高产原花青素刺葡萄愈伤组织的获取与继代保持方法
【专利摘要】一种高产原花青素刺葡萄愈伤组织的获取与继代保持方法，包括无菌幼胚的获取、启动培养、增殖培养、刺葡萄愈伤组织高产原花青素细胞系的筛选，以及长期继代保持所筛选的高产原花青素的愈伤组织等内容。本发明不仅能够快速获得大量刺葡萄愈伤组织，且所获得的刺葡萄愈伤组织具有高诱导效率、生长旺盛和高产原花青素的优点，同时可长期继代保持刺葡萄愈伤组织，即具有旺盛的生长能力，从而为刺葡萄生物技术和细胞培养生产次生代谢产物等研究奠定了良好的基础。
【专利说明】高产原花青素刺葡萄愈伤组织的获取与继代保持方法
【技术领域】
[0001] 本发明具体涉及一种高产原花青素刺葡萄愈伤组织的获取与继代保持方法。
【背景技术】
[0002] 刺葡萄（Vitis davidii F〇€x )是葡萄科葡萄属东亚种群的一个野生种，为落叶 强大藤本植物，在我国南方广泛分布，向北分布至陕西南部。刺葡萄果实紫黑色，营养极为 丰富，含有具保健功能的黄酮类化合物（主要是花青素和原花青素）、白黎芦醇、齐墩果酸、 蹂质、超氧化物歧化酶（S0D)和维生素C等天然活性成分。刺葡萄果皮厚，种子多，在加工 制汁和酿酒，以及从果皮、种子提取天然活性物质具有很好的应用前景。研究表明，刺葡萄 果实中富含的花青素和原花青素（oligomeric proanthocyanidins，OPCs)有很强的清除自 由基的能力，具有抗氧化、抗突变、抗肿瘤、保护心血管等方面的功能，尤其是原花青素，是 目前国际上公认的清除人体内自由基最有效的天然抗氧化剂。目前，天然的原花青素还主 要来源于松树皮和葡萄籽，随着市场需求的不断扩大，原有的从葡萄、松树皮或其他替代植 物中来源的生物活性物质已不能满足需要，必须寻求更多更可靠的材料来源。生物技术领 域里一个重要分支的植物细胞培养，具有不受季节影响、生长周期短、产物均一可控、活性 物质成分高于天然植物等优点，因此采用规模化的植物细胞培养是解决药用植物资源匮乏 和药效成分低的药用植物以满足需求的重要途径。
[0003] 近年来，植物细胞培养进行天然有效成分的生产已经取得了令人瞩目的成就。然 而，刺葡萄的细胞培养还处在愈伤组织诱导和培养阶段，鲜见长期继代保持的报道；刺葡萄 细胞培养还亟待解决细胞系的筛选、长期继代保持和悬浮细胞系建立等诸多问题。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题在于提供一种高产原花青素刺葡萄愈伤组织的获取 与继代保持方法。
[0005] 本发明是通过以下技术方案解决上述技术问题的：一种高产原花青素刺葡萄愈伤 组织的获取与继代保持方法，包括如下步骤：
[0006] (1)无菌幼胚的获取：剪取花后20?30天的整串刺葡萄幼果，去除果穗和果柄， 置入加有洗涤剂的自来水中浸泡30min，冲洗干净，自然晾干；将幼果用75%酒精浸泡30s， 接着用〇. 1 %升萊溶液灭菌15min，再用无菌水冲洗5次，最后将灭菌好的刺葡萄幼果，小心 切开，取出完整的幼胚；
[0007] (2)启动培养：取所述幼胚，将该幼胚以平放的方式接种至诱导愈伤组织的诱导 培养基中，然后于培养室中黑暗条件下培养35天，得到初代愈伤组织；
[0008] (3)增殖培养：将初代愈伤组织转接到继代增殖培养基中，并于温度23?25°C，光 照强度1000?15001x，每天光照10h的条件下进行继代增殖培养，直至获得生长一致且生 长旺盛的刺葡萄愈伤组织；
[0009] (4)筛选：从步骤（3)所获得的刺葡萄愈伤组织中，选取质地松脆、颜色为紫红色 的刺葡萄愈伤组织，剥去紫红色表层，选取里层的愈伤组织接种至附加1. 5mg/L2, 4-D的MS 固体培养基中，于温度23?25 °C，光照强度1000?15001x，每天光照10h的条件下培养 20?25天，获得高产原花青素的愈伤组织；
[0010] (5)长期继代保持：以培养20?25天的高产原花青素的愈伤组织为材料，于温度 23?25°C，光照强度1000?15001x，每天光照10h的条件下，采用两种继代保持培养基交 替继代培养，并采用剥去所述愈伤组织紫红色表层细胞，选里层愈伤组织接种的方式，能长 期继代保持高产原花青素的紫红色刺葡萄愈伤组织。
[0011] 进一步地，所述步骤（2)中的诱导培养基为：MS培养基+2, 4-二氯苯氧基乙酸 1. 0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L，或MS培养基+2, 4-二氯苯氧基乙酸1. Omg/L+6-糠氨 基嘌呤0· 5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L。
[0012] 进一步地，所述步骤（3)中的继代增殖培养基为：MS培养基+2, 4-二氯苯氧基乙 酸1. 5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L，或MS培养基+2, 4-二氯苯氧基乙酸1. 5mg/L+6-糠 氨基嘌呤〇· 5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L。
[0013] 进一步地，所述步骤（5)中的两种继代保持培养基为：MS培养基+2, 4-二氯苯氧 基乙酸1. 5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L，以及MS培养基+2, 4-二氯苯氧基乙酸1. 5mg/ L+6-糠氨基嘌呤0· 5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L。
[0014] 本发明的有益效果在于：不仅能够快速获得大量刺葡萄愈伤组织，且所获得的刺 葡萄愈伤组织具有高诱导效率、生长旺盛和高产原花青素的优点，同时可长期继代保持刺 葡萄愈伤组织，即具有旺盛的生长能力，从而为刺葡萄生物技术和细胞培养生产次生代谢 产物等研究奠定了良好的基础。
【具体实施方式】
[0015] 一、高产原花青素刺葡萄愈伤组织的制备
[0016] 1、实验材料的选取与预处理
[0017] 取花后20天左右的刺葡萄幼果，剪取整串刺葡萄，装入自封袋，带回实验室贮于 4°C冰箱，备用。从冰箱中取出刺葡萄幼果，去除果穗和果柄，置入加有洗涤剂的自来水中浸 泡30min，后用自来水冲洗干净，自然瞭干备用。将幼果转入超净工作台内，用75%酒精（v/ v)浸泡30s内，再用0. 1 %升萊（w/v)溶液灭菌15min，最后用无菌水冲洗5次；将灭菌好 的刺葡萄幼果，小心切开，取出完整的幼胚。
[0018] 2、启动培养：取所述幼胚接种至诱导培养基中，并将该诱导培养基置于培养室中 黑暗条件下培养，7天后可见愈伤组织形成，30天左右长成初代愈伤组织。所述诱导培养 基为：MS培养基+2, 4-二氯苯氧基乙酸1. 0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L，或MS培养基 +2, 4-二氯苯氧基乙酸1. Omg/L+6-糠氨基嘌呤0· 5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L。
[0019] 3、愈伤组织增殖培养：将初代愈伤组织转接到继代增殖培养基中，并将该继代增 殖培养基置于培养室中光照条件下进行，以获得生长一致且生长旺盛的刺葡萄愈伤组织， 获得的刺葡萄愈伤组织有白色、淡黄色、黄色、浅紫红色、紫红色等颜色；所述继代增殖培养 基为：MS培养基+2, 4-二氯苯氧基乙酸1. 5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L，或MS培养基 +2, 4-二氯苯氧基乙酸1. 5mg/L+6-糠氨基嘌呤0· 5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L。
[0020] 4、高产原花青素愈伤组织的筛选：将步骤3得到的刺葡萄愈伤组织，选取质地松 脆的、颜色紫红色的刺葡萄愈伤组织，接种时剥去表层紫红色的愈伤组织，选取较里层的愈 伤组织进行接种，于光照条件下培养，可获得生长一致且生长旺盛的、保持紫红色的高产原 花青素的刺葡萄愈伤组织细胞系，培养35天时原花青素含量可达1671. 16 μ g/g鲜样；
[0021] 5、愈伤组织的长期继代保持：以培养20?25天的高产原花青素的愈伤组织为材 料，于温度23?25°C，光照强度1000?15001x，每天光照10h的条件下，采用两种继代保 持培养基交替继代培养，能长期继代保持高产原花青素的紫红色刺葡萄愈伤组织。所述两 种继代保持培养基为：MS培养基+2, 4-二氯苯氧基乙酸1. 5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/ L，以及MS培养基+2, 4-二氯苯氧基乙酸1. 5mg/L+6-糠氨基嘌呤0. 5mg/L+蔗糖30g/L+琼 脂粉6g/L。
[0022] 二、刺葡萄幼胚诱导刺葡萄愈伤组织过程的影响因素
[0023] 1、不同培养基对刺葡萄幼胚诱导愈伤组织的影响
[0024] 将刺葡萄幼胚接种到表1中的F1?F5等5种培养基中诱导愈伤组织。从诱导效 果可见，F1和F5两种培养基诱导的效果最好，诱导30天后会形成大量的愈伤组织，诱导率 可达到80%以上，刺葡萄愈伤组织有4种状态：松软状（用DF1指代）、松脆状（用DF2指 代）、棉絮状（用DF3指代）、坚硬状（用DF4指代），颜色有白色、淡黄色、浅红紫色、紫红色 等。在F2培养基中，诱导率只有30%左右，并且愈伤组织的生长量很小，呈黄褐色，质地较 坚硬，培养一段时间后，愈伤组织会褐变死亡，如果及时转接，愈伤组织可以继代保持，但要 得到松脆状的愈伤组织，需要较长的在不加AgN0 3培养基上培养，说明不利于刺葡萄愈伤组 织的诱导。在F3、F4培养基中，未见刺葡萄幼胚的胚轴伸出，幼胚会慢慢的褐变死亡，这表 明在MS培养基中附加BA+IBA或BA+NAA的组合，不适于作为刺葡萄幼胚诱导愈伤组织。由 实验结果可知：刺葡萄幼胚诱导愈伤组织的较佳培养基是MS培养基中附加1. 0mg/L2, 4-D， 或 MS 附加 1. 0mg/L2, 4-D+O. 5mg/L KT。
[0025] 表1中的FI、F2、F3、F4、F5培养基均指在MS培养基中附加了各成分及其含量的 培养基，且各培养基中均含有6 8/1琼脂粉，3(^/1蔗糖，？!1为5.8?6.0。其中，2,4-0为： 2,4-二氯苯氧基乙酸；隱4为，-萘乙酸；四4为：（请填写184的中文名称）出4为 ：6-苄 氨基腺嘌呤；KT为：6_糠氨基嘌呤。
[0026] 表1不同培养基对刺葡萄愈伤组织诱导的影响
[0027]
【权利要求】
1. 一种高产原花青素刺葡萄愈伤组织的获取与继代保持方法，其特征在于：包括如下 步骤： (1) 无菌幼胚的获取：剪取花后20?30天的整串刺葡萄幼果，去除果穗和果柄，置入 加有洗涤剂的自来水中浸泡30min，冲洗干净，自然晾干；将幼果用75%酒精浸泡30s，接着 用0. 1 %升汞溶液灭菌15min，再用无菌水冲洗5次，最后将灭菌好的刺葡萄幼果，小心切 开，取出完整的幼胚； (2) 启动培养：取所述幼胚，将该幼胚以平放的方式接种至诱导愈伤组织的诱导培养 基中，然后于培养室中黑暗条件下培养35天，得到初代愈伤组织； (3) 增殖培养：将初代愈伤组织转接到继代增殖培养基中，并于温度23?25°C，光照强 度1000?15001x，每天光照10h的条件下进行继代增殖培养，直至获得生长一致且生长旺 盛的刺葡萄愈伤组织； (4) 筛选：从步骤（3)所获得的刺葡萄愈伤组织中，选取质地松脆、颜色为紫红色的刺 葡萄愈伤组织，剥去紫红色表层，选取里层的愈伤组织接种至附加1. 5mg/L2, 4-二氯苯氧 基乙酸的MS固体培养基中，于温度23?25°C，光照强度1000?15001x，每天光照10h的 条件下培养20?25天，获得高产原花青素的愈伤组织； (5) 长期继代保持：以培养20?25天的高产原花青素的愈伤组织为材料，于温度23? 25°C，光照强度1000?15001x，每天光照10h的条件下，采用两种继代保持培养基交替继代 培养，并采用剥去所述愈伤组织紫红色表层细胞，选里层愈伤组织接种的方式，能长期继代 保持高产原花青素的紫红色刺葡萄愈伤组织。
2. 如权利要求1所述的高产原花青素刺葡萄愈伤组织的获取与继代保持方法，其特征 在于：所述步骤（2)中的诱导培养基为：MS培养基+2, 4-二氯苯氧基乙酸1. 0mg/L+蔗糖 30g/L+琼脂粉6g/L，或MS培养基+2, 4-二氯苯氧基乙酸1. Omg/L+6-糠氨基嘌呤0. 5mg/L+ 蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L。
3. 如权利要求1所述的高产原花青素刺葡萄愈伤组织的获取与继代保持方法，其特征 在于：所述步骤（3)中的继代增殖培养基为：MS培养基+2, 4-二氯苯氧基乙酸1. 5mg/L+蔗 糖30g/L+琼脂粉6g/L，或MS培养基+2, 4-二氯苯氧基乙酸1. 5mg/L+6-糠氨基嘌呤0. 5mg/ L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L。
4. 如权利要求1所述的高产原花青素刺葡萄愈伤组织的获取与继代保持方法，其特征 在于：所述步骤（5)中的两种继代保持培养基为：MS培养基+2, 4-二氯苯氧基乙酸1. 5mg/ L+蔗糖30g/L+琼脂粉6g/L，以及MS培养基+2, 4-二氯苯氧基乙酸1. 5mg/L+6-糠氨基嘌 呤 0· 5mg/L+ 蔗糖 30g/L+ 琼脂粉 6g/L。
【文档编号】C12N5/04GK104099287SQ201410319042
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2014年7月7日 优先权日:2014年7月7日
【发明者】赖呈纯, 范丽华, 黄贤贵, 谢鸿根 申请人:福建省农业科学院农业工程技术研究所