专利名称：高硒诱导胰岛素抵抗动物模型的应用及构建方法
高砸诱导胰岛素抵抗动物模型的应用及构建方法技术领域
本发明属于糖尿病防治技术领域，涉及高硒诱导胰岛素抵抗动物模型的应用及构建方法。
背景技术：
动物模型的构建是医学研究中的一项很重要的技术。构建与人类发病相似的疾病模型，可以克服人类本身发生疾病潜伏期长、影响因素多、发生发展缓慢、发病机制复杂等因素的制约，更好地反应疾病发生、发展的规律，并有利于研究不便于在人类本身进行研究的疾病。常用的动物模型主要包括自发性动物模型、转基因动物模型和实验性动物模型。自发性动物模型、转基因动物模型应用价值较高，但其造模成本高、技术饲养条件要求高等特点限制了这些动物模型的普遍应用。实验性动物模型操作简单、成本低、成模率较高，目前，这类动物模型被广泛使用。
近年来，全球糖尿病患病率快速、大幅上升。1980-2010年间，美国糖尿病确诊人数从560万增加到2090万，其中65岁及以上人群中有将近27%都患有糖尿病。如果按照这样的趋势继续发展，至2050年预计美国将有1/3的成年人患有糖尿病。据美国糖尿病学会估计，2007年美国用于治疗糖尿病的医疗费用高达1740亿美元。2010年，《新英格兰医学杂志》发表的一项针对中国进行的大规模人群调查显示，20岁或20岁以上的成年人中有9240万(总人口的9.7%)患有糖尿病，此外，1482万成年人(总人口的15.5%)患有前驱糖尿病。尤其需要警惕的是，大多数糖尿病病例(60.7%)未被诊断和治疗。可见，糖尿病在中国已经达到了大规模流行的态势。与发达国家相比，中国作为一个人口众多的发展中国家，面临更大的糖尿病相关经济、社会负担。
糖尿病成为全球范围内的一个重大公共卫生问题，在群体层面及时地预防该病的发生显得尤为重要，而更加明确的防治措施需要机制研究指明预防和治疗的新方向。因此，探明糖尿病发病机制并寻找新的防治策略是一项十分紧迫的任务。
2型糖尿病患者占糖尿病总人数的90%以上，胰岛素抵抗是2型糖尿病的基本病理生理机制。胰岛素抵抗是指肝、肌肉、脂肪等胰岛素作用的靶组织，不能响应胰岛素导致胰岛素的功能减弱甚至缺失的病理状态。除2型糖尿病之外，胰岛素抵抗还与高血压、动脉粥样硬化、代谢综合征的发生发展密切相关。因此，对胰岛素抵抗的发病机制及防治研究显得尤为重要。目前，胰岛素抵抗的发病机制还不明确。
在正常的胰岛素信号传导中，胰岛素与其受体结合启动胰岛素信号，激活受体内源性蛋白酪氨酸激酶活性，导致受体细胞质一侧的酪氨酸磷酸化。激活的受体，又募集并磷酸化一系列底物分子。进而激活磷脂酰肌醇-3-激酶(Phosphoinositide-3_kinase,PI3K)/蛋白激酶B (Protein kinase B，Akt)。蛋白激酶B是胰岛素信号传导过程中的一种重要的激酶，胰岛素刺激条件下其磷酸化水平的高低常被用来作为胰岛素信号传导是否正常的指标。胰岛素抵抗发生时，胰岛素刺激的蛋白激酶B磷酸化水平明显降低。
硒是人体必需的一种微量元素，对人体健康至关重要。硒缺乏可以导致多种病症。因此，全球范围内补硒成为一种热潮。传统的观点认为硒缺乏可以导致胰岛素抵抗和2型糖尿病。然而，由于硒的治疗窗很窄，过高水平的硒对人体也可能造成负面效应。最近的一系列研究就对补硒有益健康这一传统观点提出挑战。尤其是美国的一项大规模营养干预研究发现:在12年的时间内，每天服用200 u g硒的人群比服用安慰剂的人群患2型糖尿病的几率高2倍。发明内容
本发明解决的问题在于提供高硒诱导胰岛素抵抗动物模型的应用及构建方法，能够快速、成本低的诱导胰岛素抵抗动物模型，克服了没有相关动物模型对高硒相关胰岛素抵抗机制的研究和相关药物的开发的限制。
本发明是通过以下技术方案来实现:
高硒诱导胰岛素抵抗动物模型的应用，所述的高硒为每天按照IOOiI g/kg 200 V- g/kg的用量给予。
所述高硒诱导血糖水平升高的诱导胰岛素抵抗动物模型。
所述高硒诱导蛋白激酶B磷酸化水平降低的诱导胰岛素抵抗动物模型。
所述高硒诱导磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶和葡萄糖6磷酸脱氢酶表达升高的诱导胰岛素抵抗动物模型。
一种胰岛素抵 抗动物模型的构建方法，包括以下步骤:
I)选用SD大鼠，清洁级，雄性，体重180±20g，动物自由摄食饮水；
2)对选用的SD大鼠每天灌胃IOOii g/kg 200li g/kg的硒,6周后得到胰岛素抵抗动物模型。
所述每天灌胃相应含量的含硒化物。
所述对选用的SD大鼠每天灌胃219 ii g/kg 438 U g/kg的亚硒酸钠。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果:
鉴于目前还没有高硒诱导胰岛素抵抗的动物模型，本发明提供的高硒诱导胰岛素抵抗动物模型的应用及构建方法，能够诱导胰岛素抵抗动物模型，克服了没有相关动物模型对高硒相关胰岛素抵抗机制的研究和相关药物的开发的限制；而且其具有造模方法简单、成模率高、造模周期短。成本低以及重现性好的优势。
本发明方法的特点为使用高硒诱导糖脂代谢紊乱，通过高硒诱导糖脂代谢紊乱，进而诱导胰岛素抵抗的发生。应用本方法构建的胰岛素抵抗动物模型具有与人类高硒胰岛素抵抗相似的特征表现，是研究胰岛素抵抗和2型糖尿病发病机制以及进行防治药物筛选的理想模型。
本发明提供的高硒诱导胰岛素抵抗动物模型的应用及构建方法，所诱导的动物模型与对照相比，模型组动物糖耐量和胰岛素耐量与正常对照组动物有显著差异，模型组动物胰岛素刺激的蛋白激酶B磷酸化水平显著降低，模型组糖异生关键酶表达显著升高，表明模型组动物已经发生明显的胰岛素抵抗，而且有利于以这些作为筛选依据进行相关药物的筛选。
图1为腹腔注射葡萄糖耐量测试中血糖水平检测结果图2为胰岛素耐量试验中各时间点血糖水平检测结果图3为胰岛素刺激的蛋白激酶B磷酸化水平检测结果图4为模型组磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶和葡萄糖6磷酸脱氢酶检测结果图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。
本发明每天按照IOOii g/kg 200li g/kg的用量给予,从而进行诱导；通过高硒诱导糖脂代谢紊乱，进而诱导胰岛素抵抗的发生。应用本方法构建的胰岛素抵抗动物模型具有与人类高硒胰岛素抵抗相似的特征表现。
所构建的胰岛素抵抗动物模型的测定结果表明:模型组动物糖耐量和胰岛素耐量与正常对照组动物有显著差异，模型组动物胰岛素刺激的蛋白激酶B磷酸化水平显著降低，模型组糖异生关键酶表达显著升高，表明模型组动物已经发生明显的胰岛素抵抗。
下面给出具体的构建过程及检测结果。
1、实验仪器
血糖测定仪(美国强生公司)、精密电子天平、灌胃针等。
2、实验动物与材料
2.1构建动物
SD大鼠，清洁级，雄性，体重180±20g，分别标记；由第四军医大学实验动物中心提供。
2.2构建材料
亚硒酸钠、生理盐水、苦味酸、血糖试纸、胰岛素、葡萄糖。
3、构建方法
45只SD大鼠随机分为正常对照组和低剂量亚硒酸钠和高剂量亚硒酸钠组，各15只。分别以219 g/kg、438 g/kg的剂量灌胃亚硒酸钠(生理盐水溶解)，对照组灌胃等量饮用水。连续6周后，得到动物模型。
正常对照组和模型组各取8只动物，进行包括测定腹腔注射糖耐量、胰岛素耐量水平以及胰岛素刺激的蛋白激酶B的磷酸化水平和糖异生关键酶表达水平的验证实现。
血糖水平采用常规方法进行测定。
腹腔注射葡萄糖耐量试验(Intraperitonealglucose tolerance test, IPGTT)的试验方法为:分别将正常对照组和模型组动物禁食6小时，测定空腹血糖值，以100mg/ml葡萄糖溶液腹腔注射，葡萄糖用量为lg/kg体重，分别于30分钟、60分钟、120分钟测定各组动物的血糖值。以各个时间点的血糖值做糖耐量曲线，对模型组和正常对照组各时间点进行t检验，进行统计分析。
胰岛素耐量试验(Insulin tolerance test, ITT)的试验方法为:分别将正常对照组和模型组动物禁食4小时，测定空腹血糖值，腹腔注射胰岛素，注射剂量为0.75U/kg体重，分别于30分钟、60分钟、120分钟测定各组动物的血糖值。以各个时间点的血糖值做胰岛素耐量曲线， 对模型组和正常对照组各时间点进行t检验，进行统计分析。
胰岛素刺激的蛋白激酶B磷酸化水平和糖异生关键酶表达水平由Western blot进行测定。正常对照组和模型组各取5只动物，以10U/kg的剂量腹腔注射胰岛素，45分钟后，处死动物，取肝脏进行Western blot试验，检测蛋白激酶B的磷酸化水平。正常对照组和模型组各取3只动物，处死，取肝脏进行Western blot试验，检测糖异生关键酶的表达水平。
上述检测结果如下:
如图1所示，腹腔注射葡萄糖耐量试验中，模型组与正常组相比，血糖水平差异显著升高。
如图2所示，胰岛素耐量试验中，模型组与正常组相比，各时间点血糖水平差异显著升高。
如图3所示，与正常对照相比，模型组胰岛素刺激的蛋白激酶B磷酸化水平明显降低。
如图4所示，与正常对照相比，模型组磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶和葡萄糖6磷酸脱氢酶表达显著升高。
可见，利用灌胃高水平亚硒酸钠诱导胰岛素抵抗动物模型是可行的，该模型可作为高硒诱导胰岛素抵抗以及2 型糖尿病的发病机制和药物作用机理研究模型。
权利要求
1.高硒诱导胰岛素抵抗动物模型的应用，所述的高硒为每天按照IOOiIg/kg 200 V- g/kg的用量给予。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，糖脂代谢紊乱，进而诱导胰岛素抵抗的发生。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，高硒诱导血糖水平升高的诱导胰岛素抵抗动物模型。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，高硒诱导蛋白激酶B磷酸化水平降低的诱导胰岛素抵抗动物模型。
5.如权利要求1所述的应用，其特征在于，高硒诱导磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶和葡萄糖6磷酸脱氢酶表达升高的诱导胰岛素抵抗动物模型。
6.一种胰岛素抵抗动物模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤: 1)选用SD大鼠，清洁级，雄性，体重180±20g，动物自由摄食饮水； 2)对选用的SD大鼠每天灌胃100u g/kg 200 u g/kg的硒，6周后得到胰岛素抵抗动物模型。
7.如权利要求5所述的胰岛素抵抗动物模型的构建方法，其特征在于，每天灌胃相应含量的含硒化物。
8.如权利要求5所述的胰岛素抵抗动物模型的构建方法，其特征在于，对选用的SD大鼠每天灌胃219 u g/kg 438 u g/kg的亚硒酸钠。
全文摘要
本发明公开了高硒诱导胰岛素抵抗动物模型的应用及构建方法，利用SD大鼠，每天灌胃100μg/kg～200μg/kg的硒，6周后得到胰岛素抵抗动物模型。对糖耐量和胰岛素耐量的统计分析、胰岛素信号传导和糖异生关键酶的测定表明利用亚硒酸钠构建的胰岛素抵抗大鼠模型是可行的，可作为高硒诱导胰岛素抵抗以及2型糖尿病的发病机制和药物作用机理的研究模型。本发明构建的胰岛素抵抗大鼠模型具有造模方法简单、成模率高、成本低、周期短、及重现性好等优点。
文档编号A61K33/04GK103211834SQ20131012607
公开日2013年7月24日 申请日期2013年4月11日 优先权日2013年4月11日
发明者王欣, 海春旭 申请人:中国人民解放军第四军医大学