一种集超声造影与热疗于一体的诊疗制剂的制备方法
【专利摘要】一种集超声造影与热疗于一体的诊疗制剂的制备方法，其步骤是：1）将1?50mg有机—无机复合脂质和0.1?10mg聚乙二醇溶于0.1?1mL无水乙醇中；2）将1?25mg薄荷醇溶于1?20mL超纯水中，水浴加热至45℃，再与1?10mL吲哚菁绿的水溶液混合；3）将步骤1）中得到的有机—无机复合脂质和聚乙二醇的乙醇溶液在水浴超声的条件下快速注入步骤2）得到的混合液中；4）探头超声后，得到内腔包载有吲哚菁绿和薄荷醇及表面覆盖有纳米级厚度且生物相容性好的无机硅酸盐壳层的有机—无机复合脂质纳米颗粒。本发明的复合脂质诊疗制剂能够实现在超声可视化观察下对肿瘤组织进行光热治疗，且稳定性好，对人体均无明显毒副作用，制备方法简单，设备要求较低。
【专利说明】
-种集超声造影与热疗于一体的诊疗制剂的制备方法
技术领域
[0001] 本发明设及生物医学材料领域，具体是设及一种集超声造影与热疗于一体的诊疗 制剂的制备方法。
【背景技术】
[0002] 癌症是一种具有高度异质性和极强适应性的疾病，需要根据病人的特点和疾病的 进展选择不同类型的诊断和治疗方案。一类将诊断与治疗功能一体化的纳米诊疗制剂在肿 瘤治疗领域逐渐兴起。诊疗时联用纳米制剂能为患者提供各种个性化的诊断治疗方案，从 而改善治疗效果。因此，研发新型多功能纳米诊疗制剂具有重要的意义，超声成像是目前临 床上广泛应用的诊断方法。
[0003] 超声造影剂是一类能够显著增强超声检测信号的诊断制剂，其主要成分是微气 泡。超声造影剂可W增强背向散射信号，从而大大提高超声诊断效果。目前，国内临床上用 到的超声造影剂是声诺维（SonoVue)，它是由憐脂包裹SF6气体形成的微泡，粒径是2~8 μ m。尽管WSonoVue为代表的微米级超声造影剂，在不同程度上获得了成功的应用，但是仍然 存在许多问题:一方面是，粒径大，因此仅局限于血池显影，不易实现对其血管外疾病的诊 断与治疗；另一方面是，声诺维由于包膜材料为脂质，脂质性质不够稳定，在体内持续时间 不够长，造影持续时间短，所W要利用微泡造影剂实现肿瘤的分子成像还存在一定的困难。 因此，寻找小型化、穿透力强的声学造影剂便成为超声影像领域重要的研究方向，也成为临 床诊断和疾病治疗的迫切需要。纳米级超声造影剂比商用的微泡造影剂小十倍左右，具有 血管外诊断的潜力。其粒径小，可通过血管内皮系统，实现血管外显影。尽管纳米级的超声 造影剂可实现血管外显影，但仅能用于癌症的早期诊断。
[0004] 目前，研究较多的液态氣碳类超声造影，如全氣己烧、全氣戊烧、全氣下烧等，液态 核屯、类造影剂主要通是过聚集的方式实现超声显影增强，但运种方式不能达到较好的超声 显影效果。因此，科研工作者开发了一种固态核屯、类造影剂一一薄荷醇。薄荷醇是一种能产 生典型薄荷香味的天然的环类单祗化合物，W游离和醋的状态存在，也称为薄荷脑。有止 痒、止痛、防腐、刺激、麻醉、清凉、抗炎和抗菌剂等制药应用，可用于治疗头痛、神经痛、痊痒 及呼吸道炎症、萎缩性鼻炎、声哑等。常用作香烟、牙膏、香水、饮料和糖果的添加剂。薄荷醇 的强挥发性极强，可在自然状态下产生薄荷醇气体微泡，起到增强超声造影的效果。通过大 量实验证明，W薄荷醇为核屯、的超声造影剂W其缓释表现良好，包载率高，超声效果好及超 声持续时间长的特点而有望成为下一代临床超声造影剂。选用烙点较低，且在液态下易大 量挥发产生气态微泡的固态类超声造影剂通过静脉注入机体后，可实现肿瘤组织超声显 影。
[0005] 近年来，光热治疗(Pho to therma 1 therapy )作为一种肿瘤治疗新兴的方法，因具 有定位治疗、微创伤等优点，已逐渐成为该领域的研究热点。光热治疗依赖于光热转换剂将 近红外光(NIR)能转换为热能，利用正常组织和肿瘤细胞对溫度耐受能力的差异，达到既能 使肿瘤细胞调亡、又不损伤正常组织的治疗目的。光热治疗已成为继手术、放疗、化疗和免 疫疗法之后的又一新的疗法，是治疗肿瘤的一种新的有效手段。目前，常见的光热转换剂包 括金纳米棒、纳米金壳、吗I噪菁绿、聚化咯、石墨締、碳纳米管等材料，其中吗I噪菁绿是唯一 一种被美国食品药品监督管理局(FDA)批准的用于人类医学成像和诊断的试剂，其卓越的 光热转换效能和良好的安全性等优势，被人们广泛研究应用于生物医学诊断及治疗领域。 但是，游离的吗I噪菁绿在极性溶剂中易迅速聚集，稳定性较差，其在血浆中易被快速清除， 在体内循环时间短，运些缺陷大大限制了吗I噪菁绿的应用。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于针对上述存在问题和不足，提供一种包载吗I噪菁绿与薄荷醇， 且稳定性好的集超声造影与热疗于一体的有机一无机复合脂质诊疗制剂的制备方法。
[0007] 本发明的技术方案是运样实现的： 本发明所述的集超声造影与热疗于一体的诊疗制剂的制备方法，其特点是包括W下步 骤： 1) 将l-50mg有机一无机复合脂质和0.1-lOmg聚乙二醇溶于0.1-1血无水乙醇中； 2) 将l-25mg薄荷醇溶于l-20mL超纯水中，水浴加热至45°C，再与1-lOmL吗I噪菁绿的水 溶液混合； 3) 将步骤1)中得到的有机一无机复合脂质和聚乙二醇的乙醇溶液在水浴超声的条件 下快速注入步骤2)得到的混合液中； 4) 探头超声后，得到内腔包载有吗I噪菁绿和薄荷醇及表面覆盖有纳米级厚度且生物相 容性好的无机娃酸盐壳层的有机一无机复合脂质纳米颗粒。
[0008] 其中，所述步骤1)中的有机一无机复合脂质的结构既可W为：
[0009] 有机一无机复合脂质是由一个分子连接两个疏水性碳链和一个亲水性的有机娃 烧分子组成的新型脂质分子，运种分子在水中能够通过溶胶-凝胶和自组装过程形成类脂 质体，从而实现在类脂质体的内腔里包载有薄荷醇小液滴和吗I噪菁绿溶液，在其表面覆盖 有纳米级厚度的生物相容性好的无机娃酸盐壳层。
[0010] 所述步骤4)中的超声时间为0.5-5min，超声功率为30W，且工作3s停3s。
[0011] 本发明与现有技术相比，具有如下效果： (1) 本发明的复合脂质诊疗制剂不仅能达到肿瘤部位和血管造影，而且可在造影的同 时对肿瘤局部进行加热，达到热疗杀死肿瘤细胞和组织的效果，从而实现在超声可视化观 察下对肿瘤组织进行光热治疗的目的； (2) 本发明的复合脂质诊疗制剂的造影效果持续长，由于纳米颗粒表面覆盖有纳米级 厚度的无机娃酸盐壳层，所W与传统的脂质超声造影剂相比，硅氧烷网络显著增加了复合 脂质的稳定性，由于薄荷醇具有固-液-汽Ξ相转变，因此能W溫和的方式连续不断地产生 气体微泡而非传统的猛烈的相转变，从而延长了复合脂质诊疗制剂在体内的血液循环时 间，为诊断提供了更多的时间； (3)本发明的复合脂质诊疗制剂具有优良的生物相容性和可降解性，所用原料吗I噪菁 绿、薄荷醇等对人体均无明显毒副作用，且制备方法简单，设备要求较低。
[0012] 下面结合附图对本发明作进一步的说明。
【附图说明】
[0013] 图1为本发明诊疗制剂的结构示意图。
[0014] 图2为本发明诊疗制剂的动态光散射粒径分布图。
[0015] 图3为本发明诊疗制剂的透射电子显微镜图片。
[0016] 图4为本发明诊疗制剂24h内的稳定性结果检测图。
[0017] 图5为本发明诊疗制剂与游离的吗I噪菁绿在紫外一可见分光光度仪中测量的光度 值示意图。
[0018] 图6为本发明诊疗制剂的光热转化实验结果示意图。
[0019]图7为本发明诊疗制剂在808nm激光照射5min后的体夕惦声显像图片。
[0020] 图8为本发明诊疗制剂的体外持续超声显像图片。
【具体实施方式】
[0021] 实施例1: 称量Img有机一无机复合脂质和0.1 mg聚乙二醇(DS阳-PEG2000)注入0.1血无水乙醇中 分散。取Img薄荷醇粉末加入到盛有ImL超纯水的血清瓶中，水浴加热到45°C，然后再加入 ImL浓度为Img/mL吗I噪菁绿的水溶液。在水浴超声条件下，将上述得到的有机一无机复合脂 质和聚乙二醇的乙醇溶液快速注入到吗I噪菁绿、薄荷醇和水的混合液中，得到预乳液。将预 乳液用超声细胞破碎仪的探头超声0.5min(设置超声功率为30w，工作3s，停3s)后，得到包 载吗I噪菁绿和薄荷醇的娃脂质纳米乳液。最后透析除去游离的吗I噪菁绿，即得内腔包载有 吗I噪菁绿和薄荷醇及表面覆盖有纳米级厚度且生物相容性好的无机娃酸盐壳层的有机一 无机复合脂质纳米颗粒。该复合脂质纳米颗粒的结构如图1所示。
[0022] 实施例2: 称量50mg有机一无机复合脂质和1 Omg聚乙二醇(DS阳-PEG2000 )注入1血无水乙醇中分 散。取25mg薄荷醇粉末加入到盛有20mL超纯水的血清瓶中，水浴加热到45°C，然后再加入 lOmL浓度为Img/mL吗I噪菁绿的水溶液。在水浴超声条件下，将上述得到的有机一无机复合 脂质和聚乙二醇的乙醇溶液快速注入到吗I噪菁绿、薄荷醇和水的混合液中，得到预乳液。将 预乳液用超声细胞破碎仪的探头超声5min(设置超声功率为30w，工作3s，停3s)后，得到包 载吗I噪菁绿和薄荷醇的娃脂质纳米乳液。最后透析除去游离的吗I噪菁绿，即得内腔包载有 吗I噪菁绿和薄荷醇及表面覆盖有纳米级厚度且生物相容性好的无机娃酸盐壳层的有机一 无机复合脂质纳米颗粒。该复合脂质纳米颗粒的结构如图1所示。
[0023] 实施例3: 称量25mg有机一无机复合脂质和5mg聚乙二醇(DS阳-PEG2000)注入5mL无水乙醇中分 散。取12mg薄荷醇粉末加入到盛有lOmL超纯水的血清瓶中，水浴加热到45°C，然后再加入 5mL浓度为Img/mL吗I噪菁绿的水溶液。在水浴超声条件下，将上述得到的有机一无机复合脂 质和聚乙二醇的乙醇溶液快速注入到吗I噪菁绿、薄荷醇和水的混合液中，得到预乳液。将预 乳液用超声细胞破碎仪的探头超声2min(设置超声功率为30w，工作3s，停3s)后，得到包载 吗I噪菁绿和薄荷醇的娃脂质纳米乳液。最后透析除去游离的吗I噪菁绿，即得内腔包载有吗I 噪菁绿和薄荷醇及表面覆盖有纳米级厚度且生物相容性好的无机娃酸盐壳层的有机一无 机复合脂质纳米颗粒。该复合脂质纳米颗粒的结构如图1所示。
[0024] 实施例4: 称量5mg有机一无机复合脂质和0.5mg聚乙二醇(DS阳-PEG2000)注入0.5血无水乙醇中 分散。取25mg薄荷醇粉末加入到盛有4mL超纯水的血清瓶中，水浴加热到45°C，然后再加入 ImL浓度为Img/mL吗I噪菁绿的水溶液。在水浴超声条件下，将上述得到的有机一无机复合脂 质和聚乙二醇的乙醇溶液快速注入到吗I噪菁绿、薄荷醇和水的混合液中，得到预乳液。将预 乳液用超声细胞破碎仪的探头超声0.5min(设置超声功率为30w，工作3s，停3s)后，得到包 载吗I噪菁绿和薄荷醇的娃脂质纳米乳液。最后透析除去游离的吗I噪菁绿，即得内腔包载有 吗I噪菁绿和薄荷醇及表面覆盖有纳米级厚度且生物相容性好的无机娃酸盐壳层的有机一 无机复合脂质纳米颗粒。该复合脂质纳米颗粒的结构如图1所示。
[0025] 采用马尔文(Malvern)激光粒度仪及Zeta电位仪测量上述实施例中获得的复合脂 质纳米颗粒的粒径为197.4 ± 6.9nm，电位为-12.5 ± 1.8mV，并得到如图2所示的动态光散射 粒径分布柱状图。由图2可W看出，烙融乙醇注入法制备得到的复合脂质纳米颗粒的纳米粒 径分布范围较窄，在200皿左右，透射电镜照片如图3所示。运种小粒径的纳米颗粒能够穿透 肿瘤血管壁到达肿瘤组织内部，在肿瘤部位有望实现超声造影显像。
[0026] 对有机一无机复合脂质纳米颗粒的体外稳定性进行测试： 将上述实施例中制备的有机一无机复合脂质纳米颗粒分别分散在PH=7.4的憐酸缓冲 液和含有10%胎牛血清的憐酸缓冲液中，置于37°C的摇床上2地，每隔化用激光粒度仪测定 其粒径变化，结果如图4所示。从图中可W看出该纳米颗粒在模拟人体内环境的条件下，粒 径没有明显变化，说明纳米颗粒的稳定性良好，有望在体内达到长时间循环。
[0027] 对有机一无机复合脂质纳米颗粒的紫外一可见分光光度值进行测定： 将上述实施例中制备的有机一无机复合脂质纳米颗粒按照吗I噪菁绿的浓度配制为化 g/mL，并测量其0D值。作为对照，将游离的吗I噪菁绿也配制成相同的浓度测定其0D值。如图5 所示，材料浓度仅为22yg/mL(吗I噪菁绿浓度为4yg/mL)时，该复合脂质纳米颗粒在波长为 808nm附近有明显的吸收峰。与其对应的同等浓度未包载入纳米颗粒的吗I噪菁绿的0D值大 致相等。从图中可W看出，该复合脂质纳米颗粒在波长为808nm激光照射下有明显的光吸收 值，有望将吸收的光转化为热量。
[0028] 对有机一无机复合脂质纳米颗粒的光热转化效率进行测定： 使用上述实施例中制备的有机一无机复合脂质纳米颗粒进行光热转化实验，如图6所 示，设置浓度不同的吗I噪菁绿溶液，分别取上述溶液2mL置于石英比色皿中，比色皿外面用 避光纸包裹，在避光纸上取一面积为1cm2的透光孔，使用波长为808nm，功率为2w的激光仪 照射，照射距离为5cm，照射面积为1 cm2，照射时间为15min。如图6所示，每个循环为30min， 前15min使用激光照射，后15min将激光仪关闭，每隔30s记录一次溫度值，得到如图6所示曲 线。从图中可W看出，该纳米颗粒在较低的浓度时仍然有较高的光热转化效率，当浓度仅为 50yg/mL时纳米颗粒溶液溫度即可达到65°CW上，可实现热疗杀死肿瘤组织的效果。
[0029] 对不同频率下有机一无机复合脂质纳米颗粒的体外超声显像实验： 取上述实施例中制得的有机一无机复合脂质纳米颗粒ImL加入到盛有3mL脱气水的滴 管中，同样使用波长为808nm，功率为2w的激光进行福照，福照时间为5min，福照距离5cm。福 照后置于溫度为37°C的水槽中，用多谱勒超声诊断仪高频探头，机械指数(MI=0.4)，Depth =3.0cm。分别在频率为f=3.5Hz、6.5Hz和8. OHz下扫查并保存图片，W等量的生理盐水作为 对照，比较不同频率下复合脂质纳米颗粒超声显影的差别，结果如图7所示。从中可W看出， 该复合脂质纳米颗粒在不同频率下均有明显的造影效果，在高频探头下造影效果更佳。运 说明经过激光福照后的复合脂质纳米颗粒所包裹的薄荷醇由固体变成了液态，然后液体又 挥发变成了大量的气体微泡，使该纳米颗粒实现了 "固-液-气"Ξ相的转变，进而实现更好 的造影功能。运种Ξ相转变型的超声造影剂既解决了超声微泡造影剂的尺寸过大，只能进 行血池示踪显像的缺点，又做到了微泡超声造影剂的显像效果。
[0030] 对有机一无机复合脂质纳米颗粒的体外超声持续显像试验： 按照不同频率下有机一无机复合脂质纳米颗粒的体外超声显像实验的方法操作体外 超声持续显像实验，并记录f=8.0Hz下的不同时间的超声显像图像，如图8所示。由图中可 见，该复合脂质纳米颗粒有长达25min的持续显影效果，运说明W有机一无机复合脂质为外 壳材料的造影剂，在超声声场中有优越的稳定性和较高的耐声压性。
[0031] 本发明是基于吗I噪菁绿的光热转化性质，在波长为808nm红外光的福照下，复合脂 质体内腔的吗I噪菁绿溫度升高，可W杀死肿瘤细胞及组织。但是，由于存在薄荷醇的强挥发 性而使其功能丧失的非常快运一难题。因此，本发明合成了有机-无机复合脂质来包载、胆 存并且基于溫度的变化来缓释放薄荷醇。有机-无机复合脂质内部包裹的薄荷醇受热可进 行固液气Ξ相循环转变，产生气体微泡可用于超声造影，从而达到超声造影和光热治疗的 效果。
[0032] 本发明运种连续可控的诊断治疗制剂有望作为灵敏的溫度应答多功能载体，通过 静脉注射可实现超声成像监测下的光热治疗，在超声的临床应用上有极为广阔的发展前 景。
[0033] 本发明是通过实施例来描述的，但并不对本发明构成限制，参照本发明的描述，所 公开的实施例的其他变化，如对于本领域的专业人±是容易想到的，运样的变化应该属于 本发明权利要求限定的范围之内。
【主权项】
1. 一种集超声造影与热疗于一体的诊疗制剂的制备方法，其特征在于包括以下步骤： 1) 将l-50mg有机一无机复合脂质和0. l-10mg聚乙二醇溶于0.1-lmL无水乙醇中； 2) 将l-25mg薄荷醇溶于l-20mL超纯水中，水浴加热至45°C，再与Ι-lOmL吲哚菁绿的水 溶液混合； 3) 将步骤1)中得到的有机一无机复合脂质和聚乙二醇的乙醇溶液在水浴超声的条件 下快速注入步骤2)得到的混合液中； 4) 探头超声后，得到内腔包载有吲哚菁绿和薄荷醇及表面覆盖有纳米级厚度且生物相 容性好的无机硅酸盐壳层的有机一无机复合脂质纳米颗粒。2. 根据权利要求1所述的集超声造影与热疗于一体的诊疗制剂的制备方法，其特征在 于:所述步骤1)中的有机一无机复合脂质的结构为：3. 根据权利要求1所述的集超声造影与热疗于一体的诊疗制剂的制备方法，其特征在 于:所述步骤1)中的有机一无机复合脂质的结构为：4. 根据权利要求1所述的集超声造影与热疗于一体的诊疗制剂的制备方法，其特征在 于:所述步骤4)中的超声时间为0.5-5min，超声功率为30W，且工作3s停3s。
【文档编号】A61P35/00GK105920625SQ201610246252
【公开日】2016年9月7日
【申请日】2016年4月19日
【发明人】曹众, 王春安, 蒋庆
【申请人】中山大学