叶酸特异性靶向活化态肝星状细胞的聚合物纳米载体及其药用用图
【技术领域】
[0001] 本发明属于药物输送领域。具体设及一种祀向活化态肝星状细胞的聚合物纳米载 体及其制备和应用。
【背景技术】
[0002] 我国是肝纤维化、肝硬化、肝癌等肝脏疾病的高发区，其肝癌发病率和死亡率都超 过了全球的50%。肝硬化和肝癌的发病率呈正相关关系，肝纤维化作为肝硬化的前期重要 病症，受到越来越多研究者关注。肝纤维化的形成设及到肝细胞化C)、肝星状细胞化SC)、陷 窝细胞、库普弗细胞化C)和肝窦内皮细胞(SLEC)等，而静止态向肌纤维化样活化态转变后 的肝星状细胞化epatic stellate cell,HSC)被认为是肝纤维化起始过程的中屯、环节。随 着细胞学和分子生物学的发展和应用，WHSC为祀点来研发抗肝纤维化药物成为肝病治疗 领域的热点。已相继有人尝试紫杉醇、姜黄素、NO类等药物来抑制活化态HSC的增殖和ECM的 沉积，也有采用RNAi技术针对I型胶原蛋白基因进行沉默的成功报道。
[0003] 无论是化学药物还是基因药物，它们大多或者水溶性差、药效低下、价格不菲，或 者稳定性低、在体内容易被降解;而且其作用的非特异性，常常导致低药效、高毒副作用。运 些问题的存在都极大地限制它们在临床中的应用。W纳米载体系统载送药物不仅可解决药 物难溶性和稳定性低的问题，还可W通过EPR效应有效地使药物在肝脏部位富集、改善细胞 对药物的摄取。近年来已有一些纳米载体药物系统用于肝纤维化、肝硬化和肝癌的诊断和 治疗的报道，成功载送了肝脏生长因子化GF)、N0药物及中草药等至纤维化小鼠肝脏；国内 李玉娟等人也研发了 W多聚体和脂质体为主的纳米载送颗粒、尝试对肝纤维化和肝癌的治 疗。然而，运些纳米粒子载体都不能有效地祀向性作用于活化服C-运一类主要的导致肝纤 维化的细胞;过量的纳米粒子对肝脏形成毒性。与普通药物治疗相比，HSC细胞特异性的祀 向药物载体能够延长药物的体循环时间、提高药物在HSC中的富集、而且可降低药物剂量、 进一步减少毒副作用，是目前肝纤维化治疗中亟待发展的一类药物载体系统。
[0004] 目前可特异性作用于HSC药物载体主要有几种：如甘露糖6憐酸人血清白蛋白 (16口-服4)脂质体，参见：4化1曰11]\6.,?0613付3 1(.,5油61'曲(^6丄.，6131.1]116脚。1：；[0]1 of targeted liposomes with primary cultured hepatic stellate cells: Involvement of multiple receptor systems[J].Journal of hepatology,2006,44(3): 560-7;含有RGD序列环肤祀向长循环脂质体(RGD-SSL)，参见:Du S丄.，Pan H. ,Lu W.Y.，et al.Cyclic Arg-Gly-Asp peptide-labeled liposomes for targeting drug therapy of hepatic fibrosis in rats[J]. The Journal of pharmacology and experimental therapeutics , 2007,322(2): 560-8;偶联维生素 A的聚合物纳米载体，参见:Duong H. T., Dong Z.,Su L.,et 曰I.The use of nanoparticles to deliver nitric oxide to hep曰tic stell曰te cells for tre曰ting liver fibrosis 曰nd port曰I hypertension
[J].Small, 2015,11(19) :2291-304;偶联识别血小板衍生生长因子受体的环肤共聚物，参 见：Bansal R.,Prakash J.,Post E.,et al.Novel engineered targeted interferon-gamma blocks hepatic fibrogenesis in mice[J].Hepatology,2011,54(2):586-96。运 四者都W肝星状细胞表达的受体为祀位点，利用受体配体间的特异性结合实现对HSC的主 动祀向。但是，前两种载体所识别的受体均在其他细胞中有所表达，导致载体在祀向肝星状 细胞过程中也作用于其它正常细胞;且配体制备过程较为复杂、成本高昂，不利于临床进一 步研究和利用。此外，静止态HSC也大量摄取维生素 A，因此维生素 A修饰的载体系统不具备 对活化态HSC的特异性作用。而能特异性识别血小板衍生生长因子受体的环肤共聚物，其合 成困难、成本高昂。因此，开发一种特异性祀向活化态HSC的高效、低毒性、低成本的药物载 体对肝纤维化的研究和治疗有着积极而重要的意义。
[0005] 叶酸受体是一种肿瘤细胞表面高表达而正常细胞低表达的糖蛋白，作为其特异性 配体的叶酸，具有分子量低、易化学修饰、稳定性好、无免疫原性、和受体亲和性强W及成本 低廉等突出优点。因此，叶酸渐渐成为肿瘤祀向的理想配体，近年来在药物祀向输送、癌症 治疗等领域引起了广泛的关注。我们研究组发现，与静止的肝星状细胞相比，快速增殖的活 化态肝星状细胞中叶酸受体的表达显著增强；和肿瘤组织间质类似，肝纤维化部位由于活 化肝星状细胞旺盛的糖酵解而产生大量代谢酸性产物，使肝纤维化细胞间质pH呈弱酸性 等。运些生理学上的类似特征启发我们采用偶联叶酸的聚合物纳米胶束实现对活化态HSC 进行主动祀向。目前，尚未有特异性祀向肝星状细胞的偶联叶酸配体聚合物纳米载体的相 关报道。
【发明内容】
[0006] 鉴于现有技术的W上不足，本发明的目的在于，克服现有作用于活化态肝星状细 胞药物载体的不足，提供一种新型的、具有特异性祀向活化态肝星状细胞功能的聚合物纳 米载体。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用一种叶酸祀向的聚合物纳米载体，其化学结构式如 下：
式中，n = 41~50,m=12~14。所述纳米载体为球形，粒径均匀且平均粒径为50-60nm。
[0009] 所述叶酸祀向活化态肝星状细胞的聚合物纳米载体为纳米胶束，其亲水段材料为 聚乙二醇，其分子量为1800~2200，疏水段材料为聚己内醋，其分子量为1368~1596。
[0010] 所述纳米胶束粒径较小，分布均匀，具有良好的稳定性和生物相容性，可W有效地 祀向肝纤维化部位从而实现富集给药。
[0011] 本发明的另一目的是将上述聚合物纳米胶束用于特指的药用用途，即：
[0012] 叶酸祀向活化态肝星状细胞的聚合物纳米胶束的药用用途，在所述聚合物纳米胶 束疏水段形成的内核包覆尼罗红等疏水性巧光染料和疏水性抗纤维化药物，进而考察偶联 叶酸配体的聚合物纳米载体对活化态肝星状细胞的祀向效果和药物作用，用作肝纤维化的 祀向治疗和研究。本发明所述的纳米胶束结构是核壳结构，外壳的亲水段末梢接枝祀向配 体，内核的疏水段可包覆疏水性巧光染料及抗纤维化药物。
[0013] 本发明提供了一种特异作用于活化态肝星状细胞的聚合物纳米载体的制备和应 用。我们首次发现，在由静息态到肌纤维化样活化态的转型过程中，肝星状细胞中a型叶酸 受体的表达显著增强。进一步制备叶酸偶联的聚合物纳米胶束载体，我们成功实现了其对 活化态的原代大鼠肝星状细胞及细胞株的特异性祀向。本发明所述的药物纳米载体系统采 用聚乙二醇为亲水段材料，确保其对血液循环中蛋白质吸附和细胞粘附的抵抗；W聚己内 醋为疏水段材料成核，便于多种疏水性抗纤维化药物及巧光染料的装载。偶联于PEG外壳上 的叶酸则保证载体系统对活化态肝星状细胞表面的叶酸受体进行特异性地识别，最终有效 地提高药物的利用率并降低其毒副作用。
【附图说明】：
[0014] 图1为本发明所用原代大鼠肝星状细胞(HSC)静息态到活化态mRNA表达量变化。其 中：图1 (a)为aSMA的mRNA变化量，图1 (b)为Co 1 Iagen Ia 1的mRNA变化量，图1 (C)为FR-a的 mRNA变化量。
[001引图2为本发明所用FA-PEG-PCL聚合物材料合成路线图。
[0016]图3为本发明所用FA-PEG-PCL聚合物材料Ih-NMR图谱。
[0017 ]图4为本发明所用FA-PEG-PCL纳米胶束粒径分布。
[0018]图5为本发明所用FA-PEG-P化纳米胶束透射电镜照片。
[0019 ]图6为本发明所用FA-PEG-PCL纳米胶巧临界胶束浓度现慢曲线。
[0020]图7为本发明所用纳米胶束对服C-T6细胞毒性实验。
[0021 ]图8为本发明所用服C-T6细胞摄取包覆尼罗红纳米胶束巧光照片。
[0022] 图9为本发明所用HSC-T6细胞摄取包覆尼罗红纳米胶束流式细胞仪定量分析。
[0023] 图10为本发明所用服C细胞摄取包覆尼罗红纳米胶束巧光照片。
[0024] 图11为本发明所用HSC细胞摄取包覆尼罗红纳米胶束流式细胞仪定量分析。
【具体实施方式】
[0025] 基于开发一种新型、高效、低毒性、低成本并能特异性祀向HSC的药物载体，使之对 肝纤维化的治疗具有明确的祀向效果的发明目的，设计了祀向环境和效率、聚合物材料的 制备和评价、聚合物纳米胶束的获取实验环节。考虑到尼罗红(Nile Red)作为一种独特的 疏水性巧光染料，在水溶液中巧光强度非常低，而在疏水环境中会发出强烈巧光，在细胞成 像、生物诊断及检测等应用非常广泛。此外，尼罗红在分子量、亲疏水性W及药物稳定性等 方面与疏水性药物非常相似，是一种非常理想的巧光标记染料和疏水性药物模型，所W我 们采用尼罗红作为巧光染料和疏水性药物模型来验证偶联叶酸配体聚合物纳米载体对活 化态肝星状细胞的祀向性和药物作用。并W尼罗红为疏水性药物模型和祀向效果检测标识 进行定性和定量评价。将上述内容构成实施例，下面结合各实施例和附图做进一步说明。
[0026] 实施例1
[0027] 原代大鼠肝星状细胞化SC)的分离和培养
[0028] 采用原位灌注法消化大鼠肝脏，对消化分离得到的原代大鼠肝星状细胞采用高糖 DMEM培养基(含15 % -20 % FBS，1 %双抗P/S)置于37 °C，5 % C〇2细胞解箱中培养。
[0029] 实施例2
[0030]活化态大鼠肝星状细胞化SC-T6)的培养
[0031 ] 对HSC-T6细胞进行复苏传代后加入高糖DMEM培养基(含10 % FBS，1 %双抗P/S)后 置于37°C，5%C02细胞解箱中培养。
[0032] 实施例3
[0033] 原代大鼠肝星状细胞(HSC)由静息态到活化态aSMAXollagenlal、FR-a的mRNA表 达量变化分析
[0034] 采用原位灌注法消化大鼠肝脏，对消化分离得到的原代大鼠肝星状细胞在24孔板 中培养7天，其后吸除24孔板培养