专利名称：金银花水提物在制备改善胰岛素抵抗药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物制药技术领域，具体涉及制备改善胰岛素抵抗，治疗胰岛素 抵抗综合症的药物。
二背景技术：
胰岛素抵抗是由于胰岛素的作用器官(靶器官)-主要是骨骼肌、脂肪组织 及肝脏对胰岛素的敏感性及反应性降低或丧失，因而正常量的胰岛素产生低于正 常的生理效应，或者说要达到正常生理效应需要高于正常量的胰岛素。出现胰岛 素抵抗时，为保证体内血糖达到正常水平，人体正常的胰岛B细胞往往要分泌 更多的胰岛素，来弥补单位数量胰岛素降糖能力的不足，从而保证血糖水平正常。 久而久之，B细胞功能受损，则胰岛素的分泌代偿能力下降，就会出现糖耐量低 减，甚至2型糖尿病。
随着对胰岛素抵抗研究的不断深入，人们逐渐认识到胰岛素抵抗不但能够导 致糖尿病，而且也是发生糖尿病各种并发症的病理基础。有研究表明，严格控制 血糖可以显著的降低眼睛、神经、肾脏并发症的发生率，但不能阻碍并发症的发 生和发展，尤其是心脑血管并发症。胰岛素抵抗不但是糖尿病的重要发病机制， 还与一些代谢疾病有关，这些疾病包括:中心性肥胖、糖代谢异常、2型糖尿病、 脂代谢紊乱(高甘油三酯血症和/或高密度脂蛋白降低)、高血压、微量白蛋白尿、 冠心病等，胰岛素抵抗是这些疾病的共同发病基础。人们把这些以胰岛素抵抗为 基础的各种疾病的总和，称为胰岛素抵抗综合征。因而针对 纠正胰岛素的抵抗有着重要意义。
过氧化物酶体增殖物激活受体y辅激活因子l(peroxisome proliferators-activated receptor-y coactivator-l ,PGC-1)是近年来倍受关注的辅激活因子.研究表 明,PGC-1参与适应性产热调节、肝糖异生、脂肪酸e氧化等代谢调节。生理状 态下，PGC-la与GR和HNF4ct结合促进肝糖异生，以维持空腹或长期禁食状态下 的血糖稳定。病理状态下肝脏PGC-la表达异常增高,激活糖异生关键酶(PEPCK， G6Pase， FBPase)。使肝糖输出增加，空腹血糖升高,在肝脏胰岛素抵抗的形成中
发挥了重要作用。PGC-1 a是肝糖异生的主要调节者并且是胰岛素-环腺苷一磷 酸轴的关键靶点。相反的，胰岛素抑制肝糖异生。肝脏中胰岛素通过 PI3K/PKB/FKHR调节通路负调节PGC-la表达.
金银花为忍冬科，忍冬属植物忍冬及同属植物红腺忍冬,山银花或毛花柱忍
冬的干燥花蕾或带初开的花，味甘,性寒。金银花是中医中治疗消渴症(糖尿病)
药方中的一味药.研究表明金银花单味中药及有效成分有降低血糖的作用。目前
金银花降低血糖的分子机制尚不明确。
中医理论强调"阴阳调和"，认为疾病是由于寒热失调所引起的，这些理论体
系过于抽象，缺少现代分子生物学研究支持。因此，我们运用分子生物学手段探
讨金银花提取物下调肝脏中的PGC-la ，从而抑制糖异生，降低血糖，改善胰岛
素抵抗的作用机制，为糖尿病的治疗提供新的药物研制。
发明内容
本发明需要解决的问题是利用金银花水提取物，制备改善胰岛素抵抗，降低 血糖，治疗胰岛素综合征的药物。 本发明的技术解决方案
l.本发明所述改善胰岛素抵抗，降低血糖的药物为金银花水溶性提取物，其 主要成分包括挥发油(芳樟醇、双花醇)等，有机酸(绿原酸、异绿原酸、 咖啡酸、棕榈酸等)，黄酮类、皂苷类等。
2. 金银花水提取物的制备过程将金银花按每克金银花加入20-25毫升水， 文火煎煮20分钟，药液冷却至室温，将水煎液蒸馏冻干处理，后将冻干粉 溶于蒸馏水中，密闭保存于4'C。
3. 金银花提取物在制备改善胰岛素抵抗，降低血糖治疗胰岛素抵抗综合症药 中的应用。金银花水提取物刺激ob/ob鼠肝脏PGC-1 a的表达按50g/kg 体重灌胃11 13周龄ob/ob鼠， 连续灌胃五天，第六天予ITT实验，第 七天测血糖、采取小鼠眼内眦静脉血测胰岛素，处死小鼠分离肝脏。同时 以生理盐水灌胃作为对照。实验结果提示用金银花提取物灌胃小鼠，能显 著降低ob/ob鼠肝中PGC-1 a的表达。灌胃第五天小鼠血糖较对照组明显 降低，胰岛素耐量实验显示胰岛素抵抗改善。
本发明的有益效果是为中药治疗胰岛素抵抗综合征提供了现代分子生物学
的理论依据。本发明首次阐明了金银花水提物具有降低肝脏PGC-la表达的效应、 降低血糖、改善胰岛素抵抗。目前中医和现代分子生物学的研究还没有很好的结 合起来，中药作用的调节途径和靶位点更是知之甚少。本研究室首次提出金银花 能降低病理状态肝脏中PGC-la，而对正常情况下PGC-la无影响，金银花降低 血糖可能通过降低降低肝脏中的PGC-la，下调肝糖异生的酶的生成，从而改善 胰岛素抵抗，降低血糖，可制备改善胰岛素抵抗，治疗胰岛素综合征的药物。
四
图1 金银花对ob/ob mice肝脏中PGC-1咖RNA表达水平的影响
A、提取肝脏组织中RNA,经过RT后，用Real Time PCR检测肝脏中PGC-la的
表达
P=0. 013029 〈0.05。实验组与对照组之间有显著性差异
结果金银花能降低ob/ob mice肝脏中的PGC-la mRNA水平。
图2金银花对ob/ob mice肝脏中PGC-1蛋白表达水平的影响
提取肝脏组织中总蛋白后，用W""V^检测肝脏中PGC-la蛋白水平 的表达
对照组ob/ob小鼠1-4，灌生理盐水
实验组ob/ob小鼠5-8,灌金银花水煎液浓縮物
图3为金银花提取物对ob/ob鼠血糖的影响
图4， 5为金银花提取物对ob/ob鼠胰岛素耐量实验的影响
图4给药前ob/ob小鼠胰岛素耐量实验的结果
图5为给药后ob/ob小鼠胰岛素耐量实验的结果。
五具体实施例方式
将金银花按每克加入25毫升水，文火煎煮20分钟，药液冷却至室温，将水 煎液冷干处理，后将冻干粉溶于蒸馏水中获得水提取物。灌胃小鼠，测血糖、进 行胰岛素耐量实验
用real-time PCR和Westblot方法测定PGC-la的表达，结果证明金银花提取
物可减低ob/ob鼠肝脏组织中PGC-la的表达。胰岛素耐量实验提示给予金银花 水提液可改善ob/ob鼠胰岛素抵抗 材料与来源
试剂，Trizol购自Invitrogen公司；逆转录酶和Tag酶等试剂均购于大连宝 生物工程有限公司。PGC-la抗体购自SANTA CRUZ BIOTECHNOLOGY, INC。
手术器械剪刀，弯头小镊等购自江苏思来科技有限公司。
其它器材Heidolph DIAX900匀桨器；ABI Prism 7000 Sequence Detection System PCR仪；ob/ob鼠购于南京大学模式动物中心
实施例
1.金银花水提取物的制备将金银花按每克金银花加入25毫升水，文火煎 煮20分钟，药液冷却至室温，将水煎液冷干处理，后将冻干粉溶于蒸馏水中， 密闭保存于4'C。
2. 小鼠给药及组织的分离保存实验用小鼠为SPF级的野生型雄性小鼠， 品系ob/ob鼠，11~13周龄。按50g/kg的药量灌胃给药，对照组小鼠用等体积的 生理盐水灌胃， 连续灌胃五天，第六天予ITT实验，第七天采取小鼠眼内眦 静脉血测血糖，处死小鼠分离肝脏。同时以生理盐水灌胃作为对照。生理盐水漂 洗干净，立即放于冻存管中，于液氮中保存备用。
3。 组织RNA的提取、RT-PCR和real-time PCR不同肝脏组织加适量Trizol 于HeidolphDIAX900组织匀浆器将组织充分匀浆(4档100秒)，将匀浆液转入 洁净的1.5ml离心管中，室温放置5分钟后，12000g， 4"C离心5分钟，取上清， 加入200u 1氯仿，强烈震荡混匀，室温放置5分钟，12000g， 4。C离心15分钟， 小心吸取上清至另一洁净的1.5ml离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀，室温 放置10分钟，12000g， 4'C离心10分钟，弃上清，75%乙醇洗涤沉淀，室温干 燥，20ixlDEPC水溶解，紫外分光法检测浓度和纯度。2ug RNA用于逆转录， 反应体系为20u 1，含2u g RNA， lmM dNTP, 1 U/u 1 RNA酶抑制剂，2. 5 pmo1/ Ul 01ig(dT)18引物，0.5 U/yl AMV逆转录酶，轻轻混匀，42°C 1小时，冰 上放置2分钟，所得cDNA可用于real-time PCR。 real-time PCR为20 ix 1反应 体系，含2u 1 cDNA， 2 mM MgCl2, 0. 2 mM dNTP,各1 pmol/ix 1上、下游引物及 相应的探针，0.025 U/ulTag酶，混匀。PCR反应条件95°C5分钟，95°C30
秒，6(TC60秒(40个循环)72。C延伸3分钟。引物序列，e-actin:上游引物 5，-ggc acc aca cct tct aca atg隱3'，下游引物5，-ggg gtg ttg aag gtc tea aac-3，， 探 针序歹'J: 5，- tgt ggc ccc tga gga gca ccc -3， ； PGC-1 ct :上游弓|物5，- tga cac aac gcg gac agaa-3，，下游弓l物5，-eggtgc att cct caatttca-3，， 探针序歹(J: 5,-tgagag accgctttgaagtttttg-3'。结果用ABI Prism 7000 SDS Software分析，见附图1， 2，3。
4. ob/ob鼠血糖变化与胰岛素耐量实验 给金银花提取液前进行胰岛素耐量试验，结果提示ob/ob鼠存在胰岛素抵抗，
血糖均高于12mmol/L，存在高血糖。给予金银花提取液五天后，血糖明显减低， 第六天给予胰岛素耐量试验，结果提示胰岛素抵抗改善，见附图4， 5。
权利要求
1.一种改善胰岛素抵抗，降低血糖的药物，其特征是金银花的水溶性提取物，其主要成分为芳樟醇、双花醇、绿原酸、异绿原酸、咖啡酸、棕榈酸、黄酮类、皂苷类。
2. 根据权利要求1所述金银花水提物的制备方法，其特征是金银花按每克金银花加入20-25毫升水，加热至沸腾，文火煎煮20分钟，药液冷却至室温， 将水煎液经过蒸馏，冻干处理后将冻干粉溶于三蒸水中，密闭保存于4'C。
3. 根据权利要求1所述金银花提取物在制备改善胰岛素抵抗，降低血糖， 治疗胰岛素综合症药中的应用。
全文摘要
本发明属于生物制药技术领域，具体涉及制备改善胰岛素抵抗，治疗胰岛素抵抗综合症的药物。本发明将金银花按每克金银花加入25毫升水，文火煎煮20分钟，药液冷却至室温，将水煎液冷干处理，后将冻干粉溶于蒸馏水中，密闭保存。按50g/kg体重灌胃11～13周龄ob/ob鼠，连续灌胃五天，第六天予ITT实验，第七天测血糖、采取小鼠眼内眦静脉血测胰岛素，处死小鼠分离肝脏。实验结果提示用金银花提取物灌胃小鼠，能显著降低ob/ob鼠肝中PGC-1α的表达。灌胃第五天小鼠血糖较对照组明显降低，胰岛素耐量实验显示胰岛素抵抗改善。本发明阐明了金银花水提取物可降低PGC-1α在肝脏中的表达，可以制备成降低胰岛素抵抗，治疗糖尿病综合症的药物。
文档编号A61P5/48GK101352475SQ20081002467
公开日2009年1月28日 申请日期2008年4月1日 优先权日2008年4月1日
发明者张红杰, 张辰宇, 菁 李, 梁湘樱, 阳 项 申请人:南京大学