专利名称：治疗和改善胰岛素抵抗的仙鹤草活性组分及其应用以及其提取方法
技术领域：
本发明涉及一种仙鹤草的活性组分，特别涉及一种治疗和改善胰岛素抵抗的仙鹤草活性组分及其应用以及其提取方法。
背景技术：
胰岛素抵抗是指胰岛素促进葡萄糖摄取和利用的效率降低，表现为外周组织尤其是肌肉、脂肪组织对葡萄糖的利用障碍，自始至终贯穿于2型糖尿病发生、发展的全过程。特别是1995年Stern提出了闻名的“共同土壤”学说，丰富了 IR的内涵，S卩肥胖、高血压、高脂血症、动脉粥样硬化、冠状动脉粥样硬化性心脏病、2型糖尿病、脑卒中等均具有共同的病理基础——胰岛素抵 抗。目前临床应用于改善和治疗胰岛素抵抗的药物主要是胰岛素增敏剂噻唑烷二酮类药物(TZDs)(如吡格列酮和罗格列酮)，其通过激活PPAR Y，进一步选择性的促进下游基因的转录，可以募集前脂肪细胞，促进其分化及在胞内积聚更多的脂质。所以此类药物往往伴随着体重增加，肥胖的副作用，也加重了心血管的危险，同时低血糖、全身性浮肿、心脏负荷、骨质疏松、癌症等也是较明显的副作用。因此，开发新型的PPAR激活剂则具有重要的经济和社会价值，而中药具多环节、多靶点、且相对安全特点，寻找和开发PPARy的选择性或不完全激活剂，可以在降低胰岛素抵抗的同时，降低因脂肪过度积累而导致的心血管疾病风险等副作用。调控前脂肪细胞分化的转录因子主要为:PPARy、ADDl/SREBP-1和C/ΕΒΡ-α。PPARy可以调控C/ΕΒΡ-α、脂质代谢关键酶、脂肪分泌蛋白、脂肪活性因子的表达从而参与脂肪细胞分化进程。AP2可调控细胞内脂肪酸的转运和合成，是外周胰岛素敏感和糖脂代谢的关键调节器。PPARy是AP2基因表达的重要调节因子，通过调节其基因启动子中的PPAR反应元件(PPRE)，增加脂肪细胞中AP2的表达，从而促进脂肪细胞的分化，但同时增加了胞内脂质的累积。因此AP2过量表达，可造成正常的脂肪代谢平衡的紊乱。研究表明，使用AP2的抑制剂和PPAR Y的激动剂均可以使外周胰岛素增敏。仙鹤草为蔷薇科多年生草本植物龙牙草(Agrimonia Pilosa Ledeb)的全草，中医主要用于治疗治咯血、吐血、便血，崩漏带下，劳伤脱力，痈肿，创伤出血等。目前对仙鹤草的化学成分的研究表明，其含有多酚、黄酮及黄酮糖苷类化合物、三萜类化合物和仙鹤草内酯等。而目前尚未有仙鹤草活性组分用于治疗和改善胰岛素抵抗的报道。
发明内容
本发明主要针对仙鹤草活性组分对胰岛素抵抗的干预，发现仙鹤草活性组分不仅对PPAR Y的激活作用与阳性对照药物吡格列酮无显著差异，可显著促进前脂肪细胞的分化；而且在激活PPARy表达的同时不像阳性对照药物吡格列酮样诱导AP2的过度表达，表明仙鹤草活性组分具有改善和治疗胰岛素抵抗的作用。本发明的一种治疗和改善胰岛素抵抗的仙鹤草活性组分，该活性组分包括仙鹤草中黄酮组分或仙鹤草三萜组分或仙鹤草黄酮组分和仙鹤草三萜组分的组合物。
进一步，所述黄酮组分及三萜组分的组合物中黄酮组分与三萜组分的质量比为4:11: 4。进一步，所述仙鹤草黄酮组分与仙鹤草三萜组分的质量比为4:1 ；进一步，所述仙鹤草黄酮组分总黄酮的质量百分比含量不低于30%，仙鹤草三萜组分总三萜的质量百分比含量不低于40% ；进一步，所述仙鹤草为蔷薇科龙牙草属植物，包括牙草、黄龙尾、疏毛龙牙草、东北朝鲜龙牙草、东北的钝齿龙、东北大兴安岭的多齿龙牙草、小花龙牙草、大花龙牙草、托叶龙牙草和欧洲的龙牙草。本发明还公开一种治疗和改善胰岛素抵抗的仙鹤草活性组分在制备治疗和改善胰岛素抵抗药物中的应用。本发明还公开一种治疗和改善胰岛素抵抗的仙鹤草活性组分的提取方法，其特征在于:包括以下步骤:a.取仙鹤草全草在温度为105-115°C下干燥至恒重并粉碎至35_45目，然后加入95%乙醇在温度为85-95°C回流提取3次后过滤，每次提取2小时，滤过，收集滤液和滤渣，将收集的滤液减压浓缩制得浸膏；
b.将步骤a中的浸膏用95%乙醇分散溶解后加入10%浸膏重量的活性炭回流2小时后过滤并收集滤液，将所收集的滤液浓缩后以样品:硅胶=1:30上硅胶柱，依次用乙酸乙酯:石油醚=1:1，乙酸乙酯:石油醚=5:1及纯乙酸乙酯洗脱，各洗脱5个柱体积，分别收集得洗脱液(I )，洗脱液(II)，洗脱液(III)；C.将洗脱液(II)和洗脱液(ΠΙ)溶于体积比为氯仿:甲醇=1:1的混合液，上LH-20凝胶柱，经薄层层析法检测分析，得到仙鹤草三萜组分和黄酮组分；d.将步骤a中的滤渣用50%的乙醇回流提取3次，每次1.5h，提取液浓缩后用60%的乙醇分散溶解，调节PH为5.0，然后缓慢加入5.0%的明胶溶液至不再产生沉淀为止，过滤除去鞣酸蛋白后再加入95%的乙醇至乙醇浓度为85%时除去过量的明胶和提取物中的蛋白及多糖，然后过滤并将滤液浓缩，制得浸膏；将该浸膏溶于80%的甲醇，上LH-20凝胶柱，经薄层层析检测分析，得到黄酮组分。e.合并步骤c和步骤d中的黄酮组分；进一步，步骤a中取仙鹤草全草在温度为110°C下干燥至恒重并粉碎至40目，然后加入95%乙醇在温度为90°C回流提取3次后过滤；进一步，步骤b中，将步骤a中的浸膏用95%乙醇分散溶解，然后加入10%浸膏重量的活性炭回流2小时后过滤并收集滤液。本发明的有益效果:本发明的治疗和改善胰岛素抵抗的仙鹤草活性组分及其应用以及其提取方法，仙鹤草的活性物质群为黄酮组分和三萜组分。通过HPLC分析得知:仙鹤草的黄酮组分中主要含有牡荆苷、异牡荆苷和木犀草素-7-0-葡萄糖苷、槲皮苷、银椴苷；仙鹤草三萜组分中主要含有熊果酸、4-羟基熊果酸、科罗索酸和齐墩果酸。针对仙鹤草活性组分对胰岛素抵抗的干预，发现仙鹤草活性组分不仅对PPAR Y的激活作用与阳性对照药物吡格列酮无显著差异，可显著促进前脂肪细胞的分化；而且在激活PPAR Y表达的同时不像阳性对照药物吡格列酮样诱导AP2的过度表达，表明仙鹤草活性组分具有改善和治疗胰岛素抵抗的作用，可以制备成相应的剂型进行预防或治疗胰岛素抵抗。
图1为仙鹤草黄酮组分(FC)的HPLC色谱图:1、牡荆苷2、异牡荆苷3、金丝桃苷4、木犀草素-7-0-葡萄糖苷5、槲皮苷8、槲皮素
9、银椴苷10、木犀草素11、芦丁 12、芹菜素13、山奈酚15、花旗松素16、儿茶素化合物6、7、14-待定；图2为仙鹤草三萜组分(TC)的HPLC色谱图:4号化合物:4_羟基熊果酸，6号化合物:马斯里酸，7号化合物:科罗羧酸，9号化合物:齐墩果酸，10号化合物:熊果酸，化合物 1、2、3、5、8 待定；图3为浓度梯度仙鹤草黄酮组分(FC)处理3T3-L1前脂肪细胞诱导分化第7天显微镜图(x200)；图4浓度梯度仙鹤草三萜组分(TC)处理3T3-L1前脂肪细胞诱导分化第7天显微镜图(x200)；图5浓度梯度仙鹤草黄酮组分(FC)处理3T3-L1前脂肪细胞诱导分化第7天油红染色图(x200)；图6浓度梯度仙鹤草三萜组分( TC)处理3T3-L1前脂肪细胞诱导分化第7天油红染色图(x200)；图7仙鹤草两个活性组分以及两个组分的不同配比组分对前脂肪细胞分化过程中三酰甘油积累的影响；图8仙鹤草黄酮组分(FC)和仙鹤草三萜组分(TC)对前脂肪细胞分化主要转录因子的基因表达的调控；图9仙鹤草黄酮组分(FC)和仙鹤草三萜组分(TC)不同配比组分对前脂肪细胞分化主要转录因子基因表达的调控；图10仙鹤草黄酮组分(FC)和仙鹤草三萜组分(TC)对前脂肪细胞分化AP2表达的调控；图11仙鹤草黄酮组分(FC)和仙鹤草三萜组分(TC)不同配比组分对前脂肪细胞AP2表达的调控。
具体实施例方式实施例一a.取仙鹤草全草1.0kg,在温度为110°C下干燥至恒重并粉碎至40目，然后加入95%乙醇在温度为90°C回流提取3次后过滤，每次提取2小时，滤过，收集滤液和滤渣，将收集的滤液减压浓缩制得浸膏140g ；b.将步骤a中的浸膏用95%乙醇分散溶解后加入10%浸膏重量的活性炭回流2小时后过滤并收集滤液，将所收集的滤液浓缩后上硅胶柱(样品:硅胶=1:30)，依次用乙酸乙酯:石油醚=1: 1，5:1及纯乙酸乙酯洗脱，各洗脱5个柱体积，分别收集得洗脱液(I )，洗脱液(II)，洗脱液(III)；C.将洗脱液(II)和洗脱液(III)溶于体积比为氯仿:甲醇=1:1的混合液，上LH-20凝胶柱，经薄层层析法检测分析，得到仙鹤草三萜组分和黄酮组分；
d.将步骤a中的滤渣用50%的乙醇回流提取3次，每次1.5h，提取液浓缩后用60%的乙醇分散溶解，调节PH为5.0，然后缓慢加入5.0%的明胶溶液至不再产生沉淀为止，过滤除去鞣酸蛋白后再加入95%的乙醇至乙醇浓度为85%时除去过量的明胶和提取物中的蛋白及多糖，然后过滤并将滤液浓缩，制得浸膏；将该浸膏溶于80%的甲醇，上LH-20凝胶柱，经薄层层析检测分析，得到黄酮组分。e.合并步骤c和步骤d中的黄酮组分。分光光度法测得仙鹤草黄酮组分(FC)的总黄酮含量为316.53±6.37mg/g，仙鹤草三萜组分(TC)的总三萜含量为415.96±5.15mg/g。将制得的仙鹤草黄酮组分(FC)和仙鹤草三萜组分(TC)以质量比为4:1常规制粒，制成胶囊、片剂或颗粒剂等。实施例二a.取仙鹤草全草1.0kg,在温度为105°C下干燥至恒重并粉碎至35目，然后加入95%乙醇在温度为85°C回流提取3次后过滤，每次提取2小时，滤过，收集滤液和滤渣，将收集的滤液减压浓缩制得浸膏；b.将步骤a中的浸膏用95%乙醇分散溶解后加入5%浸膏重量的活性炭回流2小时后过滤并收集滤液，将所收集的滤液浓缩后上硅胶柱(样品:硅胶=1:30)，依次用乙酸乙酯:石油醚=1:1，5:1及纯乙酸乙酯洗脱，各洗脱5个柱体积，分别收集得洗脱液(I )，洗脱液(II)，洗脱液(III)；C.将洗脱液(II )和洗脱液(III)溶于体积比为氯仿:甲醇=1:1的混合液，上LH-20凝胶柱，经薄层层析法检 测分析，得到仙鹤草三萜组分和黄酮组分；d.将步骤a中的滤渣用50%的乙醇回流提取3次，每次1.5h，提取液浓缩后用60%的乙醇分散溶解，调节PH为5.0，然后缓慢加入5.0%的明胶溶液至不再产生沉淀为止，过滤除去鞣酸蛋白后再加入95%的乙醇至乙醇浓度为85%时除去过量的明胶和提取物中的蛋白及多糖，然后过滤并将滤液浓缩，制得浸膏；将该浸膏溶于80%的甲醇，上LH-20凝胶柱，经薄层层析检测分析，得到黄酮组分。e.合并步骤c和步骤d中的黄酮组分。分光光度法测得仙鹤草黄酮组分(FC)的总黄酮含量为316.53±6.37mg/g，仙鹤草三萜组分(TC)的总三萜含量为415.96±5.15mg/g。将制得的仙鹤草黄酮组分(FC)和仙鹤草三萜组分(TC)以质量比为3:2常规制粒，制成胶囊、片剂、颗粒剂等。实施例三a.取仙鹤草全草1.0kg,在温度为115°C下干燥至恒重并粉碎至45目，然后加入95%乙醇在温度为90°C回流提取3次后过滤，每次提取2小时，滤过，收集滤液和滤渣，将收集的滤液减压浓缩制得浸膏；b.将步骤a中的浸膏用95%乙醇分散溶解后加入15%浸膏重量的活性炭回流2小时后过滤并收集滤液，将所收集的滤液浓缩后上硅胶柱(样品:硅胶=1:30)，依次用乙酸乙酯:石油醚=1: 1，5:1及纯乙酸乙酯洗脱，各洗脱5个柱体积，分别收集得洗脱液(I )，洗脱液(II)，洗脱液(III)；C.将洗脱液(II)和洗脱液(ΠΙ)溶于体积比为氯仿:甲醇=1:1的混合液，上LH-20凝胶柱，经薄层层析法检测分析，得到仙鹤草三萜组分和黄酮组分；d.将步骤a中的滤渣用50%的乙醇回流提取3次，每次1.5h，提取液浓缩后用60%的乙醇分散溶解，调节PH为5.0，然后缓慢加入5.0%的明胶溶液至不再产生沉淀为止，过滤除去鞣酸蛋白后再加入95%的乙醇至乙醇浓度为85%时除去过量的明胶和提取物中的蛋白及多糖，然后过滤并将滤液浓缩，制得浸膏；将该浸膏溶于80%的甲醇，上LH-20凝胶柱，经薄层层析检测分析，得到黄酮组分。e.合并步骤c和步骤d中的黄酮组分。分光光度法测得仙鹤草黄酮组分(FC)的总黄酮含量为316.53±6.37mg/g，仙鹤草三萜组分(TC)的总三萜含量为415.96±5.15mg/g。将制得的仙鹤草黄酮组分(FC)和仙鹤草三萜组分(TC)以质量比为2:3常规制粒，制成胶囊或片剂等。实施例四a.取仙鹤草全草1.0kg,在温度为110°C下干燥至恒重并粉碎至45目，然后加入95%乙醇在温度为85°C回流提取3次后过滤，每次提取2小时，滤过，收集滤液和滤渣，将收集的滤液减压浓缩制得浸膏；b.将步骤a中的浸膏用95%乙醇分散溶解后加入10%浸膏重量的活性炭回流2小时后过滤并收集滤液，将所收集的滤液浓缩后上硅胶柱(样品:硅胶=1:30)，依次用乙酸乙酯:石油醚=1: 1，5:1及纯乙酸乙酯洗脱，各洗脱5个柱体积，分别收集得洗脱液(I )，洗脱液(II)，洗脱液(III)；C.将洗脱液(II )和洗脱液(III)溶于体积比为氯仿:甲醇=1:1的混合液，上LH-20凝胶柱，经薄层层析法检测分析，得到仙鹤草三萜组分和黄酮组分；
d.将步骤a中的滤渣用50%的乙醇回流提取3次，每次1.5h，提取液浓缩后用60%的乙醇分散溶解，调节PH为5.0，然后缓慢加入5.0%的明胶溶液至不再产生沉淀为止，过滤除去鞣酸蛋白后再加入95%的乙醇至乙醇浓度为85%时除去过量的明胶和提取物中的蛋白及多糖，然后过滤并将滤液浓缩，制得浸膏；将该浸膏溶于80%的甲醇，上LH-20凝胶柱，经薄层层析检测分析，得到黄酮组分。e.合并步骤c和步骤d中的黄酮组分。分光光度法测得仙鹤草黄酮组分(FC)的总黄酮含量为316.53±6.37mg/g，仙鹤草三萜组分(TC)的总三萜含量为415.96±5.15mg/g。将制得的仙鹤草黄酮组分(FC)和仙鹤草三萜组分(TC)以质量比为1:4常规制粒，制成胶囊或剂等。实施例五仙鹤草黄酮组分(FC)和三萜组分(TC)的HPLC物质表征1.实验材料方法1.1试剂与仪器1.1.1 试剂①对照品:槲皮苷、熊果酸、山奈酹、银锻苷、槲皮素、木犀草素、疗菜素、木犀草苷、杜荆苷、异杜荆苷、花旗松素、芦丁、科罗羧酸、齐墩果酸、4-羟基熊果酸和马斯里酸购自中检所
②乙腈、甲醇为进口色谱纯③其它试剂均为国产分析纯1.1.2 仪器①精密电子天平FA2004型，上海精密科学仪器有限公司②高效液相色谱仪Agilentl200，安捷伦科技有限公司I.I.3样品及对照品溶液的配制①精确称取仙鹤草黄酮组分(FC) 10.0mg,甲醇溶解定溶于IOmL容量瓶，待测。②精确称取仙鹤草三萜组分(FC) 10.0mg,甲醇溶解定溶于IOmL容量瓶，待测。③槲皮苷、熊果酸、山奈酹、银锻苷、槲皮素、木犀草素、芳:菜素、木犀草苷、杜荆苷、异杜荆苷、花旗松素、芦丁、科罗羧酸、齐墩果酸、4-羟基熊果酸和马斯里酸对照品各自用甲醇溶解配制成0.5mg/mL的溶液待用。1.2 方法1.2.1仙鹤草黄酮组分的HPLC物质表征色谱柱:WelchMaterials Ultimate XB-C184.6x250mm, 5 μ m ;流动相:流动相 A为0.1%磷酸水溶液，流动相B:乙腈；检测波长:350nm，柱温:35°C，流速:1.0mL/min，进样量:20μ L梯度洗脱条件如表1:表I仙鹤草黄酮组分(FC)的HPLC流动相梯度表
权利要求
1.一种治疗和改善胰岛素抵抗的仙鹤草活性组分，其特征在于:该活性组分包括仙鹤草中黄酮组分或仙鹤草三萜组分或仙鹤草黄酮组分和仙鹤草三萜组分的组合物。
2.根据权利要求1所述的治疗和改善胰岛素抵抗的仙鹤草活性组分，其特征在于: 所述黄酮组分及三萜组分的组合物中黄酮组分与三萜组分的质量比为4:1-1:4。
3.根据权利要求2所述的治疗和改善胰岛素抵抗的仙鹤草活性组分，其特征在于:所述仙鹤草黄酮组分与仙鹤草三萜组分的质量比为4:1。
4.根据权利要求3所述的治疗和改善胰岛素抵抗的仙鹤草活性组分，其特征在于:所述仙鹤草黄酮组分总黄酮的质量百分比含量不低于30%，仙鹤草三萜组分总三萜的质量百分比含量不低于40%。
5.根据权利要求1-4任一权利要求所述的治疗和改善胰岛素抵抗的仙鹤草活性组分，其特征在于:所述仙鹤草为蔷薇科龙牙草属植物，包括牙草、黄龙尾、疏毛龙牙草、东北朝鲜龙牙草、东北的钝齿龙、东北大兴安岭的多齿龙牙草、小花龙牙草、大花龙牙草、托叶龙牙草和欧洲的龙牙草。
6.一种权利要求1所述的治疗和改善胰岛素抵抗的仙鹤草活性组分在制备治疗和改善胰岛素抵抗药物中的应用。
7.—种权利要求1所述的治疗和改善胰岛素抵抗的仙鹤草活性组分的提取方法，其特征在于:包括以下步骤: a.取仙鹤草全草在温度为105-115°C下干燥至恒重并粉碎至35-45目，然后加入95%乙醇在温度为85-95°C回流提取3次后过滤，每次提取2小时，滤过，收集滤液和滤渣，将收集的滤液减压浓缩制得浸膏； b.将步骤a中的浸膏用95%乙醇分散溶解后加入10%浸膏重量的活性炭回流2小时后过滤并收集滤液，将所收集的滤液浓缩后以样品:娃I父=1:30上娃I父柱,依次用乙酸乙酷:石油醚=1:1，乙酸乙酯:石油醚=5:1及纯乙酸乙酯洗脱，各洗脱5个柱体积，分别收集得洗脱液(I )，洗脱液(II)，洗脱液(III)。
C.将洗脱液(II)和洗脱液(III)溶于体积比为氯仿:甲醇=1:1的混合液，上LH-20凝胶柱，经薄层层析法检测分析，得到仙鹤草三萜组分和黄酮组分； d.将步骤a中的滤渣用50%的乙醇回流提取3次，每次1.5h，提取液浓缩后用60%的乙醇分散溶解，调节PH为5.0，然后缓慢加入5.0%的明胶溶液至不再产生沉淀为止，过滤除去鞣酸蛋白后再加入95%的乙醇至乙醇浓度为85%时除去过量的明胶和提取物中的蛋白及多糖，然后过滤并将滤液浓缩，制得浸膏；将该浸膏溶于80%的甲醇，上LH-20凝胶柱，经薄层层析检测分析，得到黄酮组分。
e.合并步骤c和步骤d中的黄酮组分。
8.根据权利要求7所述的治疗和改善胰岛素抵抗的仙鹤草活性组分的提取方法，其特征在于:步骤a中取仙鹤草全草在温度为110°C下干燥至恒重并粉碎至40目，然后加入95%乙醇在温度为90°C回流提取3次后过滤。
9.根据权利要求8所述的治疗和改善胰岛素抵抗的仙鹤草活性组分的提取方法，其特征在于:步骤b中，将步骤a中的浸膏用95%乙醇分散溶解，然后加入10%浸膏重量的活性炭回流2小时后过滤并收集滤液。
全文摘要
本发明公开一种治疗和改善胰岛素抵抗的仙鹤草活性组分及其应用以及其提取方法，治疗和改善胰岛素抵抗的仙鹤草活性组分，包括仙鹤草黄酮组分和仙鹤草三萜组分，所述仙鹤草黄酮组分与仙鹤草三萜组分的质量比为4:1-1:4；通过HPLC分析得知仙鹤草的黄酮组分中主要含有牡荆苷、异牡荆苷和木犀草素-7-O-葡萄糖苷、槲皮苷、银椴苷；仙鹤草三萜组分中主要含有熊果酸、4-羟基熊果酸、科罗索酸和齐墩果酸。针对仙鹤草活性组分对胰岛素抵抗的干预，发现仙鹤草活性组分不仅对PPARγ的激活作用与阳性对照药物吡格列酮无显著差异，可显著促进前脂肪细胞的分化；而且在激活PPARγ表达的同时不像阳性对照药物吡格列酮样诱导AP2的过度表达，表明仙鹤草活性组分具有改善和治疗胰岛素抵抗的作用，可以制备成相应的剂型进行预防或治疗胰岛素抵抗。
文档编号A61P5/50GK103202897SQ201210535219
公开日2013年7月17日 申请日期2012年12月12日 优先权日2012年12月12日
发明者祝连彩, 王伯初, 郭廷旺, 周雪梅, 谭君, 刘曦 申请人:重庆大学