专利名称：蒽环类药物纳米制剂及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及阿霉素等蒽环类药物的一种纳米新 制剂及其制备方法。二、 背景技术阿霉素等蒽环类药物是临床最常用的抗肿瘤药物。其作用机制主要是其分子 的蒽环平面结构插入到DNA分子双链结构中，影响DNA的功能，抑制DNA复制和 RNA转录，从而抑制肿瘤的增殖，为细胞周期非特异性药物。其特点主要有抗癌 谱广，化疗指数高等。但是其除了存在骨髓抑制、恶心、呕吐、口炎、脱发、高 热、出血症状、静脉炎和皮肤色素沉着等毒副反应外，还存在剂量依赖的心脏毒 性，表现为各种心律失常，累计剂量大时还会发生心肌坏死甚至充血性心力衰竭。 这些毒副作用大大限制了该类药物的临床应用。为此，人们正在努力寻找降低该 类毒性的有效办法，包括开发的新剂型，大分子修饰，联合用药等等。而蒽环类 抗肿瘤药物的新纳米剂型成为一个新兴的增长点，如阿霉素脂质体等。近年来，纳米技术为药物的传输提供了新的方式和途径。药剂学中的纳米粒 可以分成两类纳米载体和纳米药物。纳米载体系指溶解或分散有药物的各种纳 米粒，如纳米脂质体、聚合物纳米囊、纳米球、聚合物胶束等。纳米药物则是指 直接将原料药物加工成的纳米粒。纳米粒在体内有延长循环时间、增加药物稳定 性，靶向性等特点，是抗肿瘤药物、抗寄生虫药物的良好载体。而纳米载体中的 纳米囊和纳米球主要由聚乳酸、聚丙交酯-乙交酯、壳聚糖、明胶等高分子材料 制备而成。可用于包裹亲水性药物。也可包裹疏水性药物。根据材料的性能，适 合于不同给药途径如静脉注射的靶向作用、肌肉或皮下注射的缓控释作用。但是，传统的纳米制剂存在着制备过程复杂，制备条件要求较高，制备要求 仪器较为昂贵，从而导致生产成本较高的缺点。另外，传统的纳米制剂还存在着 QCQA难以控制，包封率低，生物利用度低等缺点。本发明通过常温下的物理复 合，工艺简单，有效解决了传统纳米制剂的高成本，QCQA难以控制，包封率低， 生物利用度低等缺点，同时阳离子聚合物的引入， 一方面可以提高药物的利用度, 同时还为增加靶向性所进行的配体修饰提供了极大的便利。 三、发明内容本发明需要解决的问题是公开了一种阿霉素等蒽环类药物的新的纳米制剂，具体涉及蒽环类药物与阳离子化合物的有效复合，复合的媒介物质为核酸。 本发明蒽环类药物-核酸-阳离子化合物纳米颗粒的制备过程1. 将蒽环类药物和核酸按照质量比为20:1， 8:1， 4:1， 2:1， 1:1， 1:2复 合，在激发光480 nm、发射光570 nm处测试荧光强度，选择最佳的复 合比。2. 将蒽环类药物-核酸复合物与阳离子化合物按照质量比为8:l， 4:1， 2:1， 1:1， 1:2复合，进行凝胶阻滞试验，获得最佳复合比。本发明阿霉素-核酸-阳离子化合物纳米颗粒的制备方法1. 将不同的蒽环类药物与核酸按上述最佳复合比复合，震荡混匀后静置 1. 5小时，2. 将上述蒽环类药物-核酸复合物与不同的阳离子化合物按上述最佳复合 比复合，震荡混匀后即得本发明制剂。本发明蒽环类药物-核酸-阳离子化合物纳米颗粒可以用于抗肿瘤的研究，制 备抗肿瘤药物。为在S180荷瘤小鼠种瘤后五天局部进行瘤内注射，然后每天测 量肿瘤直径。在药物治疗后两周，处死小鼠，取出肿瘤，称重比较。本发明的有益效果是改变了蒽环类药物的体内分布，有效降低了蒽环类药物 的心脏毒副作用，增强了蒽环类药物的抗肿瘤活性。同时，本法制备原料易于获 取，简单便宜，制备过程全部为常规条件下物理复合，不改变药物的性质，并能 够有效降低成本。另外，本法制备蒽环类药物新剂型包封率高，性质稳定，便于 保存和运输。 四
图1:表柔比星-DNA-阳离子化的明胶复合物的荧光光谱，曲线由上到下以此代 表表柔比星的荧光光谱图；表柔比星-DNA-阳离子化的明胶复合物的荧光光谱 图；表柔比星-DNA复合物的荧光光谱图；生理盐水的荧光光谱图。图2:柔红比星-DNA-壳聚糖复合物电泳阻滞实验图，1:第一泳道为DNA， 2: 第二泳道为柔红比星-DNA复合物，3:第三泳道为DNA-壳聚糖复合物，4:第四 泳道为柔红比星-DNA-壳聚糖复合物。图3: DNA、阳离子化的明胶和DNA-阳离子化的明胶复合物对Hela的细胞毒性结果參DNA，翻阳离子化的明胶，ADNA-阳离子化的明胶复合物。图4:表柔比星-DNA-阳离子化的明胶复合物、表柔比星对Hela的细胞毒性结果參表柔比星-DNA-阳离子化的明胶复合物，B表柔比星。图5: DNA、壳聚糖和DNA-壳聚糖复合物对HepG2的细胞毒性结果，暴DNA， ■ 壳聚糖，ADNA-壳聚糖复合物。图6:柔红比星-DNA-壳聚糖复合物、柔红比星对HepG2的细胞毒性结果參柔 红比星-DNA-壳聚糖复合物，B柔红比星。图7:多柔比星-DNA-多聚赖氨酸复合物与多柔比星的体内分布图，白柱状图多 柔比星-DNA-多聚赖氨酸复合物，斜影柱状图多柔比星。图8:伊达柔比星-DNA-多聚组氨酸复合物抑瘤实验中肿瘤大小的测量结果■生理盐水组，參单纯伊达柔比星组，A伊达柔比星-DNA-多聚组氨酸复合物组。图9:伊达柔比星-DNA-多聚组氨酸复合物抑瘤实验中肿瘤的实物照片图。图10:多柔比星-DNA-聚二甲氨基甲基丙烯酸乙酯复合物抑瘤实验中肿瘤的重量统计图。图11:多柔比星-RNA-聚二甲氨基甲基丙烯酸乙酯复合物小鼠体内毒性试验中小 鼠生存率统计图B10mg/kg体重多柔比星组，參20mg/kg体重多柔比星组，▲30mg/kg体重的多柔比星组，，相当于10mg/kg多柔比星-RNA-聚二甲氨基甲基 丙烯酸乙酯复合物组，令相当于20mg/kg多柔比星-RNA-聚二甲氨基甲基丙烯酸 乙酯复合物组，口相当于30mg/kg多柔比星-RNA-聚二甲氨基甲基丙烯酸乙酯复 合物组。图12:多柔比星-DNA-聚二甲氨基甲基丙烯酸乙酯复合物小鼠体内毒性实验中小 鼠肌酐激酶变化统计图，1号复合物组，多柔比星剂量为10mg/kg， 2号复 合物组，多柔比星剂量为20mg/kg， 3号复合物组，多柔比星剂量为30mg/kg，4号10mg/kg裸多柔比星组，5号20mg/kg裸多柔比星组，6号生理盐水组。五具体实施方式
本发明据涉及蒽环类药物与核酸的有效复合后再与阳离子化合物复合，在具 体实施过程中我们主要考查的阳离子化合物主要包括壳聚糖，聚乙烯亚胺 (polyethylenimine， PEI)、多聚赖氨酸(poly-L-lysine PLL)、多聚组氨酸、多聚精 氨酸、聚二甲氨基甲基丙烯酸乙酯(poly(2-(dimethylamino)ethyl methacrylate) ,pDMAEMA)、和阳离子化的明胶；考查的核酸包括脱氧核糖核酸 (DNA)和核糖核酸(RNA);考査的蒽环类药物主要包括柔红比星(daunorubicin， 柔红霉素，daunomycin, DNR)、多柔比星(doxorubicin, D0X, 阿霉素， adriamycin, ADM)、表柔比星(epirubicin， EPI)禾口伊达柔比星(idarubicin， 去甲氧柔红霉素，demethoxydaunorubicin， IDA)以及人工合成的米托蒽醌(mitoxatrone)。具体组合为表柔比星-DNA-阳离子化的明胶、柔红比星-DNA-壳聚糖、多柔比星-DNA-多聚赖氨酸、表柔比星-DNA-聚乙烯亚胺、伊达柔比星 -DNA-多聚组氨酸、米托蒽醌-DNA-多聚精氨酸、多柔比星-DNA-聚二甲氨基甲基 丙烯酸乙酯，下面是具体的实施过程。1. 蒽环类药物-核酸-多聚阳离子复合物的制备(一) 按文献报道方法合成阳离子化的明胶，称取10mg表柔比星配成10mg/ml的表柔比星生理盐水溶液，称取10mgDNA配成10mg/ml DNA生理盐水溶液，称取 20mg的阳离子化的明胶配制成20mg/ml阳离子化的明胶生理盐水溶液。将上述 表柔比星生理盐水溶液和DNA生理盐水溶液按照1.1: l混合，振荡，室温静置 30min.将上述混和溶液与阳离子化的明胶的生理盐水溶液按照l: 2.5混合。充 分振荡，室温静置30min，即得本发明制剂表柔比星-DNA-阳离子化的明胶复合 物。具体质量控制可见附图1表柔比星-DNA-阳离子化的明胶复合物的荧光光谱 图。2. 蒽环类药物-核酸-多聚阳离子复合物的制备(二)称取10mg柔红比星配成10mg/ml的柔红比星生理盐水溶液，称取10mgDNA 配成10mg/ml DNA生理盐水溶液，称取20mg的壳聚糖配制成20mg/ml壳聚糖生 理盐水溶液。将上述柔红比星生理盐水溶液和DNA生理盐水溶液按照1: 1混合，振荡，室温静置30min.将上述混和溶液与壳聚糖的生理盐水溶液按照1: 3混合。 充分振荡，室温静置30min，即得本发明制剂柔红比星-DNA-壳聚糖复合物。具 体质量控制可见附图2柔红比星-DNA-壳聚糖复合物电泳阻滞实验图
3. 蒽环类药物-核酸-多聚阳离子复合物的制备(三)称取10mg多柔比星配成10mg/ml的多柔比星生理盐水溶液，称取10mgDNA 配成10mg/mlDNA生理盐水溶液，称取20mg的多聚赖氨酸制成20mg/ml多聚赖氨 酸生理盐水溶液。将上述多柔比星生理盐水溶液和DNA生理盐水溶液按照1: 1 混合，振荡，室温静置30min.将上述混和溶液与多聚赖氨酸的生理盐水溶液按 照l: 1.5混合。充分振荡，室温静置30min，即得本发明制剂多柔比星-DNA-多 聚赖氨酸复合物。
4. 蒽环类药物-核酸-多聚阳离子复合物的制备(四)称取10mg表柔比星配成10mg/ml的表柔比星生理盐水溶液，称取10mgDNA 配成10mg/ml DNA生理盐水溶液，称取20mg的聚乙烯亚胺配制成20mg/ml聚乙 烯亚胺生理盐水溶液。将上述表柔比星生理盐水溶液和DNA生理盐水溶液按照 1.1: l混合，振荡，室温静置30min.将上述混和溶液与聚乙烯亚胺的生理盐水 溶液按照l: 2.5混合。充分振荡，室温静置30min，即得本发明制剂表柔比星 -DNA-聚乙烯亚胺复合物。
5. 蒽环类药物-核酸-多聚阳离子复合物的制备(五)称取10mg伊达柔比星配成10mg/ml的伊达柔比星生理盐水溶液，称取 10mgDNA配成10mg/ml DNA生理盐水溶液，称取20mg的多聚组氨酸配制成20mg/ml 多聚组氨酸生理盐水溶液。将上述表柔比星生理盐水溶液和DNA生理盐水溶液按 照l.l: l混合，振荡，室温静置30min.将上述混和溶液与多聚组氨酸的生理盐 水溶液按照l: 3. l混合。充分振荡，室温静置30min，即得本发明制剂伊达柔 比星-DNA-多聚组氨酸复合物。下面是伊达柔比星-DNA-多聚组氨酸复合物的Zeta 电位结果。DNA/IDADNA/多聚组氨酸DNA/IDA/多聚组氨酸粒径无238nm ± 38nm286nm ± 65nmZeta电位无18.9mv土5.2mv26.7mv ± 7.5mv6. 蒽环类药物-核酸-多聚阳离子复合物的制备(六)称取10mg米托蒽醌配成10mg/ml的米托蒽醌生理盐水溶液，称取10mgDNA 配成10mg/ml DNA生理盐水溶液，称取20mg的多聚精氨酸配制成20mg/ml多聚 精氨酸生理盐水溶液。将上述米托蒽醌生理盐水溶液和DNA生理盐水溶液按照 1.1: l混合，振荡，室温静置30min.将上述混和溶液与多聚精氨酸的生理盐水 溶液按照1: 2混合。充分振荡，室温静置30min，即得本发明制剂米托蒽醌-DNA-多聚精氨酸复合物。7. 蒽环类药物-核酸-多聚阳离子复合物的制备(七)称取10mg多柔比星配成lOmg/ml的多柔比星生理盐水溶液，称取lOmgRNA 配成10mg/ml DNA生理盐水溶液，称取20mg的聚二甲氨基甲基丙烯酸乙酯制成 20mg/ml聚二甲氨基甲基丙烯酸乙酯生理盐水溶液。将上述多柔比星生理盐水溶 液和DNA生理盐水溶液按照1: l混合，振荡，室温静置30min.将上述混和溶液 与聚二甲氨基甲基丙烯酸乙酯的生理盐水溶液按照l: 5混合。充分振荡，室温 静置30min，即得本发明制剂多柔比星-DNA-聚二甲氨基甲基丙烯酸乙酯复合物。8. 表柔比星-DNA-阳离子化的明胶复合物对人宫颈癌细胞Hela生长的抑制按lxlO"孔的密度将处于对数生长期的Hela细胞分别传至96孔板上，加100 Hi 1640培液(10%血清+双抗)，贴壁培养24h;取阳离子化的明胶、DNA、阳 离子化的明胶-DNA复合物、表柔比星和阳离子化的明胶-DNA-表柔比星复合物， 分别用培液稀释成预先设定的浓度梯度，每孔加入100pl，置37'C孵箱培养；设 定时间后终止培养，用MTT法测定细胞活性。图3表明，经过24 h作用后，DNA、 阳离子化的明胶、阳离子化的明胶-DNA复合物对Hela细胞基本没有毒性，尤 其是阳离子化的明胶-DNA复合物。图4表明，与细胞一起培育48h后，阳离子 化的明胶-DNA-表柔比星复合物对Hela有一定的抑制作用，其细胞毒性低于表 柔比星，而当浓度达100^ig/ml时，其毒性与表柔比星相当。这是因为阿霉素是 从阳离子化的明胶-DNA-表柔比星复合物逐步释放出来的，因而浓度低时阳离子 化的明胶-DNA-表柔比星复合物对细胞的毒性不如表柔比星，而当浓度高达100 pg/ml时，阳离子化的明胶-DNA-表柔比星复合物中阿霉素的释放量也足以杀灭 大部分癌细胞。9.柔红比星-DNA-壳聚糖复合物对人肝癌细胞H印G2生长的抑制按1><104/孔的密度将处于对数生长期的HepG2细胞分别传至96孔板上，加 100 ^ 1640培液(10%血清+双抗)，贴壁培养24h;取壳聚糖、DNA、 DNA-壳 聚糖复合物、柔红比星和柔红比星-DNA-壳聚糖复合物，分别用培液稀释成预先 设定的浓度梯度，每孔加入100pl，置37'C孵箱培养；设定时间后终止培养，用 MTT法测定细胞活性。图5表明，经过24h作用后，DNA、壳聚糖、DNA-壳聚 糖复合物对HepG2基本没有毒性，尤其是DNA-壳聚糖复合物。图6表明，与细 胞一起培育48h后，柔红比星-DNA-壳聚糖复合物对HepG2有抑制作用，其细 胞毒性低于柔红比星，而当浓度达100pg/ml时，其毒性与柔红比星相当。这是 因为阿霉素是从柔红比星-DNA-壳聚糖复合物逐步释放出来的，因而浓度低时柔 红比星-DNA-壳聚糖复合物对细胞的毒性不如柔红比星，而当浓度高达100吗/ml 时，柔红比星-DNA-壳聚糖复合物中阿霉素的释放量也足以杀灭大部分癌细胞。10. 多柔比星-DNA-多聚赖氨酸复合物与多柔比星在荷瘤小鼠体内的分布实验 将小鼠肉瘤Sarcoma 180细胞以2.4xl(^个/只接种到18—22克ICR小鼠腋窝皮下，七天后由尾静脉注射2mg/ml多柔比星和多柔比星-DNA-多聚赖氨酸复 合物100ul， 24小时后杀鼠，取血、肝、肺、肾、心、脾、瘤，匀浆，荧光分析 多柔比星含量。结果如图7所示，多柔比星-DNA-聚二甲氨基甲基丙烯酸乙酯复 合物在心脏中的分布明显比多柔比星低得多，从而有效的降低了多柔比星的心脏 毒性，并且在肝脾和肿瘤中的分布明显高于单纯的多柔比星，在体内获得了更长 的停留时间。11. 伊达柔比星-DNA-多聚组氨酸复合物用于抗肿瘤的研究将肉瘤Sarcoma 180细胞以2.4x 106个/只接种到18—22克ICR小鼠腋窝皮下， 5天后实体瘤尺寸约达到250mm3，此时把小鼠随机分组，每组十只。 一次性在 瘤内注射伊达柔比星和伊达柔比星-DNA-多聚组氨酸，剂量为10 mg伊达柔比星 /kg，阴性对照组注射等量的生理盐水。用游标卡尺测量各只小鼠瘤体的长短径， 按公式V-l/2^a吓、其中a和b分别代表肿瘤的长径和短径)计算肿瘤的体积。， 两周后，处死小鼠，钝性分离肿瘤组织，称量实重。另外还通过测量瘤体尺寸、 体重和存活数来评价抗肿瘤作用。如图8，9所示，注射药物14天后，与阴性对照组相比，伊达柔比星和伊达柔比星-DNA-多聚组氨酸复合物对小鼠的抑瘤率分别是87.5%和93.7%。伊达柔比星 -DNA-多聚组氨酸复合物比阳性对照组伊达柔比星具有更好的抑瘤作用。12. 多柔比星-DNA-聚二甲氨基甲基丙烯酸乙酯复合物用于抗肿瘤的研究 将肉瘤Sarcoma 180细胞以2.4xl(^个/只接种到18—22克ICR小鼠腋窝皮下，5天后实体瘤尺寸约达到250mm3，此时把小鼠随机分组，每组十只。 一次性在 瘤内注射多柔比星和多柔比星-DNA-聚二甲氨基甲基丙烯酸乙酯复合物，剂量为 10 mg多柔比星/kg，阴性对照组注射等量的生理盐水。用游标卡尺测量各只小 鼠瘤体的长短径，按公式￥=1/2*&化2(其中&和b分别代表肿瘤的长径和短径) 计算肿瘤的体积。两周后，处死小鼠，钝性分离肿瘤组织，称量实重。另外还通 过测量瘤体尺寸、体重和存活数来评价抗肿瘤作用。如图10所示，注射药物14 天后，与阴性对照组相比，多柔比星和多柔比星-DNA-多聚组氨酸复合物对小鼠 的抑瘤率分别是83.0%和92.7%。多柔比星-DNA-多聚组氨酸复合物比阳性对照 组多柔比星具有更好的抑瘤作用。13. 多柔比星-RNA-聚二甲氨基甲基丙烯酸乙酯复合物小鼠体内毒性试验 将18—22克ICR小鼠70只随机分成7组，每组10只后， 一次性经尾静脉多柔比星-RNA-聚二甲氨基甲基丙烯酸乙酯复合物、多柔比星，剂量为10mg多 柔比星/kg, 20mg多柔比星/kg ， 30mg多柔比星/kg,对照组为生理盐水100ul。 每天称量小鼠体重，计数小鼠生存数量。两周后，处死所有存活小鼠，测定血清 肌酸激酶水平。如图11和图12所示，和多柔比星相比，多柔比星-DNA-聚二甲 氨基甲基丙烯酸乙酯复合物能够明显增加小鼠的存活数，使小鼠能够耐受更大剂 量的药物；并且，多柔比星-RNA-聚二甲氨基甲基丙烯酸乙酯复合物还能有效降 低血清肌酑激酶的水平，减轻多柔比星的急慢性心脏毒性。
权利要求
1. 蒽环类药物的纳米制剂，其特征是由蒽环类药物的蒽环平面插入核酸中，核酸与阳离子化合物复合形成的纳米颗粒。
2、 根据权利要求1所述的蒽环类药物纳米制剂的制备方法，其特征是由以下步骤构成(1) 、蒽环类药物与核酸的复合将不同的蒽环类药物与核酸按最佳复合比复 合，震荡混匀后静置1.5小时；(2) 、蒽环类药物-核酸复合物与阳离子化合物的复合将上述蒽环类药物-核 酸复合物与不同的阳离子化合物按最佳复合比复合，震荡混匀后即得蒽环类药 物纳米制剂。
3、 根据权利要求1所述蒽环类药物纳米制剂，其特征是该制剂中的蒽环类药物 为柔红比星即柔红霉素或多柔比星即阿霉素或表柔比星或伊达柔比星即去甲氧 柔红霉素或人工合成的米托蒽醌及它们的各种盐类。
4、 根据权利要求l所述蒽环类药物纳米制剂，其特征是该制剂中核酸为核糖核 酸或脱氧核糖核酸。
5、 根据权利要求1所述蒽环类药物纳米制剂，其特征是该制剂中阳离子化合物 为壳聚糖或聚乙烯亚胺或多聚赖氨酸或多聚组氨酸或多聚精氨酸或聚二甲氨基 甲基丙烯酸乙酯或阳离子化的明胶或阳离子化的多糖。
6、 根据权利要求1所述蒽环类药物纳米制剂，在制备治疗肿瘤药物中用于静脉 注射，腹腔注射，动脉栓塞，瘤内注射和瘤旁注射中的应用。
全文摘要
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及阿霉素等蒽环类药物的一种纳米新制剂及其制备方法，本制剂由阿霉素等蒽环类药物、核酸和阳离子化合物组成。具体制备过程为蒽环类药物先与核酸复合，再与阳离子化合物复合形成纳米颗粒。该制剂具有降低了蒽环类药物的生理毒性而不降低其抗癌活性，具有肿瘤靶向性的特点，可以制备成治疗肿瘤的药物。
文档编号A61P35/00GK101269223SQ200810024729
公开日2008年9月24日 申请日期2008年5月12日 优先权日2008年5月12日
发明者夏苏华, 张峻峰, 磊 董, 陈江宁 申请人:南京大学