皖南尖吻蝮蛇蛇毒蛋白组分、提取方法及其应用的制作方法

专利名称：：皖南尖吻蝮蛇蛇毒蛋白组分、提取方法及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于蛇毒蛋白组分、提取方法及其应用，特别属于皖南尖吻蝮蛇蛇毒蛋白组分、提取方法及其应用。
背景技术：
：蛇毒是由蛇毒腺分泌的一种天然毒蛋白，含有多种蛋白质、酶、多肽和其它小分子物质，具有广泛的生物活性。我国古代医学著作如西汉《神农本草经》、唐代《本草拾遗》、明代《本草纲目》中均有利用蛇毒"以毒攻毒"治疗疑难杂症的记载，认为蛇毒可以祛风燥湿、通络活血，治疗风湿麻痹、四肢麻木、恶疮等病症。现代医学对蛇毒的临床作用研究主要集中在蛇毒各组分的生物学特点上。研究发现，蛇毒组分具有抗凝、抗肿瘤、止血、镇痛等作用。蛇毒中以蝮蛇和蝰蛇蛇毒中分离出的活性成分对凝血及血小板聚集系统最为明显。如:凝血酶样多肽、a-纤维蛋白原酶、血小板聚集诱导剂、血小板聚集拮抗剂，纤维蛋白原酶受体拮抗剂、金属蛋白酶、解离素等。这些活性成分广泛影响血液的凝固和血小板的粘附、聚集与释放。早在六十年代，国外学者就已经从蝮蛇毒中分离出类凝血酶物质，分别用于治疗血栓症和出血症，如从马来西亚红口蝮蛇中提取的安克洛酶(ancrod);我国的郝文学等从江浙蝮蛇中提取的蛇毒抗栓酶(svate)，在临床上证明疗效良好，用于治疗血栓性疾病。而蛇毒用于肿瘤的治疗正日益成为研究的的热点，蛇毒中已确认的可抑制肿瘤生长的成分有抑制肿瘤细胞粘附和肿瘤血管生成的解离素、直接作用于癌细胞膜的细胞毒素、一些蛇毒因子和酶类等。蛇毒抗肿瘤作用主要是通过体外实验和动物移植瘤实验验证的。赵蓉等应用9种蛇毒眼镜王蛇、眼镜蛇、金环蛇、银环蛇、青环海蛇、蝮蛇、尖吻蛇、竹叶青及圆斑蝰蛇的粗毒对多种人实体瘤细胞株，包括子宫颈癌细胞株(HeLa)、鼻咽癌细胞株(CNE)、肝癌细胞株(SMC)、胃癌细胞株(MGC80-3)等进行了直接毒性作用实验，结果表明眼镜蛇毒对肿瘤细胞的杀伤作用最强，对SMC的杀伤浓度为50ug/ml，对HeLa、CNE、MGC80-3的杀伤浓度仅为5ug/ml。胃癌和鼻咽癌细胞株对多种蛇毒呈较高的敏感性。随着蛇毒作用时间的延长对各种肿瘤细胞的细胞毒作用更为明显。有少数蛇毒已应用于临床，^Mi^迈等从响尾蛇毒中提取的细胞毒素-复合响尾蛇毒素(cytotoxicPLA(2)，NSC-624244)，目前正进行难治性实体瘤的一期临床实验。该药对多种类型的肿瘤转移均有治疗作用，能有效抑制癌症发展，延长患者生命，但有部分患者出现眼球震颤、流涎等毒副作用。贾建华使用蝮蛇毒制成的蛇毒胶囊制剂结合中医辩证治疗27例临床分期为m-IV期的中、晚期原发性肝癌患者，治疗结果卡氏评分增加率70.4%，稳定率11.1%，下降率18.5%，总有效率达81.5%。原发性肝癌恶性程度高，大多数患者就诊时已失去手术治疗的机会，化疗成为其最主要的治疗方法，常用的化疗药物有细胞周期非特异性药物阿霉素，和细胞周期特异性药物氟尿嘧啶等。蛇毒用于治疗肝癌的研究已多见报导，刍P菁等研究表明，蛇毒复合酶对人肝癌细胞有极强的抑瘤作用，培养至8h抑瘤率已达79.5%，并随培养时间的延长，抑瘤率增高，120h抑瘤率达94.5%。在临床介入治疗肝癌前利用蛇毒复合酶配合治疗，可能有助于加强氟尿嘧啶和阿霉素对S期人肝癌的抑杀，起协同增效作用。刘慰等将中华眼镜蛇毒组分FC与经典肝动脉插管栓塞/灌注化疗(TACE)药进行比较，发现FC选择性作用于肝癌细胞，在有效浓度下对正常组织保持低毒性，对肝癌细胞的毒性选择作用强于5-FU。近年来研究表明肿瘤细胞的高粘附特性直接与肿瘤的高转移特性有关，20世纪70年代早期Gasic等提出肿瘤细胞介导血小板聚集(Tumorcell-inducedplateletagregation，TCIPA)是肿瘤转移的一个必需步骤。他们认为肿瘤细胞可激活血小板，增强其粘着性，使血小板易聚集于肿瘤细胞停驻处，粘附血小板的肿瘤细胞或肿瘤细胞自身可释放诱导剂(如二磷酸腺苷、组织蛋白酶B、凝血酶样蛋白酶、胶原、组织因子型凝血酶)，进一步活化、聚集血小板。形成大量血小板微血栓。便于瘤栓形成，这不仅为肿瘤细胞着床提供有利条件，也有助于肿瘤细胞躲避机体免疫系统的识别；在机体凝血功能异常的情况下，肿瘤细胞能释放血管紧张素、组胺、缓激肽等化学介质，增强血管壁通透性，促进肿瘤细胞活动，使肿瘤细胞易于穿过血管。癌栓内的这种聚合形式和恶性疾病的高凝状态都为转移肿瘤细胞成功构架桥梁.阻断这些环节可能延缓或减少肿瘤细胞转移。因而抗凝药物具有抗肿瘤作用引起了人们的注意。蛇毒提取物中诸如解离素及一些其他酶类物质受到了相当关注。其中解离素(disintegrin)又称去整合素，因能竞争性结合整合素而得名。其特征为富含半胱氨酸，多含有:精-甘-天冬氨酸(RGD)序列、中-亮-天冬氨酸(MLD)序列、赖-苏-丝氨酸(KTS)序列。最初，在1987年由HuangTF等人发现其有抗血小板聚集作用，并将其作为血小板聚集抑制剂来报道。解离素能与细胞表面各种整合素受体竞争性结合，抑制细胞黏附，从而影响肿瘤转移、血管生成、骨吸收等体内过程。如Pyi"koP等从南方铜头蛇毒中提取出一种相对分子质为13500的同型二聚体解离素contortrostatin，用于恶性神经胶质瘤细胞在小鼠脑的种植转移模型中，发现其表现出相当强的抑癌活性。除解离素外，也有一些蛇毒中提取出的酶类有类似疗效，国内有学者研究发现精制蝮蛇抗栓酶注射液可抑制S醒C-7721肝癌细胞的粘附能力，防治裸鼠人肝癌切除术后的转移复发。芮景等通过多年研究将从皖南尖吻蝮蛇(Agkistrodonacutus)蛇毒中提取出的蝮蛇毒抗高凝状态酶(AHCSE)用于抗肝癌实验，发现①AHCSE对BEL-7404肝癌细胞、S醒C-7721肝癌细胞具有很强的抑制作用，对L02正常肝细胞影响较小，安全有效，其机制可能为直接杀伤和诱导肝癌细胞凋亡。②将AHCSE用于荷瘤H22肝癌小鼠，其肿瘤抑制率与5-FU接近，较肝素强，且无出血倾向及体重下降等副作用。阿霉素等常用抗肿瘤药物在抗肿瘤的同时无以避免的存在骨髓抑制和免功能抑制等副作用。临床常需同时加用升白药利血生或粒细胞集落刺激因子等药物作为辅助以减少化疗药物的副反应。而近年有学者研究发现一些蛇毒提取物有改善机体免疫系统和造血系统的作用。王潮临等用口服法分别给wistar大鼠灌服蝮蛇毒和眼镜蛇毒，观察其对大鼠免疫功能的影响，结果显示这两种蛇毒及它们的混合液均有①明显提高外周血T淋巴细胞比例；②明显增强外周血中性粒细胞吞噬功能；③提高脾脏抗体形成细胞的比例；④还可降低白细胞移行抑制试验的移行指数。芮景等报导蝮蛇毒抗高凝状态酶不仅能促进肿瘤细胞凋亡，抑制肿瘤生长，且与化疗药物联合应用可协同抗癌，并可降低化疗药用量、增强疗效、减轻化疗药带来的毒副作用和不良反应，促进骨髓细胞增殖，提高外周血白细胞数，增强机体免疫功能。提取蛇毒中组分的方法有多种如根据分子量差异分离蛋白的凝胶过滤层析法，根据等电点差异分离蛋白的离子交换层析法，以及根据疏水性差异分离蛋白的疏水层析和反相蛋白层析法，根据分子结构特点的不同采用的亲合层析等。目前已分离出抗凝、抗肿瘤、镇痛等多种活性成分。在以往的蝮蛇蛇毒的分离纯化实验中，所分离得到各组分中总是难免会混杂有一定量的类凝血酶，结果常常导致在进行活性成分的筛选实验时，抗凝组分的抗凝活性往往会被类凝血酶的血液凝固效应掩盖而较少被发现。
发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种皖南尖吻蝮蛇蛇毒蛋白组分、提取方法及其应用。本发明解决技术问题的技术方案为皖南尖吻蝮蛇蛇毒蛋白组分，由分子量分别为25KDa、30KDa、50KDa的蛇毒蛋白组成。所述的蛇毒蛋白组分的蛋白含量为0.6±0.03mg/ml。皖南尖吻蝮蛇蛇毒蛋白组分的提取方法，包括以下步骤a)阴离子层析步骤、b)阳离子层析步骤、c)分子筛层析步骤。所述的a)阴离子层析步骤:将皖南尖吻蝮蛇毒粗毒溶于pH8.0±0.5的0.01±0.005mol/LTris-Hcl溶液中，6000土1000rpm离心，取上清液适量上DEAE琼脂糖凝胶FF柱，用pH8.0士0.5的0.01±0.005mol/LTris-Hcl溶液与含有0.5±0.05mol/LNaCl的0.01土0.005mol/LTris-Hcl溶液进行梯度洗脱，温度为0。C1(TC，流速为0.5±0.lml/min，5—20min收集一管，用紫外检测仪进行检测，记录层析图谱，根据图谱收集各峰洗脱液，测定各峰的抗凝活性，选取抗凝时间延长最明显的峰，收集此峰各管洗脱液，装入透析袋，脱盐浓縮得到蛇毒蛋白1，皖南尖吻蝮蛇毒粗毒与DEAE琼脂糖凝胶FF的体积(g/ml)比为1:15-25;所述的b)阳离子层析步骤将蛇毒蛋白1于6000士1000rpm离心，取上清液适量上SP琼脂糖凝胶FF柱，用pH6.7±0.5的含有0.1±0.05mol/LNaCl的0.05±0.005mol/LNaH2P04300ml的溶液与含有0.5±0.05mol/LNaCl的0.05±0.005inol/LNaH2P04溶液进行梯度洗脱，温度为(TC10。C，流速为0.5±0.lml/min，5—20min收集一管，紫外检测仪进行检测，记录层析图谱，根据图谱收集各峰洗脱液，测定各峰的抗凝活性，选取抗凝时间延长最明显的峰，收集此峰各管洗脱液，装入透析袋，脱盐浓縮得到蛇毒蛋白2，蛇毒蛋白1与SP琼脂糖凝胶FF的体积比为1:50-80;所述的c)分子筛层析步骤将蛇毒蛋白2于6000土1000rpm离心，取上清液适量上S印hadexG75柱，用生理盐水进行洗脱，温度为0°C10°C，流速为0.5±0.lml/min，5—20min收集一管，用紫外检测仪进行检测，记录层析图谱，根据图谱收集各峰洗脱液，测定各峰的抗凝活性，选取抗凝时间延长最明显的峰，收集此峰各管洗脱液，装入透析袋，脱盐浓縮得到蛇毒抗凝蛋白组分，蛇毒蛋白2与S印hadexG75干粉的体积/重量(ml/g)比为1:40-60。在a、b、c步骤中，所述的紫外检测仪的检测波长为280nm。在a、b、c步骤中，所述的抗凝活性的测量方法为APTT法。本发明选择采用对等电点接近的组分有较高分辨率的DEAES印haroseFastFlow和SPS印haroseFastFlow两种离子交换柱层析来对皖南尖吻蝮蛇毒进行分离纯化，并采用S印hadexG75柱进行分子筛过滤进一步纯化。层析时采用含0.1-0.5mol/LNaCl的高盐溶液进行梯度洗脱，有效地提高了分离能力，使峰型得到改善，便于样品的收集。通过离子交换层析以及分子筛过滤，所得出的蛇毒抗凝蛋白组分，并非是单一蛋白的组分，它是分子量和等电点相近的蛋白质或多肽的混合物。利用SDS-PAGE垂直凝胶电泳分析其组成及相关组分分子量，电泳拍照显示有三条带，提示本抗凝蛋白组分由三种成分构成，分子量分别为25KDa、30KDa、50KDa。为检测其纯度，我们应用BCA法对此组分进行了蛋白含量测定，计算得蛋白含量0.6mg/ml。说明本抗凝蛋白组分尚有待进一步纯化，以去除可能存在的多糖、脂类以及盐分等。本发明所制备的蛇毒抗凝蛋白组分作为抗肿瘤药物的应用。本发明所制备的蛇毒抗凝蛋白组分作为改善免疫系统功能药物的应用。本发明的抗肿瘤的有效剂量为4mg/kg，且高剂量(4mg/kg)疗效与阿霉素接近，其可能的抗肿瘤机制①灭活凝血因子进而抑制肿瘤细胞介导的血小板粘附和聚集；②促进肿瘤细胞坏死及诱导肿瘤细胞凋亡。本发明与现有技术相比，利用阴、阳离子层析及分子筛层析，从皖南尖吻蝮蛇毒中提取一种新的抗凝活性组分，所制备的组分具有抗肿瘤及改善免疫系统功能的作用。图1为实施例1DEAES印harosefastflow柱层析记录图谱。图2为实施例1的SPS印harosefastflow柱层析记录图谱。图3为实施例1S印hadexG75分子筛记录图谱。图4为蛇毒抗凝蛋白组分的分子量示意图。图5为0D标准曲线。在图中，41为MARKER标准泳道、42为实施例1泳道、43为实施例2泳道、44为实施例3泳道。具体实施例方式下面结合实施例对本发明作详细的说明。实施例1:皖南尖吻蝮蛇毒，购自安徽省宁国市金中蛇场。CXG-1型柱层析柜内含TH-1000型梯度混合器、DHL-A电脑恒流泵、HD-5电脑紫外检测仪、DBS-100电脑全自动部分收集器(上海沪西分析仪器厂有限公司)DEAES印liaroseFastFlow凝胶、SPSepharoseFastFlow凝胶、S印hadexG75凝胶均为瑞典法玛西亚公司生产。BCA法蛋白含量检测试剂盒为美国PIERCE公司生产。a)阴离子层析步骤将皖南尖吻蝮蛇毒粗毒1克溶于pH8.0的0.01mol/LTris-Hcl溶液中，6000rpm离心，取上清液10ml上200mlDEAE琼脂糖凝胶FF柱，用pH8.0的0.01mol/LTris-Hcl溶液与PH8.0的含有0.5mol/LNaCl的0.01mol/LTris-Hcl溶液进行梯度洗脱，温度为0。C10。C，流速为0.5ml/min，20min收集一管，用紫外检测仪在280nm进行检测，记录层析图谱，如图1所示，根据图谱收集各峰洗脱液，用APTT法测定各峰的抗凝活性，结果如表l所示，选取抗凝时间延长最明显的峰8，收集此峰各管洗脱液，装透析袋，脱盐浓縮后约3ml，得到蛇毒蛋白1;表l:<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>b)阳离子层析步骤将蛇毒蛋白1用6000rpm离心，取上清液约3ml上200mlSP琼脂糖凝胶FF柱，用pH6.7的含有0.lmol/LNaCl的0.05mol/LNaH2P04300ml的溶液与pH6.7的含有0.5mol/LNaCl的0.05mol/LNaH2P04溶液进行梯度洗脱，温度为(TC1(TC，流速为0.5ml/min,20min收集一管，紫外检测仪在280nm进行检测，记录层析图谱，如图2所示，根据图谱收集各峰洗脱液，用APTT法测定各峰的抗凝活性，如表2所示，选取抗凝时间延长最明显的峰9，收集此峰各管洗脱液，装透析袋后，脱盐浓縮约得到2ml蛇毒蛋白2。表2:<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>F值为10.755峰9、峰10与生理盐水组比较，峰9^P值〈0.005，有统计学意义。c)分子筛层析步骤将蛇毒蛋白2于6000rpm离心，取上清液2ml上190mlSephadexG75柱，用生理盐水进行洗脱，温度为(TC10。C，流速为0.5ml/min，20min收集一管，用紫外检测仪在280nm进行检测，记录层析图谱，如图3所示，根据图谱收集各峰洗脱液，用APTT法测定各峰的抗凝活性，如表3所示，选取抗凝时间延长最明显的峰12，收集此峰各管洗脱液，装入透析袋，脱盐浓縮得到蛇毒抗凝蛋白组分。表3:<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>F值为177.338峰ll、峰12与生理盐水组比较，fP值〈0.005，有统计学意义。实施例2:a)阴离子层析步骤:将皖南尖吻蝮蛇毒粗毒1.2克溶于pH7.8的0.008mol/LTris-Hcl溶液中，5000rpm离心，取上清液约10ml上220mlDEAE琼脂糖凝胶FF柱，用pH7.8的0.008mol/LTris-Hcl溶液与含有0.45mol/LNaCl的0.008mol/LTris-Hcl溶液进行梯度洗脱，温度为(TC1(TC，流速为0.4ml/min，20min收集一管，用紫外检测仪在2S0nm进行检测，记录层析图谱，根据图谱收集各峰洗脱液，用APTT法测定各峰的抗凝活性，选取抗凝时间延长最明显的峰，收集此峰各管洗脱液，装入透析袋，脱盐浓縮得到蛇毒蛋白1;b)阳离子层析步骤将蛇毒蛋白12ml于5000rpm离心，取上清液2ml上200mlSP琼脂糖凝胶FF柱，用pH6.8的含有0.08mol/LNaCl的0.045mol/LNaH2P04300ml的溶液与含有0.45mol/LNaCl的0.045mol/LNaH2P04溶液进行梯度洗脱，温度为CrCl(TC，流速为0.4ml/min，20min收集一管，紫外检测仪在280nm进行检测，记录层析图谱，根据图谱收集各峰洗脱液，用APTT法测定各峰的抗凝活性，选取抗凝时间延长最明显的峰，收集此峰各管洗脱液，装入透析袋，脱盐浓縮得到蛇毒蛋白2。c)分子筛层析步骤将蛇毒蛋白2于5000rpm离心，取上清液2ml上200mlS印hadexG75柱，用生理盐水进行洗脱，温度为(TC1(TC，流速为0.4ml/min，20min收集一管，用紫外检测仪在280nm进行检测，记录层析图谱，根据图谱收集各峰洗脱液，用APTT法测定各峰的抗凝活性，选取抗凝时间延长最明显的峰，收集此峰各管洗脱液，装入透析袋，脱盐浓縮得到蛇毒抗凝蛋白组分。实施例3:a)阴离子层析步骤:将皖南尖吻蝮蛇毒粗毒0.9克溶于pH8.1的0.012mol/LTris-Hcl溶液中，6500rpm离心，取上清液10ml上180mlDEAE琼脂糖凝胶FF柱，用pH8.1的0.012mol/LTris-Hcl溶液与含有0.55mol/LNaCl的0.012mol/LTris-Hcl溶液进行梯度洗脱，温度为0。C10。C，流速为0.6ml/min，20min收集一管，用紫外检测仪在2S0nm进行检测，记录层析图谱，根据图谱收集各峰洗脱液，用APTT法测定各峰的抗凝活性，选取抗凝时间延长最明显的峰，收集此峰各管洗脱液，装入透析袋，脱盐浓縮得到蛇毒蛋白l;b)阳离子层析步骤将蛇毒蛋白l约3ml于6500rpm离心，取上清液3ml上180mlSP琼脂糖凝胶FF柱，用pH6.5的含有0.012mol/LNaCl的0.055mol/LNaH2P04300ml的溶液与含有0.55mol/LNaCl的0.055mol/LNaH2P04溶液进行梯度洗脱，温度为(TC1(TC，流速为0.6ml/min，20min收集一管，紫外检测仪在280nm进行检测，记录层析图谱，根据图谱收集各峰洗脱液，用APTT法测定各峰的抗凝活性，选取抗凝时间延长最明显的峰，收集此峰各管洗脱液，装入透析袋，脱盐浓縮得到蛇毒蛋白2。c)分子筛层析步骤将蛇毒蛋白2于6500rpm离心，取上清液约3ml上210mlS印hadexG75柱，用生理盐水进行洗脱，温度为0°C10°C，流速为0.6ml/min，20min收集一管，用紫外检测仪在280nm进行检测，记录层析图谱，根据图谱收集各峰洗脱液，用APTT法测定各峰的抗凝活性，选取抗凝时间延长最明显的峰，收集此峰各管洗脱液，装入透析袋，脱盐浓縮得到蛇毒抗凝蛋白组分。将实施例l、2、3用SDS-PAGE凝胶垂直电泳进行检测，1、取lmg抗凝组分溶解于lml蒸馏水后取10ul与10ul样品溶解液混合，10(TC煮沸5分钟，10000转/分，离心2分钟。2、配制15%分离胶(双蒸水2.3ml+30%甲叉双丙烯酰胺5ml+pH值为8.8的1.5mol/LTris-Hcl溶液2.5ml+10%SDS0.lml+10%AP0.lml+四甲基二乙胺TEMED0.004ml)和5%浓縮胶(双蒸水2.lml+30%甲叉双丙烯酰胺O.5ml+pH值为6.8的1.0mol/LTris-Hcl溶液0.38ml+10%SDS0.03ml+10%AP0.03ml+TEMED0.003ml)，检査玻璃板无漏液后灌注分离胶，静置使之凝固后灌注浓縮胶，待凝固后加样(同时加MARKER),电压设为120V，待样品压縮成线后改用180V电压，约1小时。剥胶后放入染色液中振荡过夜，出现条带后以脱色液洗涤，并拍照，记录条带，与MARKER对照后得分子量。如图4所示图中可见抗凝蛋白组分在左右四个泳道中，呈三个条带，实施例l、2、3的条带42、43、44与MARKER标准条带41对照，MARKER各条带从上到下依次为e-galactosidase牛乳糖酐酶)116.0KDa、BovineSerumalbumin(牛血清白蛋白)66.2KDa、Oualbumin(卵蛋白)45.OKDa、Lactatedegydrogenase(乳酸脱氢酶)35.OKDa、REaseBsp98125.OKDa、P-Lactoglobulin(P-乳球蛋白)18.4KDa、Lysozyme(溶菌酶)14.4KDa，得知实施例l、2、3分子量分别约为25KDa、30KDa、50KDa。用BCA法测定实施例1的蛋白含量。1、根据标准品和样品数量，按50:1的比例配制BCA工作液，充分混匀，BCA工作液室温24小时稳定。2、稀释标准品取10ul标准品用PBS稀释至100ul，终浓度为2mg/ml，将标准品按0，1，2，4,8，12，16，20ul加到96孔板，补PBS到20ul;3、加适当体积样品到96孔板，补PBS到20ul;4、冷却至室温，用酶标仪测定A562，根据曲线计算出蛋白质浓度。5、统计学分析所得计量资料均用Y±s表示，采用SPSS统计软件包处理。各实验组与对照组吸光度值的比较应用单因素方差分析(One-wayANOVA)和独立样本t检验，以P〈0.05认为差异有显著性。根据酶标仪测得OD值，用软件CurveExpert1.3绘制标准曲线如图5所初始样品(即峰12，洗脱液冻干后所得白色粉末)浓度为1mg/ml，所对应OD值为0.3696，根据标准曲线，计算得样品蛋白终浓度即蛇毒抗凝蛋白组分的蛋白含量为0.6mg/ml。实施例1的抗肿瘤及免疫功能试验。试验方法1、分组取36只雌性BALB/cA裸小鼠，日龄35-40天，体重18-22g，随机分成5组A组空白对照组，12只；B组阿霉素(ADM)(浙江海正药业股份有限公司组，6只；C组实施例l高剂量组，6只；D组实施例1中剂量组，6只；E组实施例l低剂量组，6只。2、实验方法取生长旺盛期的人肝癌BEL-7402瘤组织剪切成1.511皿3左右，在无菌条件下，接种于裸小鼠右侧腋窝皮下。裸小鼠移植瘤用游标卡尺测量移植瘤直径，待肿瘤生长至100300咖3后将动物随机分组。使用测量瘤径的方法，动态观察被试物抗肿瘤的效应。肿瘤直径的测量次数为每周3次，每次测量同时还需称鼠重。蛇毒抗凝蛋白组分尾静脉给药，给药剂量分别为4mg/kg、2mg/kg、lmg/kg，每周3次。阳性对照组阿霉素每周尾静脉给药3次，剂量取小鼠半数致死量的1/4作为实验剂量，空白对照组同时给等量生理盐水。连续观察21天。3、标本采集将动物处死后剥取肿瘤及脾脏，10%中性福尔马林溶液保存固定24小时，石蜡包埋、切片，HE染色并按即用型SABC免疫组化染色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)操作4、抗肿瘤观测指标及计算方法(1)肿瘤体积(tumorvolume，TV)，计算公式为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>其中a、b分别表示长宽。(2)相对肿瘤体积(relativetumorvolume,RTV)，计算公式为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>其中TVO为分笼给药时(即dO)肿瘤体积，TVt为每一次测量时的肿瘤体积。(3)相对肿瘤增殖率T/C(%)，计算公式为<formula>formulaseeoriginaldocumentpage16</formula>TRTV:治疗组RTV;CRTV:阴性对照组RTV。试验结果以相对肿瘤增殖率T/C(%)作为抗肿瘤活性的评价指标。5、免疫组化观测指标及计算方法caspase-9(武汉博士德生物工程有限公司)和CD3(武汉博士德生物工程有限公司)阳性细胞均以背景清晰、细胞浆和(或)细胞膜出现棕红色为阳性。免疫组化评分(immunohistochemicalscoresIHS)方法见参照文献(40)，结合阳性细胞百分比及阳性细胞染色强弱两个方面评分:a为阳性细胞百分比(无阳性细胞=0，阳性细胞占1-10%=1，1卜50%=2，51-80%=3，81-讓二4)，b为阳性细胞染色强弱(阴性=0，弱阳性=1，中度阳性=2，强阳性=3)，a，b两项乘积即为该例组织的IHS。6、统计学处理统计描述用均数土标准差表示，应用SPSS10.0统计软件，多组间差异用单因素方差分析，均数间两两比较用q检验。以P〈0.05为检验水准。7、实施例1所制备的蛇毒抗凝蛋白组分对人肝癌BEL-7402的治疗结果如表4所示表4:<table>complextableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>d0:分笼给药时间*:P<0.05表4显示蛇毒抗凝组分尾静脉给药4mg/kg对人肝癌BEL-7402裸小鼠移植瘤有较强的生长抑制作用，最好T/CW。)为46.75,尾静脉给药2mg/kg和lmg/kg对人肝癌BEL-7402裸小鼠移植瘤无生长抑制作用，最好T/C(0分别为68.75和97.24。ADM尾静脉给药2mg/kg对人肝癌BEL-7402裸小鼠移植瘤有较强的生长抑制作用，最好T/C(y。)为47.49，具有明确的抗肝癌效果蛇毒抗凝组分尾静脉给药4mg/kg动物出现明显毒性，死亡3只；蛇毒抗凝组分尾静脉给药2mg/kg动物出现明显毒性，死亡4只；蛇毒抗凝组分尾静脉给药lmg/kg动物出现明显毒性，死亡4只；ADM尾静脉给药2mg/kg动物出现明显毒性，死亡2只；生理盐水组，死亡4只。8、实施例l所制备的蛇毒抗凝蛋白组分免疫功能结果8.1肿瘤组织经石蜡切片后，HE染色，高倍镜(X400)下观察，可见生理盐水组肿瘤细胞呈弥漫性团块状分布，团块之间部分为肿瘤性坏死组织，肿瘤细胞呈圆形、椭圆型，短梭形，部分呈条索状排列，细胞核浓染、大，染色质增多，可见核分裂像。阿霉素组肿瘤细胞呈弥漫性巢团状分布，癌巢之间坏死区域明显增多，癌细胞崩解较多见，亦可见凋亡小体。细胞核大小不一，可见巨核，异型性大。蛇毒低剂量组与生理盐水组未见明显差异。蛇毒中剂量组肿瘤细胞凋亡增多，坏死增加，部分质膜破裂，核碎裂、核溶解，坏死组织周围炎性细胞较少。蛇毒高剂量组细胞坏死区域明显扩大，瘤细胞崩解明显，凋亡现象较多见。免疫组化结果显示生理盐水对照组及阿霉素组也可见少量阳性细胞。蛇毒组尤以高剂量组阳性细胞显著增多经统计学分析后与生理盐水组差异显著(P<0.05),见表5。表5各组caspase-9阳性表达<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>注*P〈0.05，与生理盐水组比较本发明采用免疫组化法检测肿瘤组织中caspase-9的表达，阳性细胞在细胞质中显色为棕色颗粒。结果显示阿霉素组及蛇毒组caspase-9阳性表达均明显高于生理盐水对照组，经统计学处理有显著性差异(P<0.05),而阿霉素组中caspase-9阳性表达偏低。表明本抗凝蛋白组分可能通过激活caspase-9诱导人肝癌细胞凋亡抑制癌瘤生长，与阿霉素抗肿瘤机制不同。8.2荷瘤裸小鼠脾脏石蜡切片HE染色及免疫组化观察裸鼠脾脏切片HE染色，低倍镜(X100)下观察，可见生理盐水组脾脏红髓与白髓界限清楚，淋巴细胞分化成熟。而阿霉素组白髓数目明显减少，红髓白髓分界不清。蛇毒组尤其是高剂量组白髓面积明显增多，红髓相对较少。免疫组化结果显示高倍镜(X400)下观察白髓内CD3阳性表达细胞数量均有不同。阿霉素组CD3阳性表达较生理盐水组明显减少，蛇毒组CD3阳性表达细胞数明显增多，尤以高浓度组最为显著(图22图26)，经统计学分析与阿霉素组有显著性差异(P〈0.05)，而与生理盐水组无差异(P>0.05)见表6。表6<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>注*P〈0.05，与阿霉素组比较；AP〈0.05，与生理盐水组比较。、蛇毒抗凝蛋白组分对荷瘤裸小鼠免疫功能的影响及意义。本发明结果显示蝮蛇毒抗凝蛋白组分可能通过上调CD3阳性表达的T细胞数量从而改善荷瘤裸小鼠的免疫功能。权利要求1.皖南尖吻蝮蛇蛇毒蛋白组分，其特征在于由分子量分别为25KDa、30KDa、50KDa的蛇毒蛋白组成。2、根据权利要求l所述的皖南尖吻蝮蛇蛇毒蛋白组分，其特征在于所述的蛇毒蛋白组分的蛋白含量为0.6±0.03mg/ml。3、权利要求1所述的皖南尖吻蝮蛇蛇毒蛋白组分的提取方法，其特征在于包括以下步骤a)阴离子层析步骤、b)阳离子层析步骤、c)分子筛层析步骤。4、根据权利要求3所述的皖南尖吻蝮蛇蛇毒蛋白组分的提取方法，其特征在于所述的a)阴离子层析步骤将皖南尖吻蝮蛇毒粗毒溶于pH8.0土0.5的0.Ol土O.005mol/LTris-Hcl溶液中，6000士1000rpm离心，取上清液适量上DEAE琼脂糖凝胶FF柱，用pH8,0±0.5的0,01±0.005mol/LTris-Hcl溶液与含有0.5±0.05mol/LNaCl的0.01士0.005mol/LTris-Hcl溶液进行梯度洗脱，温度为0。C1(TC，流速为O.5±0.lml/min,5—20min收集一管，用紫外检测仪进行检测，记录层析图谱，根据图谱收集各峰洗脱液，测定各峰的抗凝活性，选取抗凝时间延长最明显的峰，收集此峰各管洗脱液，装入透析袋，脱盐浓縮得到蛇毒蛋白1，皖南尖吻蝮蛇毒粗毒与DEAE琼脂糖凝胶FF的体积(g/ml)比为1:15-25。5、根据权利要求3所述的皖南尖吻蝮蛇蛇毒蛋白组分的提取方法，其特征在于所述的b)阳离子层析步骤将蛇毒蛋白1于6000士1000rpm离心，取上清液适量上SP琼脂糖凝胶FF柱，用p朋.7±0.5的含有0.1±0.05mol/LNaCl的0.05±0.005mol/LNaH2P04300ml的溶液与含有0.5±0.05mol/LNaCl的0.05±0.005mol/LNaH2P(V溶液进行梯度洗脱，温度为0。C10。C，流速为0.5土0.1ml/min，5—20min收集一管，紫外检测仪进行检测，记录层析图谱，根据图谱收集各峰洗脱液，测定各峰的抗凝活性，选取抗凝时间延长最明显的峰，收集此峰各管洗脱液，装入透析袋，脱盐浓縮得到蛇毒蛋白2，蛇毒蛋白1与SP琼脂糖凝胶FF的体积比为1:50-80。6、根据权利要求3所述的皖南尖吻蝮蛇蛇毒蛋白组分的提取方法，其特征在于所述的c)分子筛层析步骤将蛇毒蛋白2于6000士1000rpm离心，取上清液适量上S印hadexG75柱，用生理盐水进行洗脱，温度为0'C10。C，流速为0.5±0.lml/min，5—20min收集一管，用紫外检测仪进行检测，记录层析图谱，根据图谱收集各峰洗脱液，测定各峰的抗凝活性，选取抗凝时间延长最明显的峰，收集此峰各管洗脱液，装入透析袋，脱盐浓縮得到蛇毒抗凝蛋白组分，蛇毒蛋白2与S印hadexG75干粉的体积/重量(ml/g)比为1:40-60。7、根据权利要求4、5或6所述的皖南尖吻蝮蛇蛇毒蛋白组分的提取方法，其特征在于在a、b、c步骤中，所述的紫外检测仪的检测波长为280nm。8、根据权利要求4、5或6所述的皖南尖吻蝮蛇蛇毒蛋白组分的提取方法，其特征在于在a、b、c步骤中，所述的抗凝活性的测量方法为APTT法。9、权利要求1所述的蛇毒抗凝蛋白组分作为抗肿瘤药物的应用。10、权利要求1所述的蛇毒抗凝蛋白组分作为改善免疫系统功能药物的应用。全文摘要本发明公开了皖南尖吻蝮蛇蛇毒蛋白组分、提取方法及其应用，所述的皖南尖吻蝮蛇蛇毒蛋白组分，由分子量分别为25KDa、30KDa、50KDa的蛇毒蛋白组成。本发明的提取方法包括a)阴离子层析步骤、b)阳离子层析步骤、c)分子筛层析步骤。本发明与现有技术相比，利用阴、阳离子层析及分子筛层析，从皖南尖吻蝮蛇毒中提取一种新的抗凝活性组分，所制备的组分具有抗肿瘤及改善免疫系统功能的作用。文档编号A61P37/00GK101367871SQ200810024829公开日2009年2月18日申请日期2008年5月7日优先权日2008年5月7日发明者吉兆宁,晔张,张正明,景芮,谢海棠,陈冬云申请人:景芮