析，两者结果进行比较。软骨素酶ABC消化、软骨素-6-硫酸酶的脱硫酸化和HPLC分析的条件记录如下。
a)软骨素酶ABC消化按Yoshida的方法[Anal.Biochem.77，327—332，(1989)]，在20μlDS水溶液(10mg/ml)中，加入0.4M Tris—HCl(pH8.0)20μl、0.4M乙酸钠20μl、0.1％牛血清白蛋白20μl和水120μl，加入软骨素酶ABC(5U/ml)20μl，37℃反应2小时。
b)软骨素-6-硫酸酶消化在上述软骨素酶ABC消化物100μl中，加入溶于20mM Tris—HAc缓冲液(pH7.0)的软骨素-6-硫酸酶(5U/ml)20μl，37℃反应2小时。
c)HPLC分析将进行软骨素ABC酶消化后的溶液或该溶液经软骨素-6-硫酸酶消化后的溶液50μl用HPLC(日立制作所)进行分析。使用离子交换柱(YMC-Pack PA-120-S5柱，250×2.6mm内径)，测定232nm处的吸光度。以流速1.5ml/分，800mM磷酸氢钠在60分钟内从0％上升到100％的梯度进行洗脱。鉴定各部位具有硫酸根基的不饱和二糖的峰。
(3)极限粘度的测定DS极限粘度的测定按第12版日本药典进行。测定装置采用自动粘度测定装置(离合社制，VMC-052型)。溶剂采用0.2m氯化钠，在乌伯娄德型粘度管流下时间的测定上也用同样的溶液。粘度测定在30±0.1℃进行，将流下时间之差连续三次在0.1秒以内的测定值用于计算极限粘度。流下时间1/100秒四舍五入后作为测定值，极限粘度的计算应用下式。
溶液的流下速度ts；溶剂的流下速度to；试样浓度(重量％)CO以还原粘度(η还原＝(tS/to-1)/c)为纵座标、浓度为横座标作图，得到的直线延伸到浓度0处，在纵轴上的截距，即为极限粘度。
(4)结果将(1)—(3)的结果整理于表1。与来自鸡冠的DS的平均分子量38,000道尔顿、极限粘度1.21相比，其余三个平均分子量在14，000—16,000道尔顿范围内，极限粘度也是在0.44—0.68之间，证明来自鸡冠的DS具有不同的性质。另外，关于牛、猪肠来源的DS的平均分子量，有报道为25,000(Thromb.Res.71，417—422，1993)或35,700(Blood 74，1577—1582，1989)，而用本发明者的方法，如表1所示，分别为16,000道尔顿和18,500道尔顿。表1各种硫酸皮肤素的物性硫酸皮肤素 牛肠 猪肠 猪皮肤 鸡冠平均分子量 16,00018,50014,000 38,000极限粘度(100mL/g) 0.68 0.58 0.441.21二糖组成(％)ΔDi—OS0.69 0.69 0.344.97ΔDi—6S2.52 4.85 0.854.41δDi—4S87.22 83.83 90.22 82.91ΔDi—diSD 0.16 0.51 0.220.92ΔDi—diSB 7.65 6.31 8.386.13ΔDi—diSE 1.58 3.59 0.000.65ΔDi—triS 0.18 0.24 0.000.00
表示二糖组成的简略符号参见表2。
表2 R1R2R3ΔDi-OSH H HΔDi-6SSO3- H HΔDi-4SH SO3- HΔDi-diSD SO3- H SO3-ΔDi-diSE SO3- SO3- HΔDi-diSB H SO3- SO3-ΔDi-triS SO3- SO3- SO3-下面列举具体的实例，进行发明的详述。
参考例4DS中Hep或HS的定量1)实验方法DS中Hep或HS的定量按如下三种方法进行。
a)酶消化法下面三种酶只消化Hep或HS，而不消化DS(新生物化学实验讲座3，糖类II，p.244—249)。利用这一性质进行测定。即、在参考例1或参考例2所得DS500μg中，加入溶于20mM Tris—HCl缓冲液、10mM CaCl2(pH7.0)10μl的三种酶—肝素酶I 20mU、肝素酶II20mU和肝素酶IV50mU，于37℃反应2小时，在与测平均分子量同样的条件下，对消化产物作HPLC分析，于230nm处定量检测生成的不饱和二糖。
b)由Hep或HS的抗凝血酶III激活作用产生活性型第X因子阻断作用的测定方法。
Hep或HS具有激活抗凝血酶III，阻断凝血因子之一的第X因子的活性型(Xa)的作用(如下称作抗Xa作用)与此相反，DS无此作用(Tollfsen，In″Heparin″，PP.257—273.EdsDavid A.Laneand Uif Lindahl，Edward Arnold，London 1989)。利用这种性质，用各种浓度的Hep，测定抗Xa活性，求得阻断活性与Hep用量的剂量依赖性范围，再求得产生最大阻断的Hep的最少用量，以这时的阻断率为100％，在无Hep的情况下，只有抗凝酶III时的阻断率为0％，将此关系作图，得到标准曲线。用本发明的DS样品作同样的测定，比照标准曲线，从所得的抗Xa活性换算成Hep或HS，从而进行定量。
具体操作如下。将50mM Tris—HCl缓冲液(pH8.0)、150mMNaCl、10mm CaCl20.3ml，抗凝血酶III(来源于牛，シゲマ社制)(1U/ml)0.1ml，0.03—2μg/ml Hep(来自牛肠，シンテックス社制)或50—100μg/ml的上述除去Hep或HS的DS样品0.1ml于4℃下混合后，37℃保温2分钟。然后加入0.1ml Xa(7.1nkat/ml，来自牛，クロモジェニックスAB社制，生化学工业销售)，于37℃反应5分钟后，加入合成基质Boc—ILe—Glu—Gly—Arg—MCA(code3094V，ペプド研)100μM 0.1ml，37℃反应3分钟。加入30％乙酸0.3ml以停止反应，再加入上述缓冲液与30％乙酸按7∶3比率混合的液体1ml作为测定试剂。用荧光光度计(日本分光FP-777)进行测定。激发波长350nm，荧光波长444nm。还在此测定条件下，确认了在不存在Hep或HS时抗凝血酶III自身的抗Xa活性完全可以忽略。阻断率的计算按下式进行。 A有Hep或DS的样品的测定值B按上述操作，不加抗凝血酶III、Hep或DS及Xa，代之以缓冲液时的测定值。
C按上述操作，仅不加抗凝血酶III，代之以缓冲液时的测定值C)由Hep或HS的抗凝血酶III激活作用产生的活性型第II因子阻断作用的测定方法Hep或HS具有激活抗凝血酶III、阻断凝血因子之一的第II因子的活性型(IIa)的作用、即抗凝血酶作用(以下称作抗IIa作用)，与此相反，DS无此作用(Tollfsen，In″Heparin″，pp.257—273.EdsDavid A.Lane and Ulf Lindahl，Edward Arnold，London1989)。利用这种性质，用各种浓度的Hep，测定抗IIa活性，求得阻断活性与Hep用量的剂量依赖性的范围，再求得产生最大阻断的Hep的最少用量，以这时的阻断率为100％，在无Hep的情况下，只有抗凝酶III时的阻断率为0％，将此关系作图，得到标准曲线。用本发明的DS样品作同样的测定，比照标准曲线，从所得的抗IIa活性换算成Hep或HS，从而进行定量。
具体操作如下。将20mM Tris—HCl缓冲液(pH7.4)、150mMNaCl、10mM CaCl2、0.1％中血清白蛋白0.35ml，抗凝血酶III(来自牛，シゲマ社制)(1U/ml)0.1ml，0.3—20μg/ml的Hep(来自牛肠，シンテックス社制)或50—100μg/ml的上述除去Hep或HS的DS0.1ml于4℃混合后，37℃保温2分钟。然后，加入IIa(50mU/ml，来自牛，ベ—リンガ—社制)0.05ml，37℃反应5分钟后，加入合成基质Boc-Val-Pro-Arg-MCA(code 3093 V，ペプチド研)(70μM)0.1ml，37℃反应3分钟。加入30％乙酸0.3ml以停止反应，再加入上述缓冲液与30％乙酸按7∶3比率混合的液体1ml作为测定试剂。用荧光光度计(日本分光FP-777)进行测定。激发波长350nm，荧光波长444nm。还在此测定条件下，确认了在不存在Hep或HS时抗凝血酶III自身的抗IIa活性完全可以忽略。阻断率的计算按下式进行。
A有Hep或DS的样品的测定值B按上述操作，不加抗凝血酶III、Hep或DS及IIa，代之以缓冲液时的测定值。
C按上述操作，仅不加抗凝血酶III，代之以缓冲液时的测定值2)结果上述三种方法所得结果列于表3。
表3ND未测定*参考例1(2)的1)中记载的用离子交换色谱法除去Hep或HS的样品实施例1RCDS、RIDS和RCDS-H(—)、BIDS-H(—)投与大鼠后血中持续时间的差异的研究(1)实验方法动物采用6.5—7.5周龄的SD(Sp
rague—Dawley)系雄性大鼠(チャ—ルスリ—バ—)。受试药采用RCDS、BIDS和RCDS-H(—)、RIDS-H(—)四种。将大鼠乙醚麻醉后，以10mg/kg剂量尾静脉注射各受试药。给药5分钟和120分钟后，在乙醚麻醉下从腔静脉取血，按1/10用量使用3.2％枸橼酸抗凝，离心分离出血浆。按《新生物化学实验讲座3》(糖类II)p.175—179的方法测定血浆中的DS量。即，将血浆用PD-10R柱(Pharmacia)脱盐后冷却干燥，残渣经软骨素酶消化，用滤过分子量5000(cut)的膜超滤后，所得滤液用HPLC进行分析。
(2)结果结果以对应于0时间的百分率(残留率)在图1中表示。给药5分钟后DS的残留率为RCDS和RCDS-H(—)分别比BIDS和BIDS-H(—)高出约2倍。给药120分钟后，RCDS和RCDS-H(—)还残留10％，而BIDS基本不能检出。RCDS与RCDS-H(—)略有差别，后者的残留率在5分钟、120分钟时均较高。实施例2关于DS对血栓形成抑制的影响采用大鼠下腔静脉血栓模型进行研究。
(1)实验材料动物用6.5—7.5周龄的SD(Sprague—Dawley)系雄性大鼠(チャ—ルスリ—バ—)。DS用RCDS和BIDS两种。
(2)实验方法1)血栓模型的制备大鼠血栓模型按Reyers[Thromb.Res.18，669—674(1980)]的方法进行制备。即，大鼠在戊巴比妥钠nembutalR(ダィナポット社，大日本制药(株)销售)麻醉下剖腹，用外科用丝线(No.7，Φ0.48—0.56mm进荣医科)结扎下腔静脉的左肾静脉支。受试药用RCDS、BIDS，在结扎1分钟前以1、3、10mg/kg剂量尾静脉注射。对照组注射生理盐水。结扎3小时后，将大鼠在乙醚麻醉下剖腹，打开静脉取出血栓，于37℃放置一夜后，测干重。所得数据的统计处理用Newman—Keuls法。
(3)结果结果列于表3。相对于对照组干燥血栓重量的相对重量，两种DS在1mg/kg给药水平时均抑制为60％，而3mg/kg和10mg/kg以上剂量时，则RCDS使血栓重量分别降低至对照的2.4％和0.0％，而BIDS仅分别使之降低至34.1％和2.4％，表明RCDS的有用性。
表3用大鼠下腔静脉模型进行血栓形成抑制试验受试药用量 平均血栓干燥相对重量比(mg/kg)重量(mg)(％)生理盐水4.1±0.7100(对照)RCDS 1 2.5±0.961.03 0.1±0.1**2.410 0.0±0.0**0.0BIDS 1 2.6±0.663.43 1.4±0.8*34.110 0.1±0.1**2.4(与对照组相比*；P＜0.05，**；P＜0.01)对照组14例，DS二种给药组均6例，重复进行，取得平均值。
实施例3关于DS对血栓形成和血栓溶解的影响，用大鼠下腔静脉血栓模型进行研究。
(1)实验材料动物用6.5—7.5周龄的SD(Sprague—Dawley)系雄性大鼠(チャ—ルスリ—バ—)，DS用RCDS和BIDS两种。
(2)实验方法1)血栓模型的制备大鼠血栓模型采用与实施例2同样的操作，结扎下腔静脉。结扎后6小时，以0.5ml/kg(3、10、30mg/kg)剂量尾静脉注射受试药。对照组注射生理盐水。结扎后6小时(仅限于对照组)和注射受试药后2小时(结扎后8小时)，将大鼠在乙醚麻醉下剖腹，取血后，打开静脉，取出血栓，于37℃放置一夜后，测干重。所得数据的统计处理用Newman—Keuls法。
2)优球蛋白部分的制备将血浆0.5ml放入塑料试管中，加入用冰充分冷却的0.01N乙酸缓冲液(pH4.85)9.5ml，在冰箱中静置1小时，3000rpm离心分离5分钟后，得到优球蛋白部分。在此沉淀物中加入Tris—HCl缓冲液(pH7.4)0.5ml，将其溶解。
3)纤溶活性测定在纤维蛋白平板的试样孔中加入优球蛋白部分10μl，在培养箱中37℃放置18小时，测纤维蛋白溶解面积(直径的平方)。溶解面积的大小与血纤维蛋白溶酶活性的强度成比例。纤维数据的统计处理用Newman—Keuls法。
(3)结果结果列于表4。
表4的对照—6小时表示在静脉结扎6小时后麻醉下剖腹、采血、取出血栓的大鼠组，对照—8小时表示在静脉结扎后6小时注射生理盐水，再在2小时后采血、取出血栓的大鼠组。
1)对抑制血栓形成和溶解的影响虽然在各组均可见血栓，但如表4所示，各组间可见显著差异。RCDS和BIDS组与对照—8小时组相比，血栓重量均出现剂量依赖性的减少，而与对照—6小时组的血栓重量值比较，BIDS30mg/kg组和RCDS 10mg/kg以上组的血栓重量值小，从而确认它们不仅有抑制血栓形成而且有溶解血栓的作用。而RCDS比BIDS较少量即显示强的抑制血栓形成和溶解作用。
2)对纤溶系的影响将RCDS和BIDS各注射3mg/kg、10mg/kg和30mg/kg，测定2小时后(静脉结扎8小时后)血浆中纤维蛋白溶酶活性。结果见表4。在注射RCDS10mg/kg和BIDS30mg/kg以上时，血纤维蛋白溶酶活性比对照组有显著意义地提高。从本实验也证明RCDS的优异效果。
表4试样 剂量 干燥血栓重量纤溶活性(mg/kg) (％对照-8小时) FA1)(％对照-8小时)对照-6小时 — 70±9 未测定对照-8小时 — 100±11 100±4RCDS 373±9 110±510 56±12 165±10**30 54±11 204±15**BIDS 390±18 108±610 79±16 114±530 60±8 158±6**1)纤维蛋白溶解面积。与对照-8小时相比**P＜0.01血栓重量是以对照-8小时组为100％、用相对比率求出。对照-8小时组16例，其他组各8—9例进行实验，分别得到平均值。
实施例4
在内毒素诱发大鼠DIC模型上DS的抗血栓效果比较试验(1)实验方法动物采用5.5—6.5周龄SD(Sprague—Dawley)系雄性大鼠(チャ—ルスリ—バ—)。给大鼠腹腔注射戊巴比妥钠nembutalR麻醉后，切开左侧大腿部，将聚乙烯导管(PE-10，IMAMURA)从该部位向离腹腔静脉4cm处逆行插入并固定。大鼠清醒后，通过装在输液泵(Model—22M，HARVARD)上的注射器以3.75mg/kg/小时的比例连续注入内毒素(大肠杆菌0.55∶B5，Difeo公司)4小时。与此同时，将受试药[用RCDS—H(—)和BIDS-H(—)]经右侧静脉导管连续输入4小时。将与各输入液量相当的生理盐水输入4小时的大鼠作为正常组。
(2)检查项目注完内毒素后，取血液和肾脏，测定以下项目。
1)血小板数用自动血球计数器(Celltac MEK—4500日本电工)测定血液中的血小板数目。
2)纤维蛋白原分离血浆，用纤维蛋白原测定用试剂(サン ァッセイFibR，销售三光纯药，制造日东纺织)测定。
3)纤维蛋白原—纤维蛋白分解产物(FDP)分离血清，用FDP测定用乳胶试剂(FPDLR试验，帝国脏器制药(株)制售)进行测定。
4)肾小球体纤维蛋白沉着率(％GFD)用10％中性缓冲甲醛溶液固定肾脏，石蜡包埋，切片后，进行磷钨酸—苏木精染色。用显微镜观察肾标本全视野的肾小球体，将可见纤维蛋白沉着的肾小球数以百分率表示。数据处理用Newman－Kleus法。
(3)结果结果列于表5。正常组血小板75×104μl，纤维蛋白原216mg/dl，FDP 2.5μg/ml以下，未检出％GFD，而内毒素诱发DIC的大鼠组分别为4×104μl、35mg/dl、34.3μg/ml、61％，显示为异常值。
注射DS-H(—)组中，这些数值均得到改善，而RCDS-H(—)的各个项目均超过BIDS-H(—)引起的改善，特别是在成为肾功能不全原因的％GFD方面，RCDS-H(—)使其降至1％，改善显著，而BIDS-H(—)停留于16.1％，表明RCDS-H(—)的有用性。
表5在内毒素诱发大鼠DIC模型上DS抗血栓效果的比较试验给药量血小板纤维蛋白原 FDP ％GFD(mg/kg/小时) (×104μL) (mg/dL) (μg/mL)正常 75±1 216±5 ＜2.50.0对照(仅LPS&) 14±1 35±3 34.3±2.560.7±5.3RCDS＋LPS 5.0 22±3 120±6*4.6±0.4*1.2±0.7*BIDS-H(-)＋LPS 5.0 18±3 107±10*8.6±2.6*16.1±5.5*(a内毒素*与对照相比 ＜P0.01)正常组19例、对照组20例、DS组各7例，进行实验，求得平均值。
实施例5DS对t-PA的Glu-血纤维蛋白溶酶原(天然的血纤维蛋白溶酶原，以下只称作血纤维蛋白溶酶原)激活反应的促进效果(1)实验方法将各种浓度的DS(BIDS、RCDS)或硫酸软骨素(对照)50μl、1.6μM血纤维蛋白溶酶原25μl、20nM的单链或双链t-PA25μl，及0.6mM的合成底物S-2251(H-D-Val-L-Leu-L-Lys-对硝基苯胺·二盐酸盐100μl混合后，加在自动微量滴定板读取机上，每2分钟测定405nm的吸收值。反应于37℃下进行，将上述混合液溶于含吐温R80的50mM Tris—HCl缓冲液后使用。
血纤维蛋白溶酶原激活的初速度是将时间t时405nm的吸收值A405与时间平方的曲线斜率(ΔA405/Δt2)用40,000除而得到(Chibber，B.A.K.et a1.，Biochemistry，1985，3429—3434)，促进率是将无DS和硫酸软骨素时的初速度作为1，以与其相对比表示。
(2)结果图2和图3表示BIDS的结果。如这些图所示，DS剂量依赖性地促进血纤维蛋白溶酶原的激活，分别在单链t-PA(sc-tPA)时为1.5—4.5倍，在双链t—PA时为1.5—3.5倍。与DS相比，作为对照用的硫酸软骨素在单链t-PA存在下最大2.5倍，在双链t-PA存在下最大为1.5倍，与DS相比，其促进率弱。图4与图5表示RCDS的结果。RCDS也分别在单链t-PA(sc—tPA)时2.0—4.5倍，在双链t-PA(tc-tPA)时2.0—4.0倍地促进血纤维蛋白溶酶原的激活。
实施例6(1)试验方法就DS对大鼠纤溶系统的影响进行了研究。
在以戊巴比妥钠SomnopentylR(共立商事)麻醉的9—11周龄Wistar系雄性大鼠背部皮下注射DS(BIDS)40mg/kg后，1、6、12，24小时后取血，枸橼酸抗凝。以与实施例3同样的操作，从血浆制备优球蛋白部分，用血纤维蛋白平板法评价纤溶活性。所得数据的统计处理采用Newman—Kleus法。
同时测定血浆，优球蛋白部分中的DS量[《新生物化学实验讲座3》(糖类II)，p175—179]。用生理盐水作对照。考虑到大鼠凝血纤溶活性在一天内存在变动，这些实验均在相同时间进行。
(2)结果所得结果列于表6和表7。
如表6所示，DS在给药后1.2小时内显示纤溶活性。如表7所示，血浆中的DS的约70—80％存在于优球蛋白部分，证明优球蛋白部分是显示纤溶活性的部分。RCDS也得到同样的结果。
表6用血纤维蛋白平板法测定纤溶活性给药时间药剂6小时12小时 24小时对照 57.4±3.654.1±3.942.3±4.6DS85.3±8.4*71.9±3.546.1±3.71)血纤维蛋白溶解面积(mm2)，与对照相比p＜0.01对照组、DS组各4—5例，进行重复实验，求其平均值。
表7血浆和优球蛋白部分中的DS(μg/ml)部分 给药后时间1小时6小时 12小时24小时血浆 3.62±0.61 3.58±0.272.20±0.260.47±0.04优球蛋白 2.51±0.62 2.80±0.271.60±0.16未测定对照 0.03±0.02对照组与DS组各4—5例，进行重复实验，求其平均值。
实施例7关于DS对人血浆块的促进溶解效果的研究(1)实验方法在96孔微量板上加入各种浓度的DS(BIDS)40μl(最终浓度50.0—200μg/ml)、单链t-PA(最终浓度166.7U)20μl、凝血酶40μl(最终浓度20U/ml)和人血浆100μl，混合，然后立即和其后每10分钟测定波长340nm处的吸光度，直至侧得吸光度变成最小值(Min)。纤溶活性使用最大吸光度(Max)与Min之和被2除所得的PLT1/2(分)，以加DS时的值DS-PLT 1/2与对照的Cont—PLT1/2之比表示。
(2)结果结果见图6。如图6所示，DS具有剂量依赖性地促进血浆块溶解的活性。RCDS也得到同样的结果。
实施例8硫酸皮肤素给小鼠单次静脉注射的毒性试验(1)实验方法动物采用5周龄雌雄Crj；CD—1小鼠(日本チャ—ルス·リバ—公司)。用无菌蒸馏水和无菌生理盐水将RCDS-H(—)和BIDH-H(—)溶液分别配制成等渗溶液，用玻璃注射器从小鼠尾静脉分别单次注射2000mg/kg，观察14日。
(2)结果如表8所示，这两种DS中任何一种在2000mg/kg的高剂量下均未见死亡例，可推断在本试验条件下致死量在2000mg/kg以上。表8静脉注射量死亡数/使用动物数受试物质(mg/kg) 雄 雌RCDS—H 2000 0/5 0/5BIDS—H(—) 2000 0/5 0/5实施例9制剂(1)将参考例1所得的鸡冠DS钠盐(RCDS或RCDS-H(—))500—5000mg进行无菌处理，加入适量无菌生理盐水和无菌蒸馏水，配制成100ml等渗液，在每一安瓿中注入10ml，用于血管注射、皮下注射或肌肉注射。
(2)将参考例1所得的鸡冠DS钠盐(RCDS或RCDS-H(—))250mg和t-PA 1,000,000 I.U.分别包装，配制成使用时溶于溶解液中使用的用时溶解型注射用剂，用于冠脉注射或静脉内注射。
产业上利用的可能性硫酸皮肤素或其药理学上容许的盐激活纤溶活性，可用作血栓溶解促进剂。
将其与组织血纤维蛋白溶酶原激活剂合用时，溶解血栓的作用显著提高，可减少组织血纤维蛋白溶酶原激活剂的用量。
使用本发明的特定的硫酸皮肤素，即极限粘度为0.8 100ml/g以上的硫酸皮肤素，或从鸡冠而来的硫酸皮肤素，或构成二糖的组成中ΔDi-OS为2％—7％或用下面的测定法(Biochim.Biophys，Ac-ta，1117，60—70，1992记载的凝胶滤法)得到的平均分子量为2.5万道尔顿—10万道尔顿的硫酸皮肤素，或特别是上述硫酸皮肤素中那些肝素或硫酸乙酰肝素含量极低的特定的硫酸皮肤素或其药理学上容许的盐，有效血浓度维持时间长，显示预防血栓发展、抑制血栓生长等效果。
从而，本发明的抗血栓剂对心肌梗塞，弥漫性血管内凝血综合征、伴多发性血栓的多脏器功能不全、深部静脉血栓症等的治疗或预防是有用的。另外，在肾透析等体外循环时使用，可防止血液的凝固。而且，DS与Hep相比，出血等副作用少，特别是从DS中除去Hep的DS-H(—)，由于出血等副作用更小，安全性提高，因而对有出血倾向的血小板和凝血因子下降的患者更为有用。
权利要求
1.硫酸皮肤素及其盐，其特征在于按照使用乌伯娄德型粘度管的测定法、用0.2M氯化钠为溶剂、于30±0.1℃测得的极限粘度为0.8 100ml/g以上。
2.如权利要求1所述的硫酸皮肤及其盐，其极限粘度为0.9—2.0 100ml/g。
3.如权利要求1所述的硫酸皮肤素及其盐，其来源为鸡冠。
4.如权利要求1所述的硫酸皮肤素及其盐，其特征还在于用酶分解和高速液相色谱法测得二糖组成中ΔDi—OS为2％以上，7％以下。
5.如权利要求1所述的硫酸皮肤素及其盐，其特征在于还在于用Biochim.Biophys.Acta，1117，60—70，1992记载的凝胶过滤法测得平均分子量为2.5万道尔顿以上，10万道尔顿以下。
6.如权利要求1所述的硫酸皮肤素及其盐，其特征还在于用肝素或硫酸乙酰肝素分解酶和高速液相色谱测定法测得的肝素或硫酸乙酰肝素的含量在0.15％以下，用在抗凝血酶III存在下测定活性型第X因子的阻断作用的方法，以来自牛肠的肝素为标准物质，测得的肝素或硫酸乙酰肝素的含量在0.07％以下，或用在抗凝血酶III存在下测定活性型第II因子的阻断作用的方法，以来自牛肠的肝素为标准物质，测得的肝素或硫酸乙酰肝素的含量在0.05％以下。
7.以硫酸皮肤素或其药理学上容许的盐为有效成份的抗血栓剂。
8.以来自鸡冠的硫酸皮肤素或其药理学上容许的盐为有效成份的抗血栓剂。
9.抗血栓剂，其特征在于其有效成份为用酶分解和高速液相色谱法测得构成二糖的组成中含ΔDi—OS 2％以上、7％以下的硫酸皮肤素或其药理学上容许的盐。
10.抗血栓剂，其特征在于其有效成分为用Biochim.Biophys.Acta，1117，60—70，1992记载的凝胶过滤法测得的平均分子量为2.5万道尔顿以上、10万道尔顿以下的硫酸皮肤素或其药理学上容许的盐。
11.抗血栓剂，其特征在于其有效成份为按使用乌伯娄德型粘度管的测定法、用0.2M氯化钠为溶剂、于30±0.1℃测得的极限粘度为0.8 100ml/g以上的硫酸皮肤素或其药理学上容许的盐。
12.如权利要求1所述的抗血栓剂，其中有效成分为极限粘度为0.9—2.0 100ml/g的硫酸皮肤素或其药理学上容许的盐。
13.抗血栓剂，其特征在于其有效成份为权利要求7—12之一的硫酸皮肤素或其药理学上容许的盐，其中用肝素或硫酸乙酰肝素分解酶和高速液相色谱测定法测得的肝素或硫酸乙酰肝素的含量在0.15％以下，用在抗凝血酶III存在下测定活性型第X因子的阻断作用的方法，以来自牛肠的肝素为标准物质，测得的肝素或硫酸乙酰肝素的含量在0.07％以下，或用在抗凝血酶III存在下测定活性型第II因子的阻断作用的方法，以来自牛肠的肝素为标准物质，测得的肝素或硫酸乙酰肝素的含量在0.05％以下。
14.各种血栓症的预防或治疗方法，其特征在于对有血栓形成可能性者、血栓正在形成者或已经形成者投与硫酸皮肤素或其药理学上容许的盐。
15.如权利要求14所述的血栓症的预防或治疗方法，其中硫酸皮肤素为权利要求1—6之一所述的硫酸皮肤素。
16.如权利要求14或15所述的预防或治疗方法，投与对象为因血小板数目降低、凝血因子低下等有出血倾向者、有血栓形成可能性者、血栓正在形成者或已形成者。
17.弥漫性血管内凝血综合征的预防或治疗方法，其特征在于对有弥漫性血管内凝血综合征发病可能性者、正在发病者或已发病者投与硫酸皮肤素或其药理学上容许的盐。
18.如权利要求16所述的预防或治疗方法，其中硫酸皮肤素为权利要求1—6之一所述的硫酸皮肤素。
19.由组织血纤维蛋白溶酶原激活剂与硫酸皮肪素或其药理学上容许的盐组成的抗血栓剂。
20.如权利要求19所述的抗血栓剂，其中硫酸皮肤素或其药理下上容许的盐为来自鸡冠的硫酸皮肤素或其药理学上容许的盐。
21.如权利要求19所述的抗血栓剂，其中硫酸皮肤素或其药理学上容许的盐为用酶分解和高速液相色谱测定法测得的构成二糖的组成中含ΔDi—OS 2％以上、7％以下的硫酸皮肤素或其药理学上容许的盐。
22.如权利要求19所述的抗血栓剂，其中硫酸皮肤素或其药理学上容许的盐为用Biochim.Biophys.Acta，1117，60—70，1992记载的凝胶过滤法测得平均分子量为2.5万道尔顿以上、10万道尔顿以下的硫酸皮肤素或其药理学上容许的盐。
23.如权利要求19所述的抗血栓剂，其中硫酸皮肤素或其药理学上容许的盐按使用乌伯娄德型粘度管的测定法、用0.2m氯化钠为溶剂、于30±0.1℃测得的极限粘度为0.8 100ml/g以上。
24.如权利要求23所述的抗血栓剂，其中硫酸皮肤素或其药理学上容许的盐的极限粘度为0.9—2.0 100ml/g。
25.如权利要求19—24之一所述的抗血栓剂，其中用肝素或硫酸乙酰肝素分解酶和高速液相色谱测定法测得的肝素或硫酸乙酰肝素的含量在0.15％以下，用在抗凝血酶III存在下测定活性型第X因子的阻断作用的方法，以来自牛肠的肝素为标准物质，测得的肝素或硫酸乙酰肝素的含量在0.07％以下，或用在抗凝血酶III存在下测定活性型第II因子的阻断作用的方法，以来自牛肠的肝素为标准物质，测得的肝素或硫酸乙酰肝素的含量在0.05％以下。
26.心肌梗塞的治疗方法，其特征在于对心肌梗塞发病者投与组织血纤维蛋白溶酶原激活物与硫酸皮肤素或其药理学上容许的盐。
27.如权利要求26的治疗方法，其中硫酸皮肤素为权利要求1—6之一所述的硫酸皮肤素。
全文摘要
本发明提供以硫酸皮肤素或其药理学上容许的盐(DS)为有效成分的抗血栓剂。使用来自鸡冠、构成其二糖组成中ΔDi-OS为3％以上、分子量2.5万以上的DS时，有效血浓度维持时间长，可有效预防血栓发展。DS与组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(t-PA)合用时，显著提高血栓的溶解，可减少t-PA的用量。本发明的产品可用于心肌梗塞、弥漫性血管内凝血综合症等各种血栓症的治疗和预防和肾透析等体外循环时防止血液凝固。
文档编号C08B37/00GK1115182SQ94190743
公开日1996年1月17日 申请日期1994年9月30日 优先权日1993年9月30日
发明者高田明和, 女屋纯一, 荒井幹雄, 宫内聪, 京ク岛守, 吉田圭一 申请人:生化学工业株式会社