一种利用葡萄籽提取物制备低聚原花青素的方法
【专利摘要】一种利用葡萄籽提取物制备低聚原花青素的方法，属于原花青素分离制备技术领域。本发明以葡萄籽提取物为原料，经溶解及过滤、真空浓缩、超滤、上柱及洗脱、纳滤以及冷冻干燥而制得低聚原花青素冻干粉和高聚原花青素冻干粉。该方法原料利用率高，分离精度高，分离效果好，产品纯度高，产品用途明确，实现原料的全部利用和溶剂的全部回收再利用，无“三废”排放，是典型的高科技绿色工艺。采用本方法制备出的产品可广泛用于医药及保健品等领域。
【专利说明】
一种利用葡萄籽提取物制备低聚原花青素的方法
一、技术领域
[0001]本发明属于原花青素分离制备技术领域，具体涉及一种利用葡萄籽提取物制备低聚原花青素的方法。
二、【背景技术】
[0002]低聚原花青素是来源于植物、由聚合度低于5的原花青素组成的混合物，具有抗氧化、抗辐射、螯合金属离子等优点，广泛用于医药及保健等领域，是一种具有高经济价值的生物活性物质。
[0003]现有制备低聚原花青素的方法，例如申请号为CN201410140039.3、名称为“一种低聚原花青素的制备方法”的发明专利，该方法以60?70%的乙醇在pH4.0?4.4的条件下提取单体、低聚体和高聚体原花青素，再利用大孔树脂吸附进行吸附分离，获得了聚合度为2-4的低聚体产物，提升了原花青素中有效成分低聚体的含量。该方法的主要缺点是:原花青素溶于水和乙醇，并不受PH的影响，因此在pH4.0?4.4区间，难以分别提取出单体、低聚体和高聚体原花青素;此外，大孔吸附树脂的分离精度有限，不能将单体、低聚体和高聚体原花青素完全分离，难以获得聚合度仅在2?4的低聚体产物。又例如申请号为CN201410116698.3、名称为“一种低成本的低聚原花青素的制备方法”的发明专利，该专利介绍了采用冷溶、过滤、纳滤、喷雾干燥等技术，得到聚合度为2?3的低聚原花青素。该方法的主要缺点是:采用冷溶仅能部分分离高聚体原花青素;采用纳滤虽能完全除去高聚体原花青素，但也因纳滤膜的截留分子量区间分布将聚合度为3?5的低聚体原花青素截留，低聚体原花青素产率低，原料浪费大，生产成本高。
三、
【发明内容】
[0004]本发明的目的是针对现有生产低聚原花青素方法的不足之处，提供一种利用葡萄籽提取物制备低聚原花青素的方法。该方法以葡萄籽提取物为原料，通过提取、分离其中的原花青素并进行深加工，生产出高附加值产品，提高经济效益。
[0005]本发明的原理是:原花青素溶于水和乙醇，而无机盐、氨基酸、蛋白质和糖类则不溶，因此用无水乙醇处理原花青素原料并过滤，可获得脱去无机盐、氨基酸、蛋白质和糖类的原花青素溶液。吸附树脂是以弱极性或非极性基团为吸附官能团的反应性高分子，其吸附官能团可与原花青素分子发生相互作用而产生吸附；由于原花青素是由儿茶素和表儿茶素组成的酚类化合物，其聚合度不同，极性有所不同，与吸附树脂发生的相互作用力不同，在洗脱剂的作用下解吸的顺序不同，因此，选择合适的洗脱剂，可在一定范围内洗脱分离出确定聚合度区间的原花青素。原花青素聚合度不同，分子量不同，分子直径也不同，在流经确定孔径、基于分子筛原理的MCI GEL树脂时所走的路径不同，因此，可在一定范围内将其分离。液体的沸点随真空度增加而降低，因此在高真空度的条件下，可在常温下使其与目标物分离，从而获得高品质的产品。
[0006]本发明的目的是这样实现的:一种利用葡萄籽提取物制备低聚原花青素的方法，以葡萄籽提取物为原料，通过制备原花青素乙醇溶液、制备初分离浓缩液、装配MCI GEL树脂层析分离系统、制备低聚原花青素浓缩液、制备低聚原花青素冻干粉、制备高聚原花青素冻干粉共6个步骤，制备出低聚原花青素冻干粉和高聚原花青素冻干粉。其具体的工艺步骤如下:
[0007](I)制备原花青素乙醇溶液
[0008]称取一定量葡萄籽提取物，按照葡萄籽提取物质量/无水乙醇体积比为1:50?100(kg/L)的比例，在搅拌下将其加入到无水乙醇中，处理10?30min后抽滤，分别收集滤渣和滤液，对收集的滤渣，主要含聚合度超过10的高聚体原花青素，用于制备饲料抗氧化剂;对收集的滤液，即为原花青素乙醇溶液，用于下一步制备初分离浓缩液。
[0009](2)制备初分离浓缩液
[0010]第(I)步完成后，将第(I)步收集的原花青素乙醇溶液栗入真空浓缩器中，在温度为60?80°C、真空度为0.06?0.08MPa的条件下进行真空浓缩，直至浓缩液体积降低至原花青素乙醇溶液体积的1/10?1/20时止。分别收集真空浓缩液和真空浓缩冷凝液，对收集的真空浓缩冷凝液，用于再次溶解葡萄籽提取物;对于收集的真空浓缩液，按照该浓缩液体积/纯净水体积之比为1:4?8(L/L)的比例加入纯净水，搅拌均匀后用截留分子量为1000?5000Da的超滤膜在表压为0.05?0.2MPa的条件下进行超滤，直至超滤截留液/超滤滤过液的体积比为1:6?10(L/L)时止。分别收集超滤滤过液和超滤截留液，对收集的超滤截留液，即为初分离浓缩液，主要由低聚体原花青素组成，用于后续步骤制备低聚原花青素;对收集的超滤滤过液，主要含无机离子、单糖、寡糖和氨基酸，栗入生化处理池进行生化处理，达标后排放。
[0011](3)装配MCI GEL树脂层析分离系统
[0012]将市售MCI GEL树脂CHP20P或CHP 2MG Y先用体积分数为5?10%的乙醇溶液分散，再用恒流栗栗入中压层析柱中，其中MCI GEL树脂CHP20P或CHP 2MG Y质量与体积分数为5?10%的乙醇溶液体积之比为1:5?10(kg/L)。然后将中压层析柱分别与恒流栗和在线紫外检测器连接，就装配出CHP20P或CHP 2MG Y树脂层析分离系统。
[0013](4)制备低聚原花青素浓缩液
[0014]第(3)步完成后，将第(2)步收集的初分离浓缩液栗入MCIGEL树脂CHP20P或CHP2MG Y层析分离系统，栗入的初分离浓缩液体积与MCI GEL树脂CHP20P或CHP 2MG Y质量之比为1:10?20(L/kg)。栗完初分离浓缩液后，再栗入体积分数为5?10%的乙醇溶液进行洗脱，栗入量为树脂柱体积的6?8倍，栗入流速为树脂柱体积(BV)的3?6倍/小时。分段收集洗脱液，将第I?2BV、第4.1?5BV和第7.1?8BV的洗脱液合并，第I?2BV、4.1?5BV和第7.1?8BV的洗脱液均为体积分数为5?10%的乙醇溶液，用于下批次洗脱;第2.1?4BV的洗脱液含高聚原花青素，用于制备高聚原花青素冻干粉;第5.1?7BV的洗脱液含低聚原花青素，用于制备低聚原花青素冻干粉。洗脱完原花青素的MCI GEL树脂CHP20P或CHP 2MG Y，可用于下批次分离低聚原花青素和高聚原花青素。
[0015](5)制备低聚原花青素冻干粉
[0016]第(4)步完成后，将第(4)步收集的第5.1?7BV的洗脱液栗入截留分子量为200?600Da的纳滤膜，在表压为0.2?0.5MPa的条件下进行纳滤，直至纳滤截留液/纳滤滤过液的体积比为1:6?10(L/L)时止。分别收集纳滤截留液和纳滤滤过液，对收集的纳滤滤过液，与第(4)步分段收集的第I?2BV、4.1?5BV和第7.1?8BV的洗脱液合并，用于洗脱下批次原花青素；对收集的纳滤截留液，栗入超低温真空浓缩器中，在温度为20?40°C、真空度为0.0086?0.0098MPa的条件下进行真空浓缩，直至无乙醇浓缩出时为止。分别收集真空浓缩液和真空浓缩冷凝液，对收集的真空浓缩液，在真空度为30?50Pa、温度为-50?-40 °C的条件下冷冻干燥24?30小时，就制备出低聚原花青素冻干粉;对收集的真空浓缩冷凝液，用于制备无水乙醇。
[0017](6)制备高聚原花青素冻干粉
[0018]第(4)步完成后，将第(4)步收集的第2.1?4BV的洗脱液栗入截留分子量为5000?1000Da的超滤膜，在表压为0.05?0.2MPa的条件下进行超滤，直至超滤截留液/超滤滤过液的体积比为1:6?10(L/L)时止。分别收集超滤滤过液和超滤截留液，对收集的超滤滤过液，与第(4)步分段收集的第I?2BV、4.1?5BV和第7.1?8BV的洗脱液合并，用于洗脱下批次原花青素;对收集的超滤截留液，栗入超低温真空浓缩器中，在温度为20?40°C、真空度为0.0086?0.0098MPa的条件下进行真空浓缩，直至无乙醇浓缩出时为止。分别收集真空浓缩液和真空浓缩冷凝液，对收集的真空浓缩液，在真空度为30?50Pa、温度为-50?-40 °C的条件下冷冻干燥24?30小时，就制备出高聚原花青素冻干粉;对收集的真空浓缩冷凝液，用于制备无水乙醇。
[0019]本发明采用上述技术方案后，主要有以下效果:
[0020](I)原料利用率高，分离精度高，分离效果好，产品纯度高，分离产物分别为聚合度小于等于4的低聚原花青素冻干粉和聚合度大于等于4的高聚原花青素冻干粉，低聚原花青素冻干粉的总收得率为33.6%?38.4%，低聚原花青素的含量为93.5%?95.5% ;高聚原花青素冻干粉的总收得率为46.2%?48.7%，高聚原花青素的含量为92.1 %?95.2%。
[0021](2)产品用途明确，本发明技术制备出的低聚原花青素由聚合度小于等于4的原花青素组成，抗氧化、抗辐射等性能显著，用于高附加值保健品等领域;制备出的高聚原花青素由聚合度大于等于4的原花青素组成，颜色稳定，用作葡萄酒色素，也有较高的附加值。
[0022](3)本发明技术大量采用高技术工业化装备和材料，例如膜分离装置、超低温真空浓缩器及MCI GEL树脂，分离条件温和、效率高且实现原料的全部利用，实现溶剂的全部回收再利用，无“三废”排放，是典型的高科技绿色工艺。
四、【具体实施方式】
[0023]下面结合【具体实施方式】，进一步说明本发明。
[0024]实施例1
[0025](I)制备原花青素乙醇溶液
[0026]称取一定量葡萄籽提取物，按照葡萄籽提取物质量/无水乙醇体积比为1:50(kg/U的比例，在搅拌下将其加入到无水乙醇中，处理1min后抽滤，分别收集滤渣和滤液，对收集的滤渣，主要含聚合度超过10的高聚体原花青素，用于制备饲料抗氧化剂;对收集的滤液，即为原花青素乙醇溶液，用于下一步制备初分离浓缩液。
[0027](2)制备初分离浓缩液
[0028]第(I)步完成后，将第(I)步收集的原花青素乙醇溶液栗入真空浓缩器中，在温度为60°C、真空度为0.06MPa的条件下进行真空浓缩，直至浓缩液体积降低至原花青素乙醇溶液体积的1/10时止。分别收集真空浓缩液和真空浓缩冷凝液，对收集的真空浓缩冷凝液，用于再次溶解葡萄籽提取物;对于收集的真空浓缩液，按照该浓缩液体积/纯净水体积之比为1: 4(L/L)的比例加入纯净水，搅拌均匀后用截留分子量为100Da的超滤膜在表压为
0.05MPa的条件下进行超滤，直至超滤截留液/超滤滤过液的体积比为1:6(L/L)时止。分别收集超滤滤过液和超滤截留液，对收集的超滤截留液，即为初分离浓缩液，主要由低聚体原花青素组成，用于后续步骤制备低聚原花青素;对收集的超滤滤过液，主要含无机离子、单糖、寡糖和氨基酸，栗入生化处理池进行生化处理，达标后排放。
[0029](3)装配MCI GEL树脂层析分离系统
[0030]将市售MCI GEL树脂CHP20P或CHP 2MG Y先用体积分数为5%的乙醇溶液分散，再用恒流栗栗入中压层析柱中，其中MCI GEL树脂CHP20P或CHP 2MG Y质量与体积分数为5%的乙醇溶液体积之比为1:5(kg/L)。然后将中压层析柱分别与恒流栗和在线紫外检测器连接，就装配出CHP20P或CHP 2MG Y树脂层析分离系统。
[0031](4)制备低聚原花青素浓缩液
[0032]第(3)步完成后，将第(2)步收集的初分离浓缩液栗入MCIGEL树脂CHP20P或CHP2MG Y层析分离系统，栗入的初分离浓缩液体积与MCI GEL树脂CHP20P或CHP 2MG Y质量之比为1:10(L/kg)。栗完初分离浓缩液后，再栗入体积分数为5%的乙醇溶液进行洗脱，栗入量为树脂柱体积的6倍，栗入流速为树脂柱体积(BV)的3倍/小时。分段收集洗脱液，将第I?2BV、第4.1?5BV和第7.1?8BV的洗脱液合并，第I?2BV、4.1?5BV和第7.1?8BV的洗脱液均为体积分数为5 %的乙醇溶液，用于下批次洗脱;第2.1?4BV的洗脱液含高聚原花青素，用于制备高聚原花青素冻干粉;第5.1?7BV的洗脱液含低聚原花青素，用于制备低聚原花青素冻干粉。洗脱完原花青素的MCI GEL树脂CHP20P或CHP 2MG Y，可用于下批次分离低聚原花青素和高聚原花青素。
[0033](5)制备低聚原花青素冻干粉
[0034]第(4)步完成后，将第(4)步收集的第5.1?7BV的洗脱液栗入截留分子量为200Da的纳滤膜，在表压为0.2MPa的条件下进行纳滤，直至纳滤截留液/纳滤滤过液的体积比为1:6 (L/L)时止。分别收集纳滤截留液和纳滤滤过液，对收集的纳滤滤过液，与第(4)步分段收集的第I?2BV、4.1?5BV和第7.1?8BV的洗脱液合并，用于洗脱下批次原花青素;对收集的纳滤截留液，栗入超低温真空浓缩器中，在温度为20°C、真空度为0.0086MPa的条件下进行真空浓缩，直至无乙醇浓缩出时为止。分别收集真空浓缩液和真空浓缩冷凝液，对收集的真空浓缩液，在真空度为30Pa、温度为-50°C的条件下冷冻干燥24小时，就制备出低聚原花青素冻干粉;对收集的真空浓缩冷凝液，用于制备无水乙醇。
[0035](6)制备高聚原花青素冻干粉
[0036]第(4)步完成后，将第(4)步收集的第2.1?4BV的洗脱液栗入截留分子量为5000Da的超滤膜，在表压为0.05MPa的条件下进行超滤，直至超滤截留液/超滤滤过液的体积比为1:6(L/L)时止。分别收集超滤滤过液和超滤截留液，对收集的超滤滤过液，与第(4)步分段收集的第I?2BV、4.1?5BV和第7.1?8BV的洗脱液合并，用于洗脱下批次原花青素;对收集的超滤截留液，栗入超低温真空浓缩器中，在温度为20°C、真空度为0.0086MPa的条件下进行真空浓缩，直至无乙醇浓缩出时为止。分别收集真空浓缩液和真空浓缩冷凝液，对收集的真空浓缩液，在真空度为30Pa、温度为-50°C的条件下冷冻干燥24小时，就制备出高聚原花青素冻干粉;对收集的真空浓缩冷凝液，用于制备无水乙醇。
[0037]实施例2
[0038](I)制备原花青素乙醇溶液
[0039]称取一定量葡萄籽提取物，按照葡萄籽提取物质量/无水乙醇体积比为1:75(kg/U的比例，在搅拌下将其加入到无水乙醇中，处理20min后抽滤，分别收集滤渣和滤液，对收集的滤渣，主要含聚合度超过10的高聚体原花青素，用于制备饲料抗氧化剂;对收集的滤液，即为原花青素乙醇溶液，用于下一步制备初分离浓缩液。
[0040](2)制备初分离浓缩液
[0041 ]第(I)步完成后，将第(I)步收集的原花青素乙醇溶液栗入真空浓缩器中，在温度为70°C、真空度为0.07MPa的条件下进行真空浓缩，直至浓缩液体积降低至原花青素乙醇溶液体积的1/15时止。分别收集真空浓缩液和真空浓缩冷凝液，对收集的真空浓缩冷凝液，用于再次溶解葡萄籽提取物;对于收集的真空浓缩液，按照该浓缩液体积/纯净水体积之比为1:6(171)的比例加入纯净水，搅拌均匀后用截留分子量为30000&的超滤膜在表压为0.110^的条件下进行超滤，直至超滤截留液/超滤滤过液的体积比为1:8(L/L)时止。分别收集超滤滤过液和超滤截留液，对收集的超滤截留液，即为初分离浓缩液，主要由低聚体原花青素组成，用于后续步骤制备低聚原花青素;对收集的超滤滤过液，主要含无机离子、单糖、寡糖和氨基酸，栗入生化处理池进行生化处理，达标后排放。
[0042](3)装配MCI GEL树脂层析分离系统
[0043]将市售MCI GEL树脂CHP20P或CHP 2MG Y先用体积分数为8%的乙醇溶液分散，再用恒流栗栗入中压层析柱中，其中MCI GEL树脂CHP20P或CHP 2MG Y质量与体积分数为8%的乙醇溶液体积之比为1:8(kg/L)。然后将中压层析柱分别与恒流栗和在线紫外检测器连接，就装配出CHP20P或CHP 2MG Y树脂层析分离系统。
[0044](4)制备低聚原花青素浓缩液
[0045]第(3)步完成后，将第(2)步收集的初分离浓缩液栗入MCIGEL树脂CHP20P或CHP2MG Y层析分离系统，栗入的初分离浓缩液体积与MCI GEL树脂CHP20P或CHP 2MG Y质量之比为1:15(L/kg)。栗完初分离浓缩液后，再栗入体积分数为8%的乙醇溶液进行洗脱，栗入量为树脂柱体积的7倍，栗入流速为树脂柱体积(BV)的5倍/小时。分段收集洗脱液，将第I?2BV、第4.1?5BV和第7.1?8BV的洗脱液合并，第I?2BV、4.1?5BV和第7.1?8BV的洗脱液均为体积分数为8 %的乙醇溶液，用于下批次洗脱;第2.1?4BV的洗脱液含高聚原花青素，用于制备高聚原花青素冻干粉;第5.1?7BV的洗脱液含低聚原花青素，用于制备低聚原花青素冻干粉。洗脱完原花青素的MCI GEL树脂CHP20P或CHP 2MG Y，可用于下批次分离低聚原花青素和高聚原花青素。
[0046](5)制备低聚原花青素冻干粉
[0047]第(4)步完成后，将第(4)步收集的第5.1?7BV的洗脱液栗入截留分子量为400Da的纳滤膜，在表压为0.4MPa的条件下进行纳滤，直至纳滤截留液/纳滤滤过液的体积比为1:8 (L/L)时止。分别收集纳滤截留液和纳滤滤过液，对收集的纳滤滤过液，与第(4)步分段收集的第I?2BV、4.1?5BV和第7.1?8BV的洗脱液合并，用于洗脱下批次原花青素;对收集的纳滤截留液，栗入超低温真空浓缩器中，在温度为30°C、真空度为0.0092MPa的条件下进行真空浓缩，直至无乙醇浓缩出时为止。分别收集真空浓缩液和真空浓缩冷凝液，对收集的真空浓缩液，在真空度为40Pa、温度为-45°C的条件下冷冻干燥27小时，就制备出低聚原花青素冻干粉;对收集的真空浓缩冷凝液，用于制备无水乙醇。
[0048](6)制备高聚原花青素冻干粉
[0049]第(4)步完成后，将第(4)步收集的第2.1?4BV的洗脱液栗入截留分子量为8000Da的超滤膜，在表压为0.1MPa的条件下进行超滤，直至超滤截留液/超滤滤过液的体积比为1:8(L/L)时止。分别收集超滤滤过液和超滤截留液，对收集的超滤滤过液，与第(4)步分段收集的第I?2BV、4.1?5BV和第7.1?8BV的洗脱液合并，用于洗脱下批次原花青素;对收集的超滤截留液，栗入超低温真空浓缩器中，在温度为30°C、真空度为0.0092MPa的条件下进行真空浓缩，直至无乙醇浓缩出时为止。分别收集真空浓缩液和真空浓缩冷凝液，对收集的真空浓缩液，在真空度为40Pa、温度为-45°C的条件下冷冻干燥27小时，就制备出高聚原花青素冻干粉;对收集的真空浓缩冷凝液，用于制备无水乙醇。
[0050]实施例3
[0051 ] (I)制备原花青素乙醇溶液
[0052]称取一定量葡萄籽提取物，按照葡萄籽提取物质量/无水乙醇体积比为1:100(kg/U的比例，在搅拌下将其加入到无水乙醇中，处理30min后抽滤，分别收集滤渣和滤液，对收集的滤渣，主要含聚合度超过10的高聚体原花青素，用于制备饲料抗氧化剂;对收集的滤液，即为原花青素乙醇溶液，用于下一步制备初分离浓缩液。
[0053](2)制备初分离浓缩液
[0054]第(I)步完成后，将第(I)步收集的原花青素乙醇溶液栗入真空浓缩器中，在温度为80°C、真空度为0.0SMPa的条件下进行真空浓缩，直至浓缩液体积降低至原花青素乙醇溶液体积的1/20时止。分别收集真空浓缩液和真空浓缩冷凝液，对收集的真空浓缩冷凝液，用于再次溶解葡萄籽提取物;对于收集的真空浓缩液，按照该浓缩液体积/纯净水体积之比为1:8(L/L)的比例加入纯净水，搅拌均匀后用截留分子量为5000Da的超滤膜在表压为0.2MPa的条件下进行超滤，直至超滤截留液/超滤滤过液的体积比为1:10(L/L)时止。分别收集超滤滤过液和超滤截留液，对收集的超滤截留液，即为初分离浓缩液，主要由低聚体原花青素组成，用于后续步骤制备低聚原花青素;对收集的超滤滤过液，主要含无机离子、单糖、寡糖和氨基酸，栗入生化处理池进行生化处理，达标后排放。
[0055](3)装配MCI GEL树脂层析分离系统
[0056]将市售MCI GEL树脂CHP20P或CHP 2MG Y先用体积分数为10%的乙醇溶液分散，再用恒流栗栗入中压层析柱中，其中MCI GEL树脂CHP20P或CHP 2MG Y质量与体积分数为10%的乙醇溶液体积之比为1:10(kg/L)。然后将中压层析柱分别与恒流栗和在线紫外检测器连接，就装配出CHP20P或CHP 2MG Y树脂层析分离系统。
[0057](4)制备低聚原花青素浓缩液
[0058]第(3)步完成后，将第(2)步收集的初分离浓缩液栗入MCIGEL树脂CHP20P或CHP2MG Y层析分离系统，栗入的初分离浓缩液体积与MCI GEL树脂CHP20P或CHP 2MG Y质量之比为l:20(L/kg)。栗完初分离浓缩液后，再栗入体积分数为10%的乙醇溶液进行洗脱，栗入量为树脂柱体积的8倍，栗入流速为树脂柱体积(BV)的6倍/小时。分段收集洗脱液，将第I?2BV、第4.1?5BV和第7.1?8BV的洗脱液合并，第I?2BV、4.1?5BV和第7.1?8BV的洗脱液均为体积分数为10%的乙醇溶液，用于下批次洗脱;第2.1?4BV的洗脱液含高聚原花青素，用于制备高聚原花青素冻干粉;第5.1?7BV的洗脱液含低聚原花青素，用于制备低聚原花青素冻干粉。洗脱完原花青素的MCI GEL树脂CHP20P或CHP 2MG Y，可用于下批次分离低聚原花青素和高聚原花青素。
[0059](5)制备低聚原花青素冻干粉
[0060]第(4)步完成后，将第(4)步收集的第5.1?7BV的洗脱液栗入截留分子量为600Da的纳滤膜，在表压为0.5MPa的条件下进行纳滤，直至纳滤截留液/纳滤滤过液的体积比为1:1O (L/L)时止。分别收集纳滤截留液和纳滤滤过液，对收集的纳滤滤过液，与第(4)步分段收集的第I?2BV、4.1?5BV和第7.1?8BV的洗脱液合并，用于洗脱下批次原花青素;对收集的纳滤截留液，栗入超低温真空浓缩器中，在温度为40°C、真空度为0.0098MPa的条件下进行真空浓缩，直至无乙醇浓缩出时为止。分别收集真空浓缩液和真空浓缩冷凝液，对收集的真空浓缩液，在真空度为50Pa、温度为-40 °C的条件下冷冻干燥30小时，就制备出低聚原花青素冻干粉;对收集的真空浓缩冷凝液，用于制备无水乙醇。
[0061 ] (6)制备高聚原花青素冻干粉
[0062]第(4)步完成后，将第(4)步收集的第2.1?4BV的洗脱液栗入截留分子量为1000Da的超滤膜，在表压为0.2MPa的条件下进行超滤，直至超滤截留液/超滤滤过液的体积比为1:10(L/L)时止。分别收集超滤滤过液和超滤截留液，对收集的超滤滤过液，与第(4)步分段收集的第I?2BV、4.1?5BV和第7.1?8BV的洗脱液合并，用于洗脱下批次原花青素；对收集的超滤截留液，栗入超低温真空浓缩器中，在温度为40°C、真空度为0.0098MPa的条件下进行真空浓缩，直至无乙醇浓缩出时为止。分别收集真空浓缩液和真空浓缩冷凝液，对收集的真空浓缩液，在真空度为50Pa、温度为-40 °C的条件下冷冻干燥30小时，就制备出高聚原花青素冻干粉;对收集的真空浓缩冷凝液，用于制备无水乙醇。
【主权项】
1.一种利用葡萄籽提取物制备低聚原花青素的方法，其特征在于具体的工艺步骤如下: (1)制备原花青素乙醇溶液 称取一定量葡萄籽提取物，按照葡萄籽提取物质量/无水乙醇体积比为1:50?100(kg/U的比例，在搅拌下将其加入到无水乙醇中，处理10?30min后抽滤，分别收集滤渣和滤液，对收集的滤渣，主要含聚合度超过10的高聚体原花青素，用于制备饲料抗氧化剂;对收集的滤液，即为原花青素乙醇溶液，用于下一步制备初分离浓缩液； (2)制备初分离浓缩液 第(I)步完成后，将第(I)步收集的原花青素乙醇溶液栗入真空浓缩器中，在温度为60?80 °C、真空度为0.06?0.0SMPa的条件下进行真空浓缩，直至浓缩液体积降低至原花青素乙醇溶液体积的1/10?1/20时止，分别收集真空浓缩液和真空浓缩冷凝液，对收集的真空浓缩冷凝液，用于再次溶解葡萄籽提取物;对于收集的真空浓缩液，按照该浓缩液体积/纯净水体积之比为1:4?8(L/L)的比例加入纯净水，搅拌均匀后用截留分子量为1000?5000Da的超滤膜在表压为0.05?0.2MPa的条件下进行超滤，直至超滤截留液/超滤滤过液的体积比为1:6?10(L/L)时止，分别收集超滤滤过液和超滤截留液，对收集的超滤截留液，即为初分离浓缩液，主要由低聚体原花青素组成，用于后续步骤制备低聚原花青素;对收集的超滤滤过液，主要含无机离子、单糖、寡糖和氨基酸，栗入生化处理池进行生化处理，达标后排放； (3)装配MCIGEL树脂层析分离系统 将市售MCI GEL树脂CHP20P或CHP 2MG Y先用体积分数为5?10%的乙醇溶液分散，再用恒流栗栗入中压层析柱中，其中MCI GEL树脂CHP20P或CHP 2MG Y质量与体积分数为5?10%的乙醇溶液体积之比为1:5?10(kg/L)，然后将中压层析柱分别与恒流栗和在线紫外检测器连接，就装配出CHP20P或CHP 2MG Y树脂层析分离系统； (4)制备低聚原花青素浓缩液 第(3)步完成后，将第(2)步收集的初分离浓缩液栗入MCI GEL树脂CHP20P或CHP2MG Y层析分离系统，栗入的初分离浓缩液体积与MCI GEL树脂CHP20P或CHP 2MG Y质量之比为1:10?20(L/kg)，栗完初分离浓缩液后，再栗入体积分数为5?10%的乙醇溶液进行洗脱，栗入量为树脂柱体积的6?8倍，栗入流速为树脂柱体积(BV)的3?6倍/小时，分段收集洗脱液，将第1?28￥、第4.1?58￥和第7.1?88￥的洗脱液合并，第1?28￥、4.1?58￥和第7.1?8BV的洗脱液均为体积分数为5?10%的乙醇溶液，用于下批次洗脱;第2.1?4BV的洗脱液含高聚原花青素，用于制备高聚原花青素冻干粉;第5.1?7BV的洗脱液含低聚原花青素，用于制备低聚原花青素冻干粉，洗脱完原花青素的MCI GEL树脂CHP20P或CHP 2MG Y，可用于下批次分离低聚原花青素和高聚原花青素； (5)制备低聚原花青素冻干粉 第(4)步完成后，将第(4)步收集的第5.1?7BV的洗脱液栗入截留分子量为200?600Da的纳滤膜，在表压为0.2?0.5MPa的条件下进行纳滤，直至纳滤截留液/纳滤滤过液的体积比为1:6?1 (L/L)时止，分别收集纳滤截留液和纳滤滤过液，对收集的纳滤滤过液，与第(4)步分段收集的第I?2BV、4.1?5BV和第7.1?8BV的洗脱液合并，用于洗脱下批次原花青素;对收集的纳滤截留液，栗入超低温真空浓缩器中，在温度为20?40°C、真空度为0.0086?0.0098MPa的条件下进行真空浓缩，直至无乙醇浓缩出时为止，分别收集真空浓缩液和真空浓缩冷凝液，对收集的真空浓缩液，在真空度为30?50Pa、温度为-50?-40 V的条件下冷冻干燥24?30小时，就制备出低聚原花青素冻干粉;对收集的真空浓缩冷凝液，用于制备无水乙醇； (6)制备高聚原花青素冻干粉 第(4)步完成后，将第(4)步收集的第2.1?4BV的洗脱液栗入截留分子量为5000?1000Da的超滤膜，在表压为0.05?0.2MPa的条件下进行超滤，直至超滤截留液/超滤滤过液的体积比为1:6?10(L/L)时止，分别收集超滤滤过液和超滤截留液，对收集的超滤滤过液，与第(4)步分段收集的第I?2BV、4.1?5BV和第7.1?8BV的洗脱液合并，用于洗脱下批次原花青素;对收集的超滤截留液，栗入超低温真空浓缩器中，在温度为20?40°C、真空度为0.0086?0.0098MPa的条件下进行真空浓缩，直至无乙醇浓缩出时为止，分别收集真空浓缩液和真空浓缩冷凝液，对收集的真空浓缩液，在真空度为30?50Pa、温度为-50?-40 °C的条件下冷冻干燥24?30小时，就制备出高聚原花青素冻干粉;对收集的真空浓缩冷凝液，用于制备无水乙醇。
【文档编号】C12G1/00GK106045959SQ201610345527
【公开日】2016年10月26日
【申请日】2016年5月23日
【发明人】徐扬, 陶仁友, 江文, 杨洋, 石业新, 袁德宽, 余红梅, 周小华
【申请人】湖南鑫利生物科技有限公司, 重庆大学