ol组比较接近。因此，载体材料对干细胞增殖基本没有影响。
[0048]实施例5
双靶向纳米载体细胞活性分析实验
利用FDA( 二乙酸荧光素)/PI (碘化丙啶)双染分析纳米载体对肿瘤干细胞活性的影响，FDA本身没有荧光，但是FDA无极性，可自由通过活细胞的细胞膜，并在进入细胞后存在与活细胞中的一种酯酶分解产生一种可在蓝色激发光下显示绿色荧光的物质，从而观察活细胞的形态和数量。PI是一种双链DNA荧光染料，可在绿色激发光下显示红色荧光，但是PI本身具有极性不能通过正常细胞的细胞膜，只能在细胞死亡后，或细胞膜破损的情况下，进入细胞膜，并与双链DNA相结合，使细胞显示红色荧光。将肿瘤干细胞培养至每个球大约10个细胞时，按照20 yg/mL 加入CD133-PE1-CTS-TPP0SP10 NPs或PE1-CTS-TPPOSP1 NPs，24h后更换新鲜的DMEM培养基，培养至肿瘤球大约含有200个细胞时，接种至RPM1-1640完全培养基中，分别培养1(1，2(1，3(1，4(1，5(1，7(1后，使用1 yg/mL的PI染色5 min，PBS洗涤一次，加入Iyg/mL的FDA染色5 min后观察并用荧光显微镜观察并采集图像。从图11可以看出细胞在重新贴壁生长后，加载体材料和对照组之间基本没有差异且生长到7 d的时候肿瘤球已基本完全分化，形态与富集前胶质瘤U251形态基本一致。因此，载体材料对GSCs的活力基本上没有影响。
[0049]实施例6
细胞周期分析实验
利用流式细胞仪检测双靶向纳米载体体系对肿瘤干细胞周期影响，将肿瘤干细胞培养至每个球大约10个细胞时，按照20 yg/mL加入CD133-PE1-CTS-TPPOSP1 NPs或PE1-CTS-TPPiSP1 NPs，24h后更换新鲜的DMEM培养基，培养至肿瘤球大约含有200个细胞时，用胰酶消化至单个细胞;缓慢加入I mL -20°C预冷的70%乙醇固定4h，PI染液37°C染色30 min,BDFACSCalibur流式细胞仪收集荧光信号，并用ModFit进行周期分析。结果表明，CD133-PE1-CTS-TPPiSP1 NPs或PE1-CTS-TPPOSP1 NPs处理的细胞均在S期和G2/M期有少量的阻滞效应，但是细胞周期整体良好，峰型尖锐，说明纳米材料只有微弱的毒性(图12)。
[0050]实施例7
siRNA的结合能力与凝胶阻滞分析实验
双靶向基因输送载体与siRNA结合能力利用紫外分光光度计法和凝胶阻滞法进行分析:首先将RNA配制成20 μ mol/L 水溶液，CD133-PE1-CTS-TPP0SP10 NPs及CTS-TPP0SP10NPs稀释成I mg/mL，然后每个离心管加入2 yL的RNA(即40pmol)以及O yL、2 yL、4 yL、6 μL、8 yL CD133-PE1-CTS-TPP0SP10 NPs及CTS-TPPOSP1 NPs，加DEPC处理水补充至 10 yL,静置15 min之后，磁力沉淀，取上清测定220nm到30nm吸光光谱，计算RNA的量。剩余样本在2%的含有I Xgoldview的琼脂糖30 v电泳30 min，利用凝胶成像系统观察。
[0051 ]纳米颗粒中含有聚乙烯亚胺可与核算相结合，从而到达交联RNA的目的，通过凝胶阻滞实验，我们可以看出纳米材料交联RNA能力大小以及交联RNA的比例。通过核酸蛋白分析仪测定。通过以上两幅凝胶图谱不难看出，随着加入纳米材料的量的增加，凝胶阻滞图谱中的条带逐渐变暗，从这些可以看出，随着加入偶联CD133和PEI包被的载体的量的增加，上清液中的RNA的量逐渐变小，可见我们所制备的载体具有良好的RNA运载能力(图13)。
[0052]实施例8 siRNA转染分析实验
利用FAM-siRNA与CD133-PE1-CTS-TPP0SP10 NPs和PE1-CTS-TPPOSP1 NPs结合，通过荧光显微镜观察了CD133-PE1-CTS-TPP0SP10 NPs和PE1-CTS-TPPOSP1 NPs结合FAM-siRNA并转染进入细胞的情况。将肿瘤干细胞培养至每个球大约10个细胞时，按照10 yg/mL加入RBITC-CD133-PE1-CTS-TPP0SP10 NPs、FAM-siRNA/ CD133-PE1-CTS-TPP 0SP10 NPs(FAM-siRNA按照每10 yg MNPs加入80 pmol FAM-siRNA) 24h后更换新鲜的DMEM培养基，继续培养24h后观察并用荧光显微镜观察照相。结果如图14，CD133-PE1-CTS-TPP@SP10 NPs和PE1-CTS-TPPiSP1 NPs均能够结合和引导FAM-siRNA进入细胞，而且CD133-PE1-CTS-TPP @SP1 NPs主动靶向作用使得这个效果更加明显，说明我们的材料具备引导siRNA进入细胞的能力。
[0053]以上所述实施例仅表达了本申请的【具体实施方式】，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。
【主权项】
1.基于磁纳米颗粒的新型双靶向基因输送体系，其特征在于，基因输送体系以超顺磁性纳米颗粒作为磁核，以羧甲基壳聚糖为包被材料，并在羧甲基壳聚糖表面修饰靶向分子CD133抗体及阳离子转染剂聚乙烯亚胺。2.根据权利要求1所述的基于磁纳米颗粒的新型双靶向基因输送体系，其特征在于，所述磁核为具有超顺磁性能的Y -Fe203纳米颗粒。3.根据权利要求1所述的基于磁纳米颗粒的新型双靶向基因输送体系，其特征在于，所述的基因为小干扰RNA。4.根据权利要求1-3任一项所述的基于磁纳米颗粒的新型双靶向基因输送体系，其特征在于，包括以下步骤: ①磁核的制备:利用部分还原三氯化铁溶液共沉淀法制备四氧化三铁纳米颗粒作为前提材料，以盐酸酸化、空气氧化法制备γ -Fe2O3纳米颗粒； ②磁核包被:通过多聚磷酸钠介导的离子凝胶法在γ-Fe2O3纳米颗粒表面包被羧甲基壳聚糖，得到CTS -TPPiSP1 NPs； ③聚乙烯亚胺修饰CTS-TPP0SP10NPs:采用EDC/NHS交联法制备聚乙烯亚胺修饰的CTS-TPPiSP1 NPs，得到PE1-CTS-TPPOSP1 NPs； ④CD133抗体偶联:利用Traut’sReagent及异源双功能交联剂Sulfo-SMCC将CD133抗体与载体PE1-CTS-TPPOSP1 NPs偶联，得到CD133-PE1-CTS-TPP0SP10 NPs。5.根据权利要求4所述的基于磁纳米颗粒的新型双靶向基因输送体系的制备方法，其特征在于，包括以下步骤: ①利用部分还原三氯化铁溶液共沉淀法，磁力搅拌条件下制备载体核的前体材料四氧化三铁纳米颗粒溶液，然后利用稀盐酸酸化、空气氧化法制备γ -Fe2O3纳米颗粒，去离子水洗涤、真空干燥、研磨过滤即得γ -Fe2O3纳米颗粒； ②羧甲基壳聚糖作为磁核包被材料，利用多聚磷酸钠介导的离子凝胶法在超声乳化分散器的超声状态下，进行包被羧甲基壳聚糖，所得产物在外加磁场的条件下用PBS缓冲液进行磁分离洗涤，即可得CTS -TPPiSP1 NPs； ③利用H3C/NHS交联法制备聚乙烯亚胺修饰的CTS-TPP0SP10NPs，首先在MES缓冲液中利用EDC/NHS活化CTS -TPPiSP1 NPs，然后在PBS缓冲液中交联PEI，将制备的产物用PBS缓冲液洗涤，即得PE1-CTS-TPPOSP1 NPs ； ④CD133抗体与载体PE1-CTS-TPPOSP1NPs的偶联采用Traut ’ s Reagent及异源双功能交联剂Sulfo-SMCC:首先在含EDTA的硼酸缓冲液中利用Traut’s Reagent试剂，在室温条件下对CD133抗体进行硫醇化修饰；同时，制备Sulfo-SMCC与PE1-CTS-TPPOSP1 NPs交联物;然后，将硫醇化的CD133抗体加入Sulfo-SMCC交联的PE1-CTS-TPPOSP1 NPs，将得到的反应产物用PBS缓冲液洗涤，即得CD133-PE1-CTS-TPP0SP10 NPs。6.根据权利要求5所述的基于磁纳米颗粒的新型双靶向基因输送体系的制备方法，其特征在于，步骤④中⑶133抗体硫醇化修饰的方法为:取240 yL CD133抗体，加入含EDTA的硼酸缓冲液，然后加入Traut ’ s Reagent,室温下，振荡反应;Sulfo-SMCC交联物的制备方法为:另取适量PE1-CTS-TPPOSP1 NPs，WAsufo-SMCC；将混合液在室温下振荡反应;将得到的产物用含EDTA的I3BS缓冲液洗涤2-3次;将硫醇化的CD133抗体加入Sulfo-SMCC交联的PE1-CTS-TPPOSP1 NPs，室温下振荡反应;将得到的反应产物用PBS缓冲液洗涤2_3次，即得CD133-PE1-CTS-TPP0SP10 NPs。7.根据权利要求1所述的基于磁纳米颗粒的新型双靶向基因输送体系在肿瘤的基因靶向治疗上的应用。
【专利摘要】本发明公开了基于磁纳米颗粒的新型双靶向基因输送体系及其制备方法，基因输送体系以超顺磁性纳米颗粒作为磁核，以羧甲基壳聚糖为包被材料，并在羧甲基壳聚糖表面修饰靶向分子CD133抗体及阳离子转染剂聚乙烯亚胺。本发明的双靶向基因纳米输送体系具有生物相容性好、稳定性高及靶向性特异的特点，使得该体系对肿瘤细胞具有高度的靶向选择性，可定向释放输送靶基因于肿瘤部位，进而发挥靶向抑制和杀死肿瘤细胞的作用，为肿瘤靶向治疗提供一个新策略。本发明纳米载体和基因输送体系的制备方法操作简便、反应条件温和，制备产物可作为基因的广泛载体，为高效的基因靶向输送载体研究提供了一种新的策略。
【IPC分类】A61K47/36, A61K47/02, A61K47/34, A61K31/7105, A61P35/00, A61K9/14, A61K47/42
【公开号】CN105560190
【申请号】CN201610046465
【发明人】王雪琴, 伊艳杰, 李瑞芳, 张慧茹, 景红娟, 李翠香
【申请人】河南工业大学
【公开日】2016年5月11日
【申请日】2016年1月25日