SonoVue超声造影技术在诊治肿瘤血管生成拟态中的检查指标的制作方法
【专利摘要】SonoVue超声造影技术在诊治肿瘤血管生成拟态中的检查指标属于临床肿瘤血管超声检查的技术领域，本发明首次发现上升时间、达峰时间和平均渡越时间，这些超声检查指标可用于肿瘤血管生成拟态的临床诊断与治疗，为临床上早期无创诊断肿瘤血管生成拟态提供依据，有助于临床诊断患者肿瘤的恶性程度及其血供模式特点，并为药物选择或手术治疗提供诊断依据。
【专利说明】
SonoVue超声造影技术在诊治肿瘤血管生成拟态中的检查 指标
技术领域：
[0001] 本发明属于临床肿瘤血管超声检查的技术领域，设及为临床上早期无创诊断肿瘤 血管生成拟态提供检查指标，有助于临床诊断患者肿瘤的恶性程度及其血供模式特点，并 为药物选择或手术治疗提供诊断依据。
【背景技术】：
[0002] 血管在肿瘤发生和发展中起了重要作用。血管不仅为肿瘤细胞提供氧气和营养物 质、运走有毒代谢产物，还为肿瘤细胞转移提供血行通道。肿瘤血管研究始于1971年， Folkman首次将血管与肿瘤联系，并预见性的提出"抗肿瘤血管治疗"理论。此后，随着肿瘤 基础研究的进行，肿瘤血管分类更加细化，具体包括：内皮性血管化V)、血管生成拟态(VM)、 马赛克血管(MV)、淋己管(LV)。目前，研究比较多的是内皮性血管和血管生成拟态。
[0003] 1999年Maniotis等在研究人眼底黑素瘤时发现了一种新型的血供管道，它由肿瘤 细胞围成、内衬W细胞外基质。說青绿血管造影技术联合共聚焦激光扫描显微镜发现该管 道中有红细胞流动，表明它是一种功能性管道。运种血供管道的发生不依赖内皮细胞，却可 W模拟内皮性血管的功能，故称之为血管生成拟态。血管生成拟态的发生过程不需要内皮 细胞参与，但它却可W与内皮性血管发生衔接，运有助于肿瘤微循环网络的快速构建。此 夕h血管生成拟态与血液仅有一层细胞外基质相隔，肿瘤细胞更容易穿透细胞外基质发生 血液转移。可见，血管拟态在肿瘤发生发展过程中起到重要作用。临床回顾性研究发现，肝 细胞癌、神经胶质瘤、卵巢癌、星型细胞瘤、前列腺癌等肿瘤组织均存在血管生成拟态。此 夕h血管生成拟态还与肿瘤的恶性程度、肿瘤侵袭转移能力、患者生存期及不良预后密切相 关。目前临床上除了手术后病理组织切片染色外，还没有无创性诊断血管生成拟态的有效 方法。
[0004] 早期发现对肿瘤患者的治疗方案选择、治疗终点结果至关重要。尽管现有多种肿 瘤早期诊断技术，如肿瘤标记物检查、穿刺活检病理检查、核磁共振成像、计算机断层扫描 和放射性核素扫描等，但由于副作用大、敏感性低、检查成本高等缺点，运些技术在肿瘤早 期诊断中并没有发挥预期的作用。而SonoVue超声造影(Conhast-enhanced U1 trasound) 是当前用于评价实质性器官血流灌注情况的主要诊断技术之一。SonoVue超声造影使用的 是SonoVue微泡造影剂。Sono化e造影剂是一种内含六氣化硫惰性气体的憐脂微泡，稳定性 好，在低声压作用下振而不破，有很好的谐波特性。另外，Sono化e造影剂粒径约为2-5μπι，与 红细胞直径相当，它是一种很好的血池造影剂，仅存在于血管内而不进入组织间隙，可W准 确地反应组织的血流灌注状态。将超声造影仪和SonoVue造影剂相结合，可W动态、清晰地 显示实质性器官中的微细血管及血流灌注状况，据此对组织器官病变情况进行定性诊断。 此外，超声造影还具有无创性、安全性、实时性、检查费用较低等多个优点。
[0005] 超声造影用于临床肿瘤诊断的主要理论依据是实质性组织的血管分布情况、血流 特点、灌注特点和血管形态，主要观察内容是造影剂的增强时相、增强水平、分布特征及增 强模式。时间强度曲线(TIC)可W反映超声造影过程中组织的血流灌注情况，其中超声造影 定量参数主要包括上升时间(RT)、达峰时间（TTP)、峰值强度（IMAX)、平均渡越时间(mTT) W 及时间-强度曲线下面积(AUC)等，它们可W从不同角度反应组织器官的血液灌注情况。目 前，超声造影只能对肿瘤组织的整体血供情况进行评价，尚不能对肿瘤组织中内皮性血管 和血管生成拟态进行定性区分和定量分析，运在很大程度上限制了 SonoVue超声造影在肿 瘤良恶性诊断中的开发和应用。
[0006] 经过调研，未见SonoVue超声造影技术在诊治肿瘤血管生成拟态中检查指标的相 关文献报道（自CNKI、维普中国期刊网），因此运块研究领域尚处于空白阶段。
【发明内容】
：
[0007] 本发明提供了 SonoVue超声造影技术在诊治肿瘤血管生成拟态中的检查指标，包 括上升时间、达峰时间和平均渡越时间，运些检查指标可用于肿瘤血管生成拟态的临床诊 断与治疗。
【附图说明】
[0008] 图1为小鼠肿瘤超声造影图（A:小鼠肿瘤常规超声；B:彩色多普勒超声；C、D: Sono化e超声造影检测）。
【具体实施方式】：
[0009] 实施例1:
[0010] 1.1肥2瘤源鼠的制备
[0011]从-80°C超低溫冰箱取出冻存的小鼠 H22细胞株，水浴溫度39°C下快速解冻，在无 菌条件下用生理盐水稀释细胞悬液，光学显微镜下计数，调整细胞浓度至2 X 107-4 X 107个/ mL。用ImL注射器吸取0.3mL细胞稀释液接种到ICR小鼠腹腔，常规饲养，制成肥2瘤源鼠。 [001^ 1.2肥2荷瘤小鼠模型的制备
[0013] H22瘤源鼠饲养7d后，选取腹部隆起明显的小鼠，脱颈处死。剔除有血性腹水的瘤 源鼠。在无菌条件下用剪刀剖开小鼠腹部皮肤，在腹膜上剪一小桐，然后用ImL无针头注射 器抽取腹水，将所得腹水置于冰浴的离屯、管中。用无菌生理盐水稀释，光学显微镜下计数， 调整细胞浓度至2X107-4X107个/mL。两人配合，一人负责吸取细胞稀释液，一人绑定小鼠 并接种。小鼠右侧蔽窝皮下，每只小鼠接种〇.2mL细胞稀释液，接种量为4X 106-8 X 106个/ 只。接种过程中注意进针位置和角度，避免细胞稀释液漏出。
[0014] 1.3小鼠肿瘤的超声造影检查
[001引接种后第3d，根据小鼠右侧蔽窝皮肤隆起情况，剔除造模失败的小鼠。然后于小鼠 接种H22肿瘤后的第6、9、12、15(1共4个时间点，分别随机挑选5只小鼠到无锡市人民医院超 声医学科进行超声造影。超声造影之前，提前用脱毛液将小鼠右侧蔽窝肿瘤部位毛发去掉， 避免在超声时产生影像噪音。
[0016] 仪器及设备:Philips iU22超声诊断仪，1化5探头行常规检查，9L3探头行超声造 影。
[0017] 造影条件设置:机械指数M10.10,聚焦点位于肿瘤正上方。所有造影参数设置在研 究过程中均保持不变。
[0018] 超声造影剂:Sono化e造影剂(意大利布莱柯公司），实验开始前加入注射用生理盐 水5mL振摇后形成微泡混悬液，现配现用。
[0019] 超声造影步骤如下：
[0020] (1)清醒状态下将小鼠用胶带固定在泡沫板上，使其呈仰邸位，固定好小鼠四肢和 嘴部，W防小鼠在造影过程中乱动或伤人。
[0021] (2)造影前用常规超声探测肿瘤部位，测量皮下肿瘤的长、宽、厚Ξ个径线。用彩色 多普勒确定血液流入的大血管，观察肿瘤内部的回声、血供和坏死情况。
[0022] (3)使用O.lmL医用注射器接5号半头皮静脉针，经小鼠尾静脉注射0.02mL造影剂。 造影剂注入的同时开始录像，观察造影剂在瘤内的流动情况，直至造影剂消散，结束录像， 存储造影全过程供脱机分析。
[0023] (4)将做完超声造影的小鼠带回实验室，经脱颈处死，剥取肿瘤，称重。先用生理盐 水将肿瘤表面的血液洗净，后用10%甲醒进行固定，W备进行实施例5的实验。
[0024] 1.4超声造影图像分析
[0025] (1)将超声造影录像WDIC0M格式从化ilips iU22超声诊断仪导出，刻盘备用。
[0026] (2)将DIC0M格式造影录像导入Sonoliver软件，根据造影剂强度选定感兴趣的时 间段。
[0027] (3)参考常规超声图像，在超声造影图像中依次选择异常区（肿瘤区）和正常区（对 照区）为感兴趣区（region of interesting，R0I)，尽量避开因皮肤、分界线而产生的高亮 区。
[00%] (4)进行运动补偿，消除造影过程中因小鼠乱动或探头移动而产生的噪音。
[0029] (5)定量分析获得原始的时间强度曲线(TIC)，拟合时间强度曲线，每只小鼠重复 分析Ξ次，拟合度(quality of fit,Q(F)>75%为有效数据。
[0030] (6)导出包括上升时间（RT)、达峰时间（ΤΤΡ)、最大峰值强度（IMAX)、平均渡越时间 (mTT)等定量参数的EXC化文件和包括时间强度曲线的JPG文件，保存整个数据处理过程。
[0031] 1.5肿瘤组织包埋与切片制作
[0032] 具体实验步骤如下：
[0033] (1)洗掉肿瘤内部的甲醒:将肿瘤从10%甲醒固定液中取出，流水冲洗化。
[0034] (2)梯度酒精脱水:70%乙醇过夜，80%乙醇化，90 %乙醇20min，一道次95%乙醇 20min，二道次 95% 乙醇 20min，一道次 100% 乙醇 30min，二道次 100% 乙醇 30min。
[0035] (3)二甲苯透明：一道次100%二甲苯20min，二道次100%二甲苯20min。
[0036] (4)组织浸蜡:蜡缸左盒60°C浸40min，蜡缸右盒60°C浸40min。
[0037] (5)组织包埋:使用塑料包埋盒和配套不诱钢包埋盒底座，65 °C蜡液包埋。
[0038] (6)切片：用切片机制作4-6WI1石蜡切片。
[0039] (7)摊片:40°C恒溫水浴锅摊片，剔除展片不完全、组织有裂缝的切片。
[0040] (8)贴片:60°C恒溫鼓风干燥箱，将切片竖立放置到切片架上，4-5h贴片。
[0041] (9)切片保存:组织贴牢的切片室溫放置过夜，4°C保存。
[0042] 1.6肿瘤组织切片的CD31免疫组化-PAS双染
[0043] 具体实验步骤如下：
[0044] (1)烤片:60°C恒溫鼓风干燥箱，30min。
[0045] (2)二甲苯脱蜡：一道次100%二甲苯lOmin，二道次100%二甲苯15min，S道次 100% 二甲苯 20min。
[0046] (3)梯度酒精水化：100%乙醇lOminaOO%乙醇5min，95%乙醇5min，90%乙醇 5min，80 %乙醇5min，70 %乙醇5min。去离子水浸洗水化5min，Ξ次。
[0047] (4)抗原修复:巧樣酸修复液提前预热，90-100°C水浴20min。修复完毕后，将浸有 组织切片的巧樣酸修复液自然冷却至室溫。PBS浸洗5min，Ξ次。
[004引（5)过氧化物酶灭活：向组织滴加3%过氧化氨，避光反应15min，反应溫度37°C。 PBS浸洗5min，四次。
[0049] (6)BSA封闭：滴加博±德试剂盒BSA封闭液，反应20min，反应溫度37°C。
[0050] (7)-抗解育：用 PBS按 1:40 比例稀释一抗Anti-CD31antibody，4°C 保存。甩去 BSA 封闭液，滴加一抗，4 °C冰箱过夜。
[0化1 ] (8)回收一抗:室溫平衡30min，回收一抗。PBS浸洗5min，五次。
[0化2] (9)二抗解育:博±德试剂盒二抗溶液解育20min，解育溫度37°C ePBS浸洗5min，四 次。
[0053] (lO)SABC解育：博±德试剂盒SABC溶液解育20min，解育溫度37°CePBS浸洗5min， 四次。
[0化4] (11 )DAB显色:将DAB显色液A液和B液等体积混合，现配现用。暗室内，滴加 DAB显色 液，避光反应l-2min。显微镜下镜检，及时用水终止反应。PBS浸洗5min，两次。
[0055] (12)PAS-A液染色：雷根生物A液，避光解育Imin，及时用水终止反应。流水冲洗 7min，PBS 浸洗 5min，一次。
[0056] (13)PAS-B液染色：雷根生物B液，避光解育Imin，及时用水终止反应。流水冲洗 "Zmin。
[0057] (14)苏木素复染:将4°C保存的苏木素提前室溫平衡，浸染Imin，及时用水终止反 应。流水冲洗反蓝7min。
[0058] (15)盐酸酒精分化:分化5秒，及时用水终止反应。流水冲洗反蓝7min。
[0059] (16)镜检:观察染色深浅程度，判断是否需要重新染色或分化。
[0060] (17)梯度酒精脱水：70%乙醇5111111，80%乙醇5111111，90%乙醇5111111，95%乙醇 lOmin，一道次 100% 乙醇 20min，一道次 100% 乙醇 30min。
[0061 ] (18)二甲苯透明：一道次 20min，二道次 20min。
[0062] (19)封片：中性树胶封片。镜检:观察有无气泡，是否需要重新封片。
[0063] 1.7血管生成拟态、内皮性血管计数分析
[0064] 血管计数参照Weidner法进行。先在低倍镜（100X )下观察整个切片，选取血管生 成拟态密度最高的热点区域，然后在高倍镜(200X)下拍摄10张不同的热点区域照片。最后 用Image-Pro Plus 6.0软件统计每张照片的血管生成拟态数目，结果WMean±SD表示。血 管生成拟态入选标准:首先，CD31抗体染色阴性-PAS染色阳性是先决条件。其次，管腔封闭 且内有红细胞。最后，管腔周围无明显坏死和炎症浸润。
[00化]1.8数据统计与分析
[0066]采用SPSS 18.0统计软件进行实验数据分析，所有结果均WMean±SD表示。相关性 分析采用化arson检验，多组间均数比较采用单因素方差分析，两组间均数比较采用独立样 本t检验。WP<0.05和P<0.01为差异有统计学意义。
[0067] 1.9实验结果
[0068] 1.9.1肥2荷瘤小鼠的二维超声和Sono化e超声造影检查结果
[0069] 如图1.A所示，在造影前先用常规超声探测肿瘤部位，测量并记录小鼠 H22肿瘤的 长、宽、厚Ξ个径线。然后，用彩色多普勒选取血液流入的大血管，大体观察肿瘤内部的血 供、坏死情况，如图1.B所示。最后，Sono化e造影剂注入同时开始录像，观察造影剂在瘤内的 流动情况，直至造影剂消散时，结束录像并存储。如图1.C所示，参考常规超声图像，在超声 造影图像中依次选择异常区（肿瘤区，绿圈标记)和正常区（对照区，黄圈标记)为感兴趣区 (R0I)，避开因皮肤、分界线而产生的高亮区。如图1.D所示，通过定量分析获得原始的时间 强度曲线（图1.D中的上图），拟合时间强度曲线（图1.D中的下图）。从图中可W获得上升时 间(RT)、达峰时间(TTP)、最大峰值强度(IMAX)、平均渡越时间(mTT)等定量参数。
[0070] 1.9.2血管生成拟态密度与Sono化e超声造影定量参数的相关性分析
[0071] 本研究借助肥2荷瘤小鼠模型，设置多个时间点，通过病理学染色和显微镜计数获 得血管生成拟态的变化规律，结果如表1所示。随小鼠肥2肿瘤生长，肿瘤组织中的血管生成 拟态密度呈先增加后稳定状态，血管生成拟态形成最早出现在H22肿瘤接种后第6d，在小 鼠 H22肿瘤接种后的第6-9d呈明显上升趋势，表明血管生成拟态形成均比较活跃。存在血管 新生就意味着肿瘤组织严重缺氧，小鼠肥2肿瘤在接种后第l-9d瘤重增加速度较缓，正好验 证了运一点。小鼠 H22肿瘤接种后第9-15d血管密度上升趋势变缓，表明肿瘤组织的缺氧情 况得到改善，即单位面积内微血管所供给的血液足W维持肿瘤细胞的生存生长。小鼠 H22月中 瘤接种后第9-15d，小鼠瘤重增加速度明显加快，正好验证了运一点。
[0072] 表1小鼠肥2肿瘤血管生成拟态密度的实验结果
[0073]
[0074] 峰值强度（IMAX)是指肿瘤中造影剂的最高强度，反映肿瘤某个截面的血管密度。 上升时间（RT)是指肿瘤中造影剂由上升支10 % IMAX到上升支90 % IMAX所需要的时间。达峰 时间（TTP)是指肿瘤中造影剂注入到100 % IMAX所需要的时间。上升时间（RT)和达峰时间 (TTP)共同反映肿瘤造影剂的流入速度。平均渡越时间（mTT)是指肿瘤中造影剂由上升支 50 % IMAX到下降支50 % IMAX所需要的时间，反映造影剂的洗脱速度。H22荷瘤小鼠超声造影 定量参数的分析结果如表2所示。
[0075] 表2 H22荷瘤小鼠超声造影定量参数的分析结果
[0076]
[0077] 经统计学分析与P检验，结果如表3所示，研究发现小鼠肥2肿瘤中的血管生成拟态 密度与上升时间、达峰时间、平均渡越时间呈显著正相关关系。
[0078] 表3血管生成拟态密度与Sono化e超声造影定量参数的相关性分析
[0079]
[0080] 两个变量相关性的显著程度，*为P<0.05，**为P<0.01
[0081] 本发明是结合最佳实施例进行描述的，然而在阅读了本发明的上述内容后，本领 域技术人员能领会在公开的实施例中作许多改变也可获得相同或类似的结果，而不超出本 发明的构思、精神和范围。更具体地说，显然有些化学和生理性的相关试剂可替代本文所公 开的试剂而得到相同或类似的结果。所有类似的取代和修饰对本领域技术人员来说，显然 都认为是本发明的精神、范围和构思及权利要求范围内的，即所有上述运些等价形式和所 有对工艺参数的改进和变动都同样属于本发明的权利要求书所限定的范围。
【主权项】
1. SonoVue超声造影技术在诊治肿瘤血管生成拟态中的检查指标。2. 根据权利要求1所述，这些检查指标包括上升时间、达峰时间和平均渡越时间。3. 根据权利要求1所述，上升时间、达峰时间和平均渡越时间作为肿瘤血管生成拟态的 检查指标用于临床诊断与治疗。
【文档编号】A61K49/22GK105879064SQ201610216415
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年4月8日
【发明人】邱丽颖, 冯磊, 王旭, 蔡维维, 刘艳玲, 侯豹
【申请人】江南大学