基于磁纳米颗粒的新型双靶向基因输送体系及其制备方法
【技术领域】
[0001 ]本发明涉及生物纳米载药材料及基因革El向输送领域，具体涉及一种基于磁纳米颗粒的新型双靶向基因输送体系及其制备方法。
【背景技术】
[0002]恶性肿瘤(癌症)具有发病率高、死亡率高、治疗困难及易复发等特点。据世界卫生组织最新《世界癌症报告》，2012年全球有1400万新增癌症病例，癌症死亡人数达820万。我国新诊断癌症病例为307万，占全球总数的21.8%，癌症死亡人数约220万，占全球癌症死亡人数的26.9%。而且根据目前的癌症发病趋势，到2020年全世界癌症发病率将比现在增加50%。肿瘤常规治疗方法主要是手术切除、放疗以及化疗，然而无论放疗化疗还是手术治疗患者生存期限都不超过12个月。因此，肿瘤治疗面临更加艰巨的任务，而目前RNA干扰(RNAinterference, RNAi)因具有序列和结构的特异性、高效性以及放大效应等特点，为恶性肿瘤治疗提供一条新途径，通过RNAi手段可以沉默肿瘤特异性基因，从而达到治疗肿瘤的目的。然而，易被核酸酶降解、半衰期短、不能有效的穿过细胞膜、稳定性及靶向性差等因素限制了 siRNA的有效应用。因此，如何将siRNA安全、高效地输送到靶细胞或靶组织成为RNAi应用的主要瓶颈问题。也就是说，输送载体能否安全、有效地将siRNA基因系统运输到指定部位，并转入细胞质中发挥作用，是RNAi发挥基因沉默功能的重要前提。目前，以病毒和脂质体为载体输送siRNA都存在一定缺陷。例如，病毒载体转染效率高，但具有潜在的致癌性和免疫原性；脂质体则具有较强的细胞毒性和不稳定性。因此，理想的siRNA运输载体是将RNAi技术成功应用于肿瘤靶向治疗的关键前提。无毒、高效的基因转染载体构建是一个急需解决、非常关键的问题。从理论上讲，理想的siRNA输送载体应具有较高的转染效率、良好的靶向性和稳定性、生物相容性无毒或低细胞毒性等特点。磁性纳米颗粒因具有这些特性，因而成为s iRNA抑制系统的理想输送载体。
[0003]siRNA作为沉默基因的新方法已成功用于肿瘤学研究，为恶性肿瘤治疗提供了一条非常有效的途径。然而，由于靶细胞转染效率低、稳定性及靶向性差等问题，在一定程度上影响了 siRNA作用效果。因此，在利用siRNA基因抑制系统进行肿瘤靶向治疗时，如何高效、特异地将siRNA基因运送到肿瘤靶细胞并选择性的在“病灶”部位发挥作用，以及如何实时、原位追踪siRNA体内行为，以便于实时了解肿瘤的发展及治疗情况等，这些都是需要考虑和亟待解决的问题。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于针对目前基因转染效率低、易降解、稳定性及靶向性差等迫切需要解决的问题，构建一种具有抗体及阳离子转染剂特异性双靶向功能的纳米基因输送体系O
[0005]本发明的技术方案为:基于磁纳米颗粒的新型双靶向基因输送体系，基因输送体系以超顺磁性氧化铁纳米颗粒作为磁核，以羧甲基壳聚糖为包被材料，并在羧甲基壳聚糖表面修饰靶向分子CD133抗体及阳离子转染剂聚乙烯亚胺。
[0006]进一步地，所述磁核为超顺磁性能的y-Fe203纳米颗粒。
[0007]进一步地，所述基因为小干扰RNA。
[0008]基于磁纳米颗粒的新型双靶向基因输送体系的制备方法，包括以下步骤:
①磁核的制备:利用部分还原三氯化铁溶液共沉淀法制备四氧化三铁纳米颗粒作为前提材料，以盐酸酸化、空气氧化法制备γ -Fe2O3纳米颗粒；
②磁核包被:通过多聚磷酸钠介导的离子凝胶法在γ-Fe2O3纳米颗粒表面包被羧甲基壳聚糖，得到CTS -TPPiSP1 NPs；
③聚乙烯亚胺修饰CTS-TPP0SP10NPs:采用EDC/NHS交联法制备PEI修饰的CTS -TPPiSP1 NPs，得到PE1-CTS-TPPOSP1 NPs；
④CD133抗体偶联:利用Traut’ s Reagent及异源双功能交联剂Sulfo-SMCC将CD133抗体与载体PE1-CTS-TPPOSP1 NPs偶联，得到CD133-PE1-CTS-TPP0SP10 NPs。
[0009]进一步地，基于磁纳米颗粒的新型双靶向基因输送体系的制备方法，包括以下步骤:
①利用部分还原三氯化铁(FeCl3)溶液共沉淀法，磁力搅拌条件下制备载体核的前体材料四氧化三铁纳米颗粒溶液，然后利用稀盐酸酸化、空气氧化法制备γ -Fe2O3纳米颗粒；去离子水洗涤、真空干燥、研磨过滤即得γ -Fe2O3纳米颗粒纳米颗粒；
②羧甲基壳聚糖(CMC)作为磁核包被材料，利用多聚磷酸钠(TPP)介导的离子凝胶法在超声乳化分散器的超声状态下，进行包被羧甲基壳聚糖(CTS)，所得产物在外加磁场的条件下用PBS缓冲液进行磁分离洗涤，即可得CTS-TPP0SP10 NPs;
③利用H3C/NHS交联法制备聚乙烯亚胺(PEI)修饰的CTS-TPPOSP1NPs,首先在MES缓冲液中利用EDC/NHS活化CTS -TPPiSP1 NPs。然后在PBS缓冲液中交联PEI，将制备的产物用PBS缓冲液洗涤，即得PE1-CTS-TPPOSP1 NPs；
④CD133抗体与载体PE1-CTS-TPPOSP1NPs的偶联采用Traut ’ s Reagent及异源双功能交联剂Sulfo-SMCC:首先在含EDTA的硼酸缓冲液中利用Traut’s Reagent试剂，在室温条件下对CD133抗体进行硫醇化修饰；同时，制备Sulfo-SMCC与PE1-CTS-TPPOSP1 NPs交联物;然后，将硫醇化的CD133抗体加入Sulfo-SMCC交联的PE1-CTS-TPPOSP1 NPs，将得到的反应产物用PBS缓冲液洗涤，即得CD133-PE1-CTS-TPP0SP10 NPs。
[0010]进一步地，步骤④中⑶133抗体硫醇化修饰的方法为:取240yL⑶133抗体，加入含EDTA的硼酸缓冲液，然后加入Traut ’ s Reagent，室温下，振荡反应；Sulfo-SMCC交联物的制备方法为:另取适量PE1-CTS-TPPOSP1 NPs，WAsuf0-SMCC;将混合液在室温下振荡反应;将得到的产物用含EDTA的I3BS缓冲液洗涤2-3次；将硫醇化的CD133抗体加入Sulfo-SMCC交联的PE1-CTS-TPPOSP1 NPs，室温下振荡反应;将得到的反应产物用I3BS缓冲液洗涤2-3次，即得CDl33-PE1-CTS-TPP0SP10 NPs。
[0011 ] CD133是细胞表面一种糖蛋白抗原，又称ACl33，也被称为proinin-Ι，是一种相对分子量为120kD具有独特五次跨膜蛋白结构域和两个大的N-糖基化细胞外环的跨膜糖蛋白。
[0012]CD133是脑肿瘤干细胞特异性表面标志物，具有很高的脑胶质瘤特异性。正常脑组织中⑶133表达水平很低，在恶性程度较高的肿瘤中⑶133呈强表达。因此，CD133是一个非常具有前景的脑肿瘤靶向诊断和治疗标志物。
[0013]因此，我们选择CD133抗体作为修饰磁纳米颗粒的靶向分子，通过CD133抗原与CD133抗体在细胞膜上特异性结合，构建CD133抗体靶向的磁纳米颗粒作为基因输送载体，提尚基因的革G向性和选择性。
[0014]聚乙烯亚胺(PEI)是一种阳离子聚合物，是最为常见的非病毒载体，常用于基因的体内递送。PEI这种材料被称为“proton sponge”，说明该材料具有很强的吸附性。又因其带正电，故能和带负电的核酸相结合。PEI的表面结构决定了这种聚合物的高转染效率。
[0015]本发明以磁纳米颗粒为载体、以⑶133抗体及阳离子转染剂聚乙烯亚胺(PEI)为靶向分子，构建了一种无毒、高效、特异的双靶向纳米基因输送体系。该体系以超顺磁性氧化铁纳米颗粒作为磁核，以羧甲基壳聚糖为包被材料，并在羧甲基壳聚糖表面修饰靶向分子CDl 33抗体及阳离子转染剂PEI ο本发明的双靶向基因纳米输送体系具有生物相容性好、稳定性高及革G向性特异的特点，使得该体系对肿瘤细胞具有高度的革G向选择性，可定向释放输送靶基因于肿瘤部位，进而发挥靶向抑制和杀死肿瘤细胞的作用，为肿瘤靶向治疗提供一个新策略。本发明纳米载体和基因输送体系的制备方法操作简便、反应条件温和，制备产物可作为基因的广泛载体，为高效的基因靶向输送载体研究提供了一种新的策略。
[0016]本发明与现有技术相比具有如下优点:
本发明制备的基于磁纳米颗粒的阳离子转染剂PEI及CDl 33抗体双靶向基因输送载体，具有高度的靶向选择性，相比非靶向的基因体系，显著提高基因的利用效率，减少对正常组织细胞的毒副作用。本发明纳米载体和基因输送体系的制备方法操作简便、反应条件温和，制备产物可作为基因运载的广泛载体，为高效的基因靶向输送载体研究提供了一种新方法。
【附图说明】
[0017]图1为基于磁纳米颗粒的新型双靶向基因输送体系的构建示意图。
[0018]图2为实施例1所构建纳米基因输送体系载体核的透射电子显微镜(TEM)图。
[0019]图3为实施例1基于磁纳米颗粒的新型双靶向基因输送体系红外光谱(FT-1R)图。
[0020]图4为实施例1基于磁纳米颗粒的新型双靶向基因输送体系XRD图。
[0021]图5为实施例1基于磁纳米颗粒的新型双靶向基因输送体系的磁化曲线图。
[0022]图6为实施例1基于磁纳米颗粒的新型双靶向基因输送体系的磁响应图。
[0023]图7为实施例1基于磁纳米颗粒的新型双靶向基因输送体系的PEI含量图。
[0024]图8为实施例1⑶133抗体偶联载体的活性分析图。
[0025]图9为实施例3基于磁纳米颗粒的新型双靶向基因输送体系的细胞吸收图。
[0026]图10为实施例4基于磁纳米颗粒的双靶向基因输送载体对细胞增殖的影响。
[0027]图11为实施例5基于磁纳米颗粒的新型双靶向基因输送体系对肿瘤干细胞活性影响。
[0028]图12为实施例6基于磁纳米颗粒的新型双靶向基因输送体系对肿瘤干细胞细胞周期影响。
[0029]图13为实施例7纳米载体与siRNA的结合能力与凝胶阻滞分析图。
[0030]图14为实施例8 siRNA转染分析图。