专利名称：毛葡萄及其提取物在制备抗血栓药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及毛葡萄提取物在制备抗血栓药物中的应用。
背景技术：
据最新调查显示，全球每年约有850万人患上由心、脑血管血栓而引的心、 脑血管疾病，其中约有160万因此引发严重心、脑血管病，150万人因此引发 脑卒中。目前抗血栓药主要有抗凝剂、抗血小板及溶栓药，其中主要以西药为主， 中成药主要是丹参制剂。以上这些药品对血栓病人起了一定作用，但大多数疗 效不很理想，另外存在一定的副作用，因此从中草药中提取具有抗血栓作用的 天然药物越来越受到重视。分布于西南及陕西、甘肃、江苏、安徽、浙江、江西、台湾、湖北、广西 等地的毛葡萄(Vitis quinquangularis Rehd),木质藤本，长达8m。幼枝、叶 柄和花序轴密生白色或褐色蛛丝状柔毛，老枝紫红色。单叶互生；叶柄长 3-7cm;叶片卵形或五角状卵形，不分裂或具不明显的3-5角棱以至3-5裂， 长8-15cm，宽6-10cm，先端急尖，基部近截形或浅心形，边缘有微波状牙齿， 上面绿色，初被柔毛，后变无毛，下面密被灰白色或灰棕色绒毛。花杂性异株， 圆锥花序长8-llcm，稀达16cm，与叶对生，分枝近平展；花小，淡黄绿色， 具细梗，无毛；花萼不明显；花瓣5，长约1.8mm，先端粘合成帽状脱落；雄 蕊5-6,与花瓣对生；子房埋于花盘中。浆果球形，熟时黑紫色，直径6-8mm。 种子三角形，长约4mm，背部扁圆，腹部有两角棱。花期5-6月，果期7-9 月。毛葡萄的根皮和叶可被用于药，根皮能调经活血、舒筋活络，主治月经不 调、白带，外用治跌打损伤、筋骨疼痛，叶能止血，用于外伤出血。现有的文献资料中并未发现毛葡萄及其提取物具有抗血栓的作用，也并未 发现毛葡萄及其提取物可以用于制备抗血栓药物。发明内容本发明的目的在于提供毛葡萄及其提取物的新用途，即在制备预防和治疗 心脑血管血栓的药物中的应用。为达到上述目的，本发明采取的技术方案为毛葡萄的提取物在制备预防 和治疗心脑血管血栓的药物中的应用。毛葡萄的不同部位其提取物的成分和比例是不同的，例如其叶子中黄酮的 相对含量大于其根茎中黄酮的含量，优选的技术方案中，所述毛葡萄的提取物 是以毛葡萄的叶子为原料提取工艺中采用的溶剂和提取方法也会影响提取的效率和所获得提取物 的组成，本发明中以水、低级醇、低级酮或乙酸乙酯中的一种或者一种以上的组合作溶剂对毛葡萄进行提取；提取方法可以采用浸泡提取、回流提取、超声 提取、逆流提取、超临界萃取中的一种。最终获得的所述毛葡萄提取物中主要含蛋白质、氨基酸、多糖、皂苷、无 机营养元素、酚类化合物和/或黄酮。在预防和治疗心、脑血管血栓时，毛葡萄用量按体重计算，其用量是提取 物0.05-3000mg/kg/日；优选剂量为0.05-1000mg/kg/日；由于不同个体之间 存在差异，本发明提取物的用量不限于所述范围。本发明所述毛葡萄提取物可以制备预防和治疗心、脑血管血栓的药物组合 物，该药品用于预防心、脑血管血栓的形成制备抗血栓药物时，可用药用载 体混合，也可以另外加入各种矿物质，优选体内不足的元素和微量必需元素的 矿物质也可以加入其它药品、天然药物、氨基酸或维生素。所包括的药品、 天然药物、氨基酸或维生素没有特殊的限制，如阿斯匹林、丹参、水蛭、银 杏、红花、当归、谷氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、维生素B6维生素B1、维生素C、 维生素E等。由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点1. 毛葡萄属常见中草药，而且从实施例中的毒性实验可知，本发明所述的 毛葡萄提取物可用于制备抗血栓药物，具有显著疗效且无毒副作用；2. 毛葡萄属来源广泛，本发明所述提取方法工艺简单，因此相对人工合成抗血栓药物而言，本发明更加经济、工艺更简单，同时绿色环保。
附图l实施例3中大鼠血栓形成的H-E染色图(A.对照组，B.丹参组)； 附图2实施例3中大鼠血栓形成的H-E染色图(A.大剂量药物组，B.中剂量药物组，C.小剂量药物组)； 附图3实施例6中大鼠脑栓塞的TTC染色图(A. 对照组，B.丹参组，C.大剂量药物组，D.中剂量药物组，E.小 剂量药物组)。
具体实施方式
下面结合附图1 3及实施例对本发明作进一步描述 实施例1,制备毛葡萄提取物制备方法1:取500克干毛葡萄(Vitis quinquangularis Rehd)叶(来源 江西，苏州大学生药研究所鉴定)，浸泡于水中，加热提取3次，每次45分钟， 合并提取液用蒸发浓縮至至1000亳升，再用终浓度为50%乙醇沉去杂质，过 滤后用旋转蒸发除去乙醇，浓縮后的溶液经冷冻干燥后得到粉末状提取物150 克(代号为KXSH-T1), 回收率30%，经测定含黄酮25%还含有酚类、 氨基酸、多糖。制备方法2:取500克干毛葡萄(Vitis quinquangularis Rehd)叶(来源 江西，苏州大学生药研究所鉴定)，浸泡于70%乙醇中，用回流提取方法提取 3次，每次40分钟，合并提取液过滤后用旋转蒸发除去乙醇，浓缩后的溶液 经冷冻干燥后得到粉末状提取物125克(代号为KXSH-T2)，回收率25%, 经测定含黄酮30%还含有酚类、氨基酸、多糖。制备方法3:取300克干毛葡萄(Vitis quinquangularis Rehd)叶(来源 江西，苏州大学生药研究所鉴定)，浸泡于50%丙酮中，用回流提取方法提取 2次，每次40分钟，合并提取液过滤后蒸发除去丙酮，浓縮后的溶液经干燥 后得到提取物75克(代号为KXSH-T3), 回收率25%,经测定含黄酮54.29%。还含有酚类、氨基酸、多糖。 实施例2，毒性实验用昆明小鼠40只(苏州大学动物实验中心提供)，雌雄各半；18-20g,分 对照组20只(雌雄各半)，中药组20只(雌雄各半)，分养。实验组24小时 内给药3次，每8小时灌胃l次；给予KXSH-T1每次按0.12g/10g体重灌胃， 总剂量为0.36g/10g体重，相当于正量的230倍。对照组灌生理盐水，每次 灌胃体积与实验组相等。灌胃后存活14天，每天观察两组小鼠的生活状态， 大小便情况，以及体重变化。观察结果实验组和对照组均未发现动物死亡，两组的生活状态和大、小 便均正常，两组之间没有发现明显差别，体重计算如下灌胃前实验组平均为 17.38g，对照组为17.7g; 灌胃两周后，实验组平均为24.64g，对照组为 24.8g;急毒实验表明，毛葡萄叶提取液在正常用量的230倍没有发现任何毒 性反应，该药安全可靠。实施例3血栓模型(动静脉旁路模型)先准备好一根塑料管(直径为0.3 mm)两 端拉细，管中放置一根6cm的4号线，并灌满50U/ml肝素。手术分离右侧 的颈总动脉和左侧的颈外静脉。静脉端先结扎静脉远心端，剪开一个小口，将 管向近心端插入并结扎固定。动脉端先用血管夹夹住近心端，剪开一个小口， 将管向近心端插入并结扎固定。然后放开血管夹，血流应通畅，计时20分后 将线取出。分别称量线的湿重和干重，将形成的血栓固定、切片、HE染色， 观察血栓。腹主动脉取血，离心，取血清，-20lC保存待测TXB2和6-keto-PGF-2a含量。实验分组及过程SD大鼠50只，雌雄各半，约250g/只，分对照组10 只，中药大、中、小剂量组(KXSH-T1)和阳性对照组(丹参)，各组动物分养。 大剂量药物组每天灌中药4ml (lg/kg体重)；中剂量药物组每天灌中药4ml (0.5g/kg体重)小剂量药物组每天灌中药4ml (0.25g/kg体重)；对照组灌 生理盐水4ml/只；阳性对照组丹参(70mg/kg体重)。连续灌胃9天；第十天 于灌胃1小时后按血栓模型过程行动静脉旁路手术。实验结果血栓湿重对照组平均为48.60土5.38mg ,丹参组平均为43.1 土4.01mg; 药物小剂量组42.1士5.42mg;药物中剂量组41.0士4.08mg;药物大剂量组 29.3士6.07mg;血栓干重对照组平均为14.10土1.73mg ，丹参组平均为13.0土1.15mg; 药物小剂量组12.4土1.35mg;药物中剂量组12.4士0.97mg;药物大剂量组 9.6士1.26mg;TXB2含量测定结果对照组平均为295±88 pg/ml, 丹参组平均为277±63 pg/ml;药物小剂 量组268±29 pg/ml;药物中剂量组218±8 pg/ml 6:药物大剂量组258 ±90 pg/ml;6-keto-PGF-2a含量测定结果对照组平均为81.4±27pg/ml，丹参组平均为118±20 pg/ml;药物小剂量 组103±18pg/ml;药物中剂量组125±34pg/ml:药物大剂量组103±14 pg/ml;血栓H-E染色在显微镜下对照组和实验组均是混合型血栓(红细胞、 血小板和白细胞组成)，但对照组血小板形成的血栓和血栓中白细胞数比实验 组明显多，特别中剂药物组血小板形成的结构和白细胞数明显少，表明该药有 明显抑制血小板和白细胞聚集作用，见附图l-2。实施例4将大鼠分为4组1、空白对照组每天自来水灌胃5ml/只，连续7天。 第7天停食，次晨取血检测。2、血瘀模型对照组每天自来水灌胃5ml/只， 连续7天，于第7天皮下注射肾上腺素0.08ml/100g体重共2次，两次间隔4 小时。在两次注射肾上腺素之间将大鼠浸入冰水内5分钟。处置后停食，次晨 取血检测。3和4为药物组共分二组，第3组5ml(lg/kg体重)KXSH-T1灌 胃，第4组5ml(70mg/kg体重)丹参灌胃，连续7天，于第7天皮下注射肾上 腺素0.08ml/100g体重共2次，两次间隔4小时。在两次注射肾上腺素之间将 大鼠浸入冰水内5分钟。处置后停食，次晨取血检测。从腹主动脉抽血，用于血粘度测定每动物抽2ml枸橼酸钠抗凝(1: 9), 用血粘度仪测定；用于血小板凝聚实验的每动物抽3ml枸橼酸钠抗凝(1: 9，， 500转/分钟，离心l分钟，取上清(橙黄色，富血小板血浆PRP)做血小板 凝集试验，后再2500转每分钟，离心10分钟，取上清(乏血小板血浆PPP) 用做仪器调零，用多功能机能血液凝聚仪检测血小板凝集。结果血粘度空白对照组平均为6.6cP;血瘀模型对照组为6.9cP;丹参组为 5.70cP;毛葡萄叶提取液组为4.13cP。血小板凝聚实验(PAGT)结果空白对照组PAG平均为34.1:血瘀模 型对照组为51.3;丹参组为29.5;毛葡萄叶提取液组为13.6 。结果表明毛葡萄提取物有明显降低血粘度和血小板凝聚作用。实施例5血栓模型(动静脉旁路模型)先准备好一根塑料管(直径为0.3 mm)两 端拉细，管中放置一根6cm的4号线，并灌满50U/ml肝素。手术分离右侧 的颈总动脉和左侧的颈外静脉。静脉端先结扎静脉远心端，剪开一个小口，将 管向近心端插入并结扎固定。动脉端先用血管夹夹住近心端，剪开一个小口， 将管向近心端插入并结扎固定。然后放开血管夹，血流应通畅，计时20分后 将线取出。分别称量线的重量。实验分组及过程SD大鼠50只，雌雄各半，约250g/只，分对照组10 只，中药大、中、小剂量组(KXSH-T2)和两个阳性对照组(丹参和奥地心血康)， 各组动物分养。大剂量药物组每天灌中药4ml(lg/kg体重)；中剂量药物组每 天灌中药4ml(0.5g/kg体重)小剂量药物组每天灌中药4ml(0.25g/kg体重)； 对照组灌生理盐水4ml/只；阳性对照组丹参(70mg/kg体重)；阳性对照奥地 心血康(60mg/kg体重)。连续灌胃7天；第8天于灌胃1小时后按血栓模型 过程行动静脉旁路手术。实验结果血栓湿重对照组平均为25.08土3.02mg;丹参组平均为25.1 土4.47mg; 药物小剂量组24.03土2.69mg;药物中剂量组20.02±3.73mg;药物大剂量组17.33土3.47mg;奥地心血康组平均为21.73 ± 4.24mg; 该实验表明该药有明显抑制血栓形成作用。实施例6取健康雌性SD大鼠50只，体重250克左右.随机分为五组取KXSH-T3 做实验:大剂量药组(lg/kg体重)；中剂量药物组(0.5g/kg体重)；小剂量药 物组(0.25g/kg体重)；对照组灌生理盐水4ml/只；阳性对照组丹参(70mg/kg 体重)。连续灌胃7天后作脑栓塞模型，从颈总动脉插入直径为0.2mm的尼 龙线至颈内动脉，从颈内、外动脉分叉处计算约18 mm,然后固定并结扎颈 总动脉。存活24小时后取脑作TTC染色，用医学图像分析仪计算梗死面积。 见附图3统计结果如下大剂量组梗死面积占5.82%;中剂组点3.72%;小剂量组 点6.87%;阳性对照丹参组点10.51%;模型(对照)组点9.29%。 结果表明KXSH-T3抗血栓药有明显的抗脑血栓形成作用。
权利要求
1.一种中草药提取物，其特征在于所述中草药提取物为毛葡萄提取物，以水、低级醇、低级酮和乙酸乙酯中的一种或者一种以上的组合作为溶剂，采用浸泡提取法、回流提取法、超声提取法、逆流提取法或超临界萃取法中的一种，对毛葡萄进行提取而得。
2. 根据权利要求1所述的中草药提取物，其特征在于所述毛葡萄的提 取物以毛葡萄的叶子为原料提取而得。
3. 权利要求1或2所述的毛葡萄提取物在制备预防和治疗心脑血管血栓 的药物中的应用。
4. 根据权利要求3所述的毛葡萄提取物在制备预防和治疗心脑血管血栓 的药物中的应用，其特征在于毛葡萄提取物在预防和治疗心、脑血管血栓时 用量按体重计，提取物的用量是0.05-3000mg/kg/日。
5. 根据权利要求4所述的毛葡萄提取物在制备预防和治疗心脑血管血栓 的药物中的应用，其特征在于毛葡萄提取物在预防和治疗心、脑血管血栓时 用量按体重计，提取物的用量是0.05-1000mg/kg/日。
6. —种预防和治疗心脑血管血栓的药物，其特征在于含有权利要求1所 述的毛葡萄提取物。
全文摘要
本发明公开了毛葡萄提取物在制备抗血栓药物中的应用，所述毛葡萄的提取物是以毛葡萄的叶子为原料，以水、低级醇、低级酮和乙酸乙酯作溶剂、或这些溶剂中任选组合的混合溶剂进行提取得到的提取物；提取方法采用浸泡提取、回流提取、超声提取、逆流提取、超临界萃取中的一种。本发明所述的毛葡萄提取物可用于制备抗血栓药物，具有显著疗效且无毒副作用。
文档编号A61K36/87GK101264180SQ20081002520
公开日2008年9月17日 申请日期2008年4月28日 优先权日2008年4月28日
发明者吴开云 申请人:苏州大学