Cmtm1-v5基因及其编码蛋白的应用

Cmtm1-v5基因及其编码蛋白的应用
【专利摘要】本发明涉及CMTM1-v5多肽或编码其的多核苷酸作为生物药治疗淋巴细胞白血病和其它类型白血病的作用。本发明还涉及CMTM1-v5多肽或编码其的多核苷酸可以通过抑制NFKB和NFAT的活化治疗炎症和自身免疫病的作用。本发明还涉及用于治疗白血病、炎症和自身免疫病的药物组合物。
【专利说明】
CMTM1-V5基因及其编码蛋白的应用
技术领域
[0001] 本发明涉及CMTM1-V5的新应用，具体地说，本发明涉及CMTM1-V5多肤或编码其的 多核巧酸制备用于治疗白血病，炎症及自身免疫病的应用。
【背景技术】
[0002] 淋己瘤（lymphoma)是血液淋己系统的恶性肿瘤，近年来随着社会老龄化及环境 的恶化，淋己瘤的发病率逐年上升，根据2012年美国肿瘤新发病例的统计，非霍奇金淋己 瘤的年发病率超过所有血液恶性肿瘤的总和，在所有肿瘤中居第7位。我国恶性淋己瘤的 发病率也逐年上升，已经成为一个威胁国民健康的重要病种。淋己瘤的亚型众多，异质性较 强，部分患者对化疗较敏感，但化疗药物多数为细胞毒性药物，杀伤特异性差，且经过近半 个世纪的研究，发展空间有限。近十几年是祀向治疗时代，随着化疗体系的完善、祀向新药 及造血干细胞移植的应用，淋己瘤的疗效显著提高，某些药物如美罗华、万河在临床已经取 得了较好疗效，5年生存率可达60-70%;但仍有部分患者会产生耐药或在缓解后复发，成为 临床治疗的难点和重点。因此寻找特异性的祀向治疗药物仍然任重而道远。
[0003] CMTM1 (CKLF样MARVEL穿膜结构域超家族成员1，原命名CKLFSF1)是发明人2004 年利用生物信息学方法克隆得到的新基因。CMTM1在人睾丸组织中高表达，在其他正常组织 中基本检测不到表达。该基因的结构非常复杂，RT-PCR和cDNA克隆测序发现该基因至少有 23个剪切变异体，分别被命名为CMTMl-vl-v23，CMTMl-v5是其中的一个剪切体。CMTM1-V5 的全长cDNA约600个碱基，由该基因的第1，6,7外显子剪切而成，CMTM1-V5由于cDNA剪 切而造成了转录提前中止，共编码61个氨基酸。
[0004] 发明人利用各种功能基因筛选平台发现CMTM1-V5在英光素酶报告基因的筛选平 台中对NF-KB和NFAT的活化具有很强的抑制作用，送引起了我们的兴趣。由于淋己瘤的 发病机制复杂，影响因素多，多种细胞的信号转导通路都与其发生发展有关，其中NF- K B 的过度活化通过抑制细胞调亡通路在淋己瘤的发生发展中起了重要作用。NF-K B是细胞 核内重要的转录调节因子，是细胞存活、细胞周期、细胞黏附和迁移的重要调节者。NF-kB 可W调控细胞因子、趋化因子、粘附分子等的表达；还可W转录激活细胞调亡抑制基因，女口 lAPs、Bd-2、Bd-xL、c-myc、巧clin D1等，促进细胞增殖，抑制细胞调亡。因此，NF-K B 的异常活化与淋己细胞白血病的发生、发展、耐药、复发密切相关。NF-kB的活化有两条主 要的信号通路，I-K B上游激酶分子IKK (I-K B Kinase)复合物是其中的关键分子；（1)在 某些刺激信号作用下，如病毒感染等，IKK复合物中的IKK活化，使Ι-κΒ磯酸化，磯酸化 的I- Κ Β被进一步泛素化由蛋白酶体降解，使NF- Κ Β被释放出来，（Ρ65/Ρ50)复合物转位 至核，激活众多祀基因。某些病毒蛋白可W使IKK保持活化状态，导致有效的磯酸化和降解 I- K B而使NF K B持续活化；（2) NF- K B活化的非经典途径是通过NF- K B诱导激酶NIK和 ΙΚΚα调控，并由RelB/P52复合体核转位起始下游祀基因的转录。通过抑制NF-KB的活 性可W达到治疗肿瘤的目的。目前已经发现可抑制NF- K B活性的化合物有100余种，但是 送些化合物并非特异性抑制NF-KB，故很难用于临床。所此研究者们将目光转向了寻找内 源性的NF- κ B抑制分子，期望能够研制治疗淋己瘤的新药物。测替佐米是近年来应用于临 床的一种蛋白酶抑制剂，主要通过阻止I- K B的降解阻断了 NF- K B的激活从而抑制细胞增 殖，引起细胞调亡，起到抗肿瘤作用，它还可使肿瘤细胞对化学治疗、放射治疗和免疫治疗 更敏感，克服细胞对药物的耐受，在骨髓瘤和部分淋己瘤亚型的治疗中显示了较好的疗效 和临床耐受性，但对多少淋己瘤的疗效不佳。既然CMTM1-V5对NF- K B和NEAT的活化也具 有很强的抑制作用，很有希望成为治疗淋己瘤的潜在新药，非常值得我们深入研究。
[0005] 鉴于上述原因，本研究组对CMTM1-V5进行了系统的功能研究。在多种细胞系如 化'1?11、1^]'1、胎1^曰、？〔3、2931\肥1(293中研究了〔1了]\11-￥5的功能，结果显示，在化'1?11和 Raji细胞中过表达CMTM1-V5可W明显抑制细胞的增殖效应，诱导细胞发生快速、严重的死 亡现象，其他细胞系则无明显改变，提示CMTM1-V5诱导细胞死亡有明显的细胞特异性。细 胞调亡中有两条通路研究的比较清楚，一条是膜受体通路，通过TNF α和FA化等分子启动 细胞调亡；另一条则是线粒体通路，多种线粒体分子是该通路的重要参与者。细胞的多种 死亡信号几乎都要传递至线粒体并导致线粒体膜通透性增加，一旦线粒体膜受损，细胞色 素 C和AIF等调亡诱导因子从线粒体内膜间隙释放至胞浆中，将引起一系列的蛋白酶解，释 放至胞浆中的细胞色素 C可与Apaf-1形成复合物，激活caspase-9和下游的caspase-3分 子。并最终导致细胞核的损伤（如DNA片断化）及细胞死亡。新近还发现了内质网的调亡 通路。进一步的机制研究发现CMTM1-V5可W引起细胞线粒体跨膜电位下降和细胞色素 C 释放，pro-caspase-9和p;r〇-caspase-3酶原减少，caspase-3激活及底物PARP的切割。送 表明，CMTM1-V5引起了线粒体和caspase分子依赖的经典途径的细胞调亡。
[0006] 细胞膜由脂质双层构成，其中镶嵌着蛋白质和糖蛋白，一般来说蛋白不能穿过细 胞膜。然而某些较大的蛋白，可W通过胞吞作用进入细胞。如人类免疫缺陷病毒化IV)转 录激活蛋白化t、单纯疮疹病毒化SV)结构蛋白VP22等。送些蛋白有若干共性；它们W-种 非经典的分泌途径（有分泌信号的参与）释放到细胞外；W特异性受体非依赖方式与革己细 胞结合；一般都有高碱性区域，送些区域显示了与多聚阴离子结合的能力，如肝素/硫酸己 醜肝素、多聚泌诞酸和核酸。蛋白、多肤及其它大分子进入细胞的途径一直是相关领域的研 究热点。胞吞作用的机制复杂，包括几个不同的途径；clat虹in(笼形蛋白或网格蛋白）依 赖的胞吞途径，起始于质膜包被有clathrin的内陷，然后组装成笼形蛋白包裹的小泡；非 clat虹in依赖的途径，包括lipid raft (脂德）及caveolae (小替）介导的胞吞作用。
[0007] Clat虹in介导的胞吞作用是一种细胞膜特异受体内化的主要机制。网格蛋白小 窝参与受体内化接下来的降解和再循环，W及营养的输入、突触小泡的形成。脂德（lipid raft)和化veolae功能相似，是由质膜内陷形成的一个富含胆固醇和銷磯脂的抗去污剂的 膜的区域，参与信号转导和脂德相关分子的细胞内的运输。化veolae是具有脂德特性的一 组细胞膜结构，典型的瓶状膜内陷。化veolin-1是caveolae的标志蛋白。甲基-目-环糊 精（M目CD)耗竭胆固醇，破坏脂德。
[0008] 为了研究CMTM1-V5多肤是否可W进入细胞发挥作用，发明人合成了 CMTM1-V5多 肤，纯度> 90% W上。功能实验证明其具有生物学活性。CMTM1-V5多肤可W特异性进入 化rkat、Raji细胞系，并可W引起细胞调亡，送种作用具有剂量依赖性。有趣的是，CMTM1-V5 只能进入淋己瘤细胞株化rkat、Raji细胞发挥作用，不能进入其他肿瘤来源的细胞株如 化la、293T、PC3等多种细胞，说明送种进入和作用都是特异性的。体内实验也显示了该蛋 白对小鼠具有较好的保护作用。实验组分成低、中、高不同剂量组，尾静脉注射了 Raji细胞 后再注射CMTM1-V5多肤，阴性对照组注射了 Raji细胞后注射生理盐水，阳性对照组注射了 Raji细胞后注射阿霉素，结果发现CMTM1-V5多肤对小鼠具有非常好的保护作用，阴性对照 组鼠在22天全部死亡，阳性对照组60天老鼠全部死亡，实验组；低剂量组在近30天时死 亡，中剂量组在60天时死亡3只；高剂量组在60天时没有因病死亡。结果说明CMTM1-V5 多肤对注射了淋己瘤细胞的小鼠具有非常好的保护作用。

【发明内容】

[0009] 本发明的一个目的是提供CMTM1-V5多肤或编码其的多核巧酸在治疗淋己细胞白 血病，炎症及自身免疫病中的应用。
[0010] 在一个方面中，本发明提供了 CMTM1-V5多肤或编码其的多核巧酸在制备白血病 治疗药物的用途。
[0011] 在另一个方面中，本发明提供了 CMTM1-V5多肤或编码其的多核巧酸在制备用于 炎症（包括急性炎症和慢性炎症）损伤之药剂中的用途。
[0012] 在又一个方面中，本发明提供了 CMTM1-V5多肤或编码其的多核巧酸在制备用于 治疗自身免疫病一种药物的用途。
[0013] 本发明还涉及一种用于治疗白血病及治疗白血病的药物组合物，其包含治疗有效 量的选自抗生素类和抗代谢类药物或者其任意组合的化疗药W及增敏有效量的CMTM1-V5 多肤。
[0014] 在一个实施方案中，所述CMTM1-V5多肤选自下组；（1)具有SEQ ID NO ;2所示氨基 酸序列的多肤；或（2)包含与SEQ ID NO; 2所述氨基酸序列有至少70 %、75 %、80 %、85 %、 90%、95%或97%同源性的氨基酸序列的多肤，其具有与（1)所述多肤基本相同的生物学 功能或活性；或（1)或（2)所述多肤的功能性片段、变体、类似物或衍生物，它们具有与（1) 或（2)所述多肤基本相同的生物学功能或活性。
[0015] 在另一个实施方案中，所述多核巧酸包括；（a)编码SEQ ID No ;1所示氨基酸序列 的核巧酸序列；化）在严格条件下与（a)所述的核巧酸序列杂交的核巧酸序列；或（C)与 (a)所示核巧酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或97%-致性的核巧酸序 列。
[0016] 在本发明中，所述多肤的生物学功能或活性例如但不限于，如本文所述的，诱导白 血病细胞/肿瘤细胞调亡、抗炎、治疗自身免疫病。
【附图说明】
[0017] 附图1、体外转染CMTM1-V5可W抑制化rkat和Raji细胞的生长
[0018] 正常培养的化rkat和Raji细胞，采用电击法瞬时转染CMTM1-V5、pCDB及Bax真 核表达质粒，使用Μ?Τ法检测细胞生长的情况。如图la和化所示，两者的结果是一致的， 即与空载体对照组相比，超表达CMTM1-V5的化rkat和Raji细胞的生长受到明显的抑制， 细胞数量不随时间推移而增加。利用细胞活力计数仪对细胞进行胎盼藍染色结果也显示， 超表达CMTM1-V5的化rkat细胞的细胞活率明显下降，如图1C。
[0019] 附图2、体外转染CMTM1-V5可W诱导化rkat和Raji细胞调亡
[0020] Annexin-v能够与膜外侧的PS特异性结合，利用英光素标记的Annexin-v结合流 式细胞分析技术可对细胞PS外翻进行定量测定，同时用贿化丙巧（PI)染色来判断细胞膜 的完整性。如图2所示，横坐标表示FITC-Annexin-V的英光强度，纵坐标表示PI的英光 强度，左下区域代表正常细胞，右下、右上、左上区域分别代表早期调亡、中晚期调亡、W及 死亡的细胞。化rkat细胞瞬时转染pCDB、PCDB-CMTM1-V5及Bax质粒，在转染后8小时左 右，CMTM1-V5组PI-Annexin V单阳性及双阳性的细胞比例即比对照组要多，随着时间推 移，CMTM1-V5组细胞死亡越来越明显，达到45%;类似的结果在Raji细胞中也得到了证实， CMTM1-V5所诱导的细胞程序性死亡出现的非常早且明显。
[0021] 附图3、CMTM1-V5过表达诱导细胞线粒体跨膜电位（Δ wm)下降
[0022] 我们对转染CMTM1-V5的化rkat细胞使用DI0C6 (3)染料，结合流式细胞术分析了 Δ ΨΠ1的改变情况。结果如图3所示，过表达CMTM1-V5和Bax都可W明显诱导Δ wm下降。 送表明在CMTM1-V5诱导的细胞调亡的过程中线粒体受到损伤。
[0023] 附图4、在化rkat细胞中过表达CMTM1-V5引起细胞色素 C从线粒体释放到胞浆
[0024] 我们利用Western blot检测了细胞色素 C的释放。化rkat细胞转染CMTM1-V5 后分别提取胞浆及线粒体蛋白，（图4)显示过表达CMTM1-V5组与空载体组相比，胞浆成分 中细胞色素 C的含量明显增加，说明细胞色素 C从线粒体内外膜间隙释放到细胞浆，并与 Caspase-9, Apaf-1等分子结合，形成复合物，活化下游的caspase-3分子并参与细胞调亡 过程的信号转导。
[00巧]附图5、体外转染CMTM1-V5可W活化caspases
[0026] 在化rkat和Raji细胞转染后12小时，收获细胞提取蛋白，进行DEVDase活性（即 caspase-3活性）检测。活化caspase-3对其英光底物Ac-DEVD-AMC切割，释放出游离的 AMC可被英光分光光度计激发出英光，通过检测反应体系中英光强弱，可判断出caspase-3 酶活性的强弱，从而反应caspase-3的活化情况。图5a结果显示，与空载体组相比，在调亡 出现比较早期时（转染后12h)，CMTMl-v5组和Bax组都能引起细胞内caspase-3活性明显 升高CJurkat细胞7倍，Raji细胞中5倍）。
[0027] Western blot 结果（图加）显示过表达 CMTM1-V5 可 W使 caspase-3、caspase_9、 caspase-12酶原含量减少，即表明均被活化。化spases活化还可W切割特定的底物，从而 引起细胞的功能障碍或结构损伤。我们同时检测到了 caspase-3的底物之一 PARP的切割 情况。在CMTM1-V5过表达组和Bax组均可见PARP切割，切割后的小片段PARP含量比空载 体组增多。
[0028] 附图6、双英光素酶报告基因实验证明转染CMTM1-V5可W抑制NF-AT信号通路
[0029] 利用双英光素酶报告基因系统我们比较了 CMTM1-V5和CAML相互作用对NFAT信 号通路的影响。结果显示PMA+Ionomycin刺激后，空白对照pcDB组英光素酶活性增加了 4 倍左右，说明细胞已经完全被活化。而与对照相比，过表达CMTM1-V5可W抑制未加刺激（内 源性）和刺激后英光素酶活性（图6a)。过表达CAML组的细胞英光素酶活性则明显升高， 送与文献报道也是相符的。共表达CMTM1-V5和CAML时，CMTM1-V5对NFAT的抑制效应则 被逆转（图化）。而作为内参的海肾英光素酶的活性并没有明显的变化（数据未显示），说 明送种英光素酶信号的减弱是特异的，并不是由超表达CMTM1-V5的细胞毒效应或共转两 种质粒的剂量效应引起的。
[0030] 图7、双英光素酶报告基因实验证明转染CMTM1-V5可w抑制NF- Κ B的活化 [003。 293T细胞常规传代培养再含10%FBS的DMEM中，用0.25%膜酶+EDTA消化细胞， 按1. 5 X 105细胞/ml铺96孔细胞培养板，转染后培养24小时用lOOng/ml PM和InM的 ionomycin为刺激物。刺激6-8小时收获细胞，每孔加入30 μ 1 1 X 1PLB细胞裂解液，每个 样本设6个复孔，其中3个孔加入pNF-kB-Luc报告基因质粒，其余3个孔加入pLuc-myc报 告基因质粒。阴性对照为PCDNA3. 1空载体，活化及抑制的阳性对照分别为化kB及IkB。英 光素酶报告基因结果显示，超表达CMTM1-V5 W及V5-N端，V5-C端可W抑制NF K B的活化。 P+I代表W l(K)ng/u 1 PMA和InM ionomycin为刺激物。BLANK代表未加刺激物，结果提示 CMTM1-V5可W明显抑制NF- K B信号转导通路的活化。
[0032] 附图8、酵母双杂交及免疫共沉淀验证CMTM1-V5在细胞中与CAML相互作用
[0033] 我们通过酵母双杂交筛选到了 CMTM1-V5的相互作用祀分子。CMTM1-V5和CAML 有相互作用。为了进一步在哺乳动物细胞中验证送两个蛋白的相互作用，我们利用免疫 共沉淀实验进行验证。结果显示，用IgG和GST抗体IP，然后用HA抗体检测，可W在和 INPUT GST-CMTM-V5相同的位置上在GST抗体IP组出现了相应的条带（图8)，提示CAML 和CMTM1-V5可W在细胞内环境下相互结合。
[0034] 附图9、CMTM1-V5与CAML在化La细胞中共定位分析
[0035] 我们使用激光共聚焦显微镜观察两种分子在细胞内定位的情况。过表达的 CMTM1-V5与CAML都位于细胞浆内，并在核周点状聚集，两者的分布几乎完全重叠，提示 CMTM1-V5与CAML在细胞内共定位。
[0036] 附图10、在化rkat细胞中共表达CAML与CMTM1-V5对细胞调亡的影响
[0037] 我们将CMTMl-v5、CAML的真核表达质粒共转染至化rkat细胞中，检测细胞调亡的 情况。CAML与CMTM1-V5共同转染至化rkat细胞时，CMTM1-V5诱导的调亡被明显的抑制住 了（AV+PI双染的细胞由31. 27%减少至17. 50% )。CAML与CMTM1-V5共同转染的确可W 影响CMTM1-V5所诱导的细胞调亡。
[0038] 毛细管电泳技术检测FITC标记CMTM1-V5多肤
[0039] 用FITC标记CMTM1-V5多肤，凝胶纯化后利用毛细管电泳技术进行了检测，证明标 记成功。
[0040] 标记的CMTM1-V5多肤可W进入淋己瘤细胞
[0041] 在激光共聚焦显微镜下观察，英光标记的CMTM1-V5多肤可W进入Raji细胞，37°C 时可W进入细胞，但是4°C时主要附着在细胞膜周围不能进入细胞。
[0042] 附图11、流式细胞术和激光共聚焦显微镜发现标记的CMTM1-V5多肤可W进入 raji和化rkat细胞。
[0043] 标记的蛋白加到培养细胞中，流式细胞仪检测，结果证明与对照组相比，实验组细 胞平均英光强度增加了 7倍W上。
[0044] 附图12、使用CMTM1-V5多肤能够诱导淋己细胞白血病细胞系raji和化rkat细胞 调亡
[004引 CMTM1-V5多肤可W诱导Raji细胞调亡，并有明显的剂量依赖关系。CMTM1-V5多 肤加到Raj i细胞中，24、48小时可W引起Raj i细胞细胞调亡，随着蛋白浓度的增加，调亡细 胞比例显著增加，具有明显的剂量依赖关系。
[004引附图13、CMTMl-v5多肤在体内可W明显延长注射了 raji细胞SCID小鼠的生存期
[0047] 体内实验结果；注射生理盐水的阴性对照组；22天小鼠全部死亡；注射化疗药阿 霉素的阳性对照组；58天小鼠全部死亡；CMTM1-V5多肤低剂量组；28天小鼠全部死亡； CMTM1-V5多肤中剂量组；58天3只小鼠死亡；CMTM1-V5多肤高剂量组；58天无小鼠因病死 亡；结果证明CMTM1-V5多肤中、高剂量组都可W非常明显保护注射了淋己瘤细胞的小鼠， 延长生存期。
[0048] 具体实施例
[0049] 在本发明中，CMTM1-V5包括CMTM1-V5基因或CMTM1-V5多肤。所述CMTM1-V5多 肤为如SEQ ID N0;2所示的氨基酸序列，其编码61个氨基酸。所述CMTM1-V5基因为编码 本发明的SEQ ID NO ;2的多核巧酸序列，其可W为SEQ ID NO ;2所示氨基酸的编码序列，或 者除了上述氨基酸序列的编码序列之外，还可W包括非编码序列，例如内含子、编码序列5' 或3'端的非编码序列等。所述多核巧酸序列可W是DNA或RNA，其中DNA包括cDNA、基因 组DNA W及合成的DNA。其中优选的基因为SEQ ID NO ;1所示的多核巧酸序列，该序列全 长603个核巧酸，编码序列为第1-186位核巧酸（CDS ;第1-183位核巧酸）。或者，更优选 一种分离的核巧酸序列，其只包含编码CMTM1-V5蛋白序列，例如SEQ ID NO ;1所示的编码 序列；核巧酸1-186。本领域普通技术人员已知，本发明的CMTM1-V5的核巧酸序列可W完 全相同于如SEQ ID NO ;1所示的编码序列，也可W由于遗传密码的简并性，不完全等同于上 述核巧酸的编码序列。
[0050] 本发明的CMTM1-V5多核巧酸序列可W依据标准的PCR扩增技术将cDNA，mRNA或 者基因组DM作为模板，并选取合适的寡核巧酸引物扩增得到。送样得到的核巧酸可W克 隆进合适的载体中，并用DNA分析技术进行序列描述。也可W通过标准DNA合成技术得到。 本发明的CMTM1-V5蛋白可W通过常规方法获得，例如通过转化宿主细胞并在被转染的宿 主细胞生长到适当的细胞密度后，用适当的方法（如温度变动或化学特质诱导）诱导启动 子，然后继续培养。培养完成后，可用离必法收集细胞，并用任何已知的方法，如冻融法、超 声处理法、溶菌酶溶解法或机械破碎法破碎细胞。可W用各种已知的方法从宿主细胞培养 物中回收和纯化本发明的CMTM1-V5蛋白，送些方法包括硫酸倭或己醇沉淀法、酸萃取法、 超滤法、离子交换层析法、磯酸纤维层析法、疏水相互作用层析法、凝胶过滤法、亲和层析法 及高压液柱层析法。也可W通过原核表达载体转化到大肠杆菌中，通过适当的方法（如温 度变动或化学特质诱导）诱导启动子，然后继续培养。培养完成后，可用离必法收集细胞， 并用任何已知的方法，如冻融法、超声处理法、溶菌酶溶解法或机械破碎法破碎细胞。可W 用各种已知的方法从宿主细胞培养物中回收和纯化本发明的CMTM1-V5蛋白，送些方法包 括硫酸倭或己醇沉淀法、酸萃取法、超滤法、离子交换层析法、磯酸纤维层析法、疏水相互作 用层析法、凝胶过滤法、亲和层析法及高压液柱层析法。
[0051] 本发明的CMTM1-V5还可W通过慢病毒，腺病毒等载体感染哺乳动物细胞，在细胞 内和体内发挥作用。
[0052] 本发明的CMTM1-V5多肤还可W通过化学的方法合成得到。
[0053] 在本发明的一个实施方式中，CMTM1-V5可W抑制NFKB和NFAT信号通路，因此可 W抑制炎症性疾病和自身免疫性疾病。
[0054] 根据本发明的另一方面，本发明还提供一种治疗白血病的药物组合物。该药物组 合物包含CMTM1-V5的重组蛋白或合成的全长多肤。还可W包含一种或多种药学可接受的 载体或赋形剂。所述载体或赋形剂可W包括生理盐水、等渗葡萄糖溶液、缓冲盐水、甘油、己 醇及上述溶液的组合。所述药物组合物还可W进一步包含渗透促进剂、抗氧化剂和/或蛋 白酶抑制剂等。
[00巧]为治疗目的，所述药物组合物可W采用适当的给药途径来施用。可W将所述药物 组合物制成各种剂型，例如溶液剂、脂质体制剂、聚合物制剂、微胶囊剂及其他缓释制剂等。
[0056] 本发明的药物组合物可W全身给药，例如通过静脉注射；或者局部给药，例如对患 癌部位局部注射。最适的剂量要根据患者的病情、年龄、性别或体重，给药方式和所需功效 而定，本领域的技术人员可在其知识范围内无需创造性劳动就可确定最佳的施用方式。
[0057] W下将参考实施例来对本发明进行进一步的阐述。
[005引本发明的一个方面提供了 CMTM1-V5多肤或编码其的多核巧酸在制备白血病治疗 药物的用途。在一些实施方案中，所述CMTM1-V5多肤或编码其的多核巧酸将所述生物活性 药物递送至肿瘤细胞内诱导其调亡。在另一些实施方案中，所述CMTM1-V5多肤或编码其 的多核巧酸通过抑制NFAT和NFKB通路抑制炎症和自身免疫病。
[0059] 本发明的一个方面提供了使用CMTM1-V5多肤或编码其的多核巧酸治疗白血病的 方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的CMTM1-V5多肤或编码其的多核巧酸。在一 些实施方案中，所述CMTM1-V5多肤或编码其的多核巧酸将生物活性药物递送至癌症细胞 内实现抑制肿瘤细胞生长。在又一些实施方案中，所述多核巧酸可W是多种形式，包括但不 限于克隆载体、表达载体、腺病毒、慢病毒、质粒、瞻粒、粘粒、裸DNA等形式。在另一些实施 方案中，所述CMTM1-V5多肤或编码其的多核巧酸通过诱导调亡实现抑制肿瘤生长。在又一 些实施方案中，治疗白血病通过W上两种方式实现。优选地，所述方法在体内或离体实施。
[0060] 本发明的又一个方面提供了在受试者体内使用CMTM1-V5多肤或编码其的多核巧 酸可W抑制炎症和自身免疫病。所述方法包括向受试者施用有效量的CMTM1-V5多肤或编 码其的多核巧酸。
[0061] 本发明的又一个方面提供了一种用于治疗白血病的药物组合物，其包含治疗有效 量的CMTM1-V5多肤和化疗药物。
[0062] 在本发明的一些实施方案中，所述CMTM1-V5多肤选自下组；（1)具有SEQ ID NO ;2 所示氨基酸序列的多肤；或（2)包含与SEQ ID NO ;2所述氨基酸序列有至少70%同源性的 氨基酸序列的多肤，其具有与（1)所述多肤基本相同的生物学功能或活性；或（1)和（2)所 述多肤的功能性片段、变体，类似物和衍生物，它们具有与（1)或（2)所述多肤基本相同的 生物学功能或活性；其中所述多核巧酸包括；(a)编码上述（1)、（2)或（3)所述的CMTM1-V5 多肤的多核巧酸；化）在严格条件下与（a)所述的多核巧酸杂交并与其有至少70%-致性 的多核巧酸；和（C)包含（a)或化）所述多核巧酸的多核巧酸片段。
[0063] 优选地，在本发明的一些实施方案中，所述CMTM1-V5多肤包含与SEQ ID NO ;2所 述氨基酸序列有至少75 %，优选地至少80 %，更优选地至少85 %，还更优选地至少90 %，甚 至更优选地至少95 %，最优选地至少97 %同源性的氨基酸序列。
[0064] 优选地，在本发明的一些实施方案中，编码所述CMTM1-V5多肤的多核巧酸具有 与SEQ IDN0 ; 1所示核酸序列至少70 %，优选至少75 %，更优选至少80 %，至少85 %，至少 90%，至少95%，甚至至少97%-致性的序列，最优选其中所述多核巧酸具有SEQ ID NO ;1 所示核酸序列。
[0065] 本发明人经过研究显示人CMTM1-V5多肤进入细胞显现出细胞类型的特异性，在 目前验证的细胞中，主要是进入淋己细胞白血病细胞，如化rkat T淋己瘤细胞，Raji B淋 己瘤细胞均显现出进入细胞的能力。而对已经检测的贴壁细胞如化La, HT-29, A549, PC-3 则不能进入。过表达CMTM1-V5能诱导细胞调亡，外源性人CMTM1-V5多肤能特异进入祀细 胞，CMTM1-V5多肤具备的送个特性在治疗淋己细胞白血病具有重要作用。
[0066] 如本文中所使用的，术语"受试者"是指哺乳动物，如人类，但也可W是其它动物， 如家养动物（如狗、猫等），家畜（如牛、羊、猪、马等）或实验动物（如猴子、大鼠、小鼠、兔 子、豚鼠等）。
[0067] 如本文中所使用的，术语"多肤"指通过共价键（例如肤键）相互连接的一串至少 两个氨基酸残基，可W是重组多肤、天然多肤或合成多肤。
[006引如本文所使用的，CMTM1-V5多肤的功能性片段、变体、衍生物和类似物可W是：一 个或多个氨基酸残基被保守或非保守的氨基酸残基所取代（优选保守的氨基酸残基），取 代的氨基酸残基是或不是由遗传密码所编码的氨基酸；一个或多个氨基酸残基带有取代基 团；成熟多肤与另一化合物融合在一起；一个或多个另外的氨基酸与成熟多肤相融合，诸 如帮助纯化成熟蛋白的序列或蛋白原序列；在一端或两端或内部插入和/或添加和/或缺 失一个或多个氨基酸。从送些公开内容看，送样的片段、衍生物和类似物相信处于本领域技 术人员的知识范围内。
[006引如本文所使用的，术语"一致性"、"百分比一致性"、"同源性"或"同一性"指两个氨 基酸序列之间或者核酸序列之间的序列同一性。可W通过比对两个序列来确定百分比一致 性，百分比一致性指所比较的序列共有位置相同残基（即氨基酸或核巧酸）的数量。可使 用本领域的标准算法（例如 Smith 和 Waterman, 1981，Adv. Appl. Math. 2 ;482 ;Needleman 和 Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48 :443 ;F*earson 和 Lipman, 1988, Proc.化tl. Acad. Sci.，USA, 85 :2444)或者通过送些算法的计算机化版本（Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer G;roup，575Science Drive, Madison, WI)进行序列比对 和比较，所述计算机化版本公开可用为BLAST和FASTA。另外，通过美国国家卫生研究院 度ethesda MD)可用的ENTREZ可用于序列比较。当使用BLAST和缺口 BLAST程序时，可使 用各个程序（例如BLASTN，在美国国家生物技术信息中必的因特网站点上可用）的缺省参 数。在一个实施方案中，可使用缺口权重为1的GCG来确定两个序列的百分比同一生，使得 每个氨基酸缺口给予权重如同它是两个序列间的单氨基酸不匹配。或者，可使用ALIGN程 序（2. 0版），其是GCG(Accebys，San Diego, CA)序列比对软件包的一部分。
[0070]"杂交"指两个单链多核巧酸非共价结合W形成稳定双链多核巧酸的过程。术语 "杂交"还可W指Η链杂交。所产生的（通常是）双链的多核巧酸为"杂交体"或"双链体"。 "杂交条件"一般包括低于约1Μ、更通常低于约500mM和低于约200mM的盐浓度。杂交温度 可W低至5°C，但通常高于约22°C，更通常高于约3(TC，优选高于约37°C。杂交通常在严格 条件（即探针会与其祀序列杂交的条件）下进行。严格杂交条件取决于序列，并在不同的 情况下存在差异。较长的片段可能需要较高的杂交温度来进行特异性杂交。由于其他因素 (包括互补链的碱基组成和长度、有机溶剂的存在和碱基错配程度）可能影响杂交的严格 度，因此参数的组合比任何一个单独参数的绝对值更为重要。一般而言，将严格条件选择 成比确定的离子强度和抑下该特定序列的Tm低约5°C。示例性严格条件包括抑7. ο至8. 3 下至少0. 01Μ至不高于1Μ的化离子浓度（或其他盐）和至少25°C的温度。对于严格条 件，参阅如 Sambrookjritsche 和 Maniatis. "Molecular Cloning A 1 油oratory Manual" 第二版 Cold Spring Harbor Press (1989) W及 Anderson''Nucleic Acid Hybridization" 第一版，BIOS Scientific化blishers Limited (1999)，它们对于所有上述目的均通过参考 整体并入本文。
[0071] 药物组合物
[0072] 本发明还提供了包含CMTM1-V5多肤（或者编码CMTM1-V5多肤的核酸）的药物组 合物。除了活性成分之外，根据本发明W及根据本发明使用的药物组合物可包含药学可接 受赋形剂、载体、缓冲剂、稳定剂或其它本领域技术人员公知的物质。送些物质应为非毒性 的，并且应不干扰所述活性成分的疗效。所述载体或其它物质的确切性质会取决于施用途 径，所述途径例如可W是经口、静脉内或局部。
[0073] 所述制剂可W是液体，例如含有P册.8-7. 6的非磯酸缓冲液的生理盐溶液或者冻 干粉末。
[0074] 剂量
[00巧]本文所述的CMTM1-V5多肤优选W "治疗有效量"或"有效量"施用给个体。所述 组合物优选治疗有效量"施用给个体，所述治疗有效量或增敏有效量或有效量足W显示 其对于所述个体的益处。施用的实际量，W及施用的速率和时间过程会取决于所治疗者的 自身情况和严重程度。治疗的处方（例如对剂量的决定等）最终是全科医生及其它医生的 责任并依赖其做决定，通常考虑所治疗的疾病、患者个体的情况、递送部位、施用方法W及 对于医生来说已知的其它因素。
[0076] 在一些实施方案中，CMTM1-V5多肤的剂量范围可W是80mg/kg/4天至160mg/kg/4 天。
[0077] 施用
[0078] 本发明中的多肤单独施用，其通常包括根据施用的计划方式所选的适合的药物赋 形剂、稀释剂或载体。多肤可W通过任何适合的方式适用于需要治疗的患者。精确的计量 将取决于多个因素，包括该多肤精确的性质。
[0079] 在本发明的一些实施方案中，CMTM1-V5多肤与化疗药物分开施用。在另一些实施 方案中，CMTM1-V5多肤与化疗药物组合施用。
[0080] -些合适的使用方式包括（但不限于）口服、直肠、鼻部、局部（包括口腔和舌 下）、皮下、阴道或胃肠外的（包括皮下、肌肉、静脉、皮内、銷内和硬脑膜外）施用。
[0081] 对于静脉注射和在病痛位置的注射，活性成分将为一种胃肠外接受的水溶液形 式，其不含热源并具有合适的抑值、等张性和稳定性。
[0082] 本领域中相关技术人员使用，例如；等张赋形剂如氯化钢注射液、林格氏注射液， 乳酸林格氏注射液，能够很好的制备适合的溶液。根据要求，可W加入防腐剂、稳定剂、缓冲 剂、抗氧化剂和/或其它一些添加剂。口服施用的药物组合物可W是片剂、胶囊、粉剂或口 服液等形式。片剂可W包括固体载体，如明胶或辅剂。液体药物组合物通常包括液体载体， 如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。也可W包括生理盐水溶液、葡萄糖或其它糖溶 液或二醇类，如己二醇、丙二醇或聚己二醇。
[0083] W上所提到的技术和方案的例子W及其它一些根据本发明所使用的技术和方案 可 W在 Remington' S Pharmaceutical Sciences，16th edition,Oslo,A. (ed), 1980.中找 到。
[0084] 实施例1、超表达CMTM1-V5可W抑制化rkat和Raji细胞的生长
[0085] 超表达CMTM1-V5的化rkat和Raji细胞的增殖用MTT法和细胞活力计数仪测定。 [008引 MTT为淡黄色甲基四氮哇盐，活细胞的线粒体脱氨酶能与MTT产生兰色结晶状甲 騰，甲騰经二甲基亚讽（DMS0)溶解可进行比色。甲騰生成的量与活细胞的代谢强弱成正 比，且仅有活细胞有此反应。结果用酶标仪测量，可W根据显色的深浅反映细胞代谢活性的 强弱。按照2000个细胞/孔的密度将转染后的细胞接种于96孔板中，每组细胞设5个平 行复孔，连续培养6天，每24小时加入MTT，37°C，5% C02赔育4-6小时后，加入细胞裂解 液，第二日于化ISA Reader 570nm测量光密度值，将不同组、各时间点结果进行统计后绘制 细胞的生长曲线，反映细胞的增殖活性。
[0087] 细胞活力计数：死亡细胞对台盼藍细胞的通透性升高，可被染成藍色，而活细胞则 拒染。利用Vi-CELLXRTM细胞活力计数仪对不同时间点的细胞进行检测，可W显示细胞大 小，活细胞所占比例及总的活细胞数，从而绘制细胞生长曲线。将转染CMTM1-V5和对照质 粒的化rkat和Raji细胞按照2xl05cells/well的密度接种于12-well细胞培养板，连续 培养6天。每24小时取细胞上机检测，并绘制细胞生长曲线分析细胞增殖状况。
[0088] 正常培养的化rkat和Raji细胞，采用电击法瞬时转染CMTM1-V5、pcDB及Bax真 核表达质粒，使用Μ?Τ法检测细胞生长的情况。两者的结果是一致的，即与空载体对照组相 比，超表达CMTM1-V5的化rkat和Raji细胞的生长受到明显的抑制，细胞数量不随时间推 移而增加。利用细胞活力计数仪对细胞进行胎盼藍染色结果也显示，超表达CMTM1-V5的 化rkat细胞的细胞活率明显下降（图1)。
[0089] 实施例2、超表达CMTM1-V5可W诱导化rkat和Raji细胞调亡
[0090] 磯脂醜丝氨酸（P巧从细胞膜的胞浆侧外翻至细胞膜的外表面是细胞调亡典型的 生化特点之一。Annexin-V能够与膜外侧的PS特异性结合，利用英光素标记的Annexin-V 结合流式细胞分析技术可对细胞PS外翻进行定量测定，同时用贿化丙巧（PI)染色来判断 细胞膜的完整性。如（图2)所示，横坐标表示FITC-Annexin-V的英光强度，纵坐标表示 PI的英光强度，左下区域代表正常细胞，右下、右上、左上区域分别代表早期调亡、中晚期调 亡、W及死亡的细胞。化rkat细胞瞬时转染pcDB、pcDB-CMTMl-v5及Bax质粒，在转染后8 小时左右，CMTM1-V5组PI-Annexin V单阳性及双阳性的细胞比例即比对照组要多，随着时 间推移，CMTM1-V5组细胞死亡越来越明显，达到45% ;类似的结果在Raji细胞中也得到了 证实，CMTM1-V5所诱导的细胞调亡出现的非常早且明显。
[0091] 实施例3、CMTM1-V5超表达诱导线粒体跨膜电位（Δ ΨΠ 1)下降
[0092] 线粒体是细胞调亡信号通路的关键调控者之一，线粒体跨膜电位（Δ wm)受损是 线粒体介导的细胞调亡最早期的生化特征之一。为了确定CMTM1-V5介导的细胞调亡是否 有线粒体的参与，我们对转染CMTM1-V5的化rkat细胞使用DI0C6 (3)染料，结合流式细胞 术分析了 ΔΨΠ 1的改变情况。分别于转染后不同时间点收获细胞于离必管，15(Κ)巧m离必 5分钟，弃上清；PBS洗涂细胞2次，重悬于4001 PBS中，制备单细胞悬液。加入20nM的 Di0C6 (3)，37°C避光赔育15分钟后，立即进行流式细胞术分析。收获IX 104个细胞，计算 膜电位降低的细胞百分比。过表达CMTM1-V5和Bax都可W明显诱导Δψπι下降。送表明 在CMTM1-V5诱导的细胞调亡过程中线粒体受到损伤。
[0093] 实施例4、CMTM1-V5超表达诱导细胞色素 C从线粒体释放到胞浆中
[0094] 线粒体Δ wm下降使得线粒体膜通透性改变，使线粒体ΡΤΡ打开并向胞质中释放 出一些调亡相关因子，如细胞色素 C。细胞色素 C从线粒体释放到胞质是启动内源性调亡 通路的一个关键环节。正常情况下，细胞色素 C定位于线粒体内外膜间隙；当线粒体参与 的细胞调亡程序被启动时，外膜通透性增加，细胞色素 C从线粒体内外膜间隙释放到细胞 浆，并与化spase-9, Apaf-1等分子结合，形成复合物，活化下游的caspase-3分子并参与细 胞调亡过程的信号转导（22, 23, 24)。我们利用Western blot检测了细胞色素 C的释放情 况。化rkat细胞转染CMTM1-V5后分别提取胞浆及线粒体蛋白，图4显示过表达CMTM1-V5 组与空载体组相比，胞浆成分中细胞色素 C的含量明显增加。结果还显示（图5)，下游 caspase-9分子的酶原在CMTM1-V5超表达组也有明显的减少。细胞总蛋白提取；收集细 胞，用PBS洗细胞2次，并转移入EP管，离必弃尽上清；将细胞重悬于细胞裂解液（20mM Tris-肥 1，抑 7. 4，150mM 化Cl，lmM 邸TA，lmM EGTA，l%Triton X-100，Cocktail)，冰浴30 分钟；15, OOOg离必10分钟，收集上清，BCA法定量。
[0095] 线粒体蛋白及胞质蛋白提取：利用差速离必的方法可W把细胞分成不同的组分 (21)。具体步骤如下；收获lX106细胞，PBS洗涂2次后，用lml缓冲液I(20mM胎pes-K0H， 抑7. 2,210mM藏糖，70mM甘露醇，10mM KCl，1.5mM MgC12，lmM EDTA，lmM EGTA，lmM DTT，蛋 白酶抑制剂Cocktanl)平衡洗涂一次；用200 μ 1缓冲液I重悬，冰浴30分钟；用Dounce微 量匀浆器温和匀浆细胞50次，收集匀浆液，750g，4°C离必5分钟；取上清继续4°C，10, OOOg 离必10分钟，获得的沉淀为线粒体组分。吸出上清继续4°C，lOOOOg离必30分钟，再取上 清作为无线粒体细胞质组分。
[0096] Western blot检测；收集蛋白定量均衡后，加入SDS加样缓冲液（目琉基己醇，甘 油，20 % SDS，0. 1漠酪藍），煮沸5分钟，离必后取上清夜，12. 5 %的SDS-PAGE胶分离等量 蛋白样品后，用lOOv，1. 5小时湿式电转移至硝酸纤维素膜上，W 5%脱脂牛奶4°C封闭过夜 后，分别与一抗室温结合1小时或4°C过夜，之后用TBSTaris-HCl，化C1，0. 1% Tween-20) 洗膜Η次，每次10分钟；再加入相应的I畑yeTM 800/700conjugated二抗避光反应一小时， TBST 洗膜后用 Odyssey Imaging System 仪器检测。
[0097] 实施例 5、CMTM1-V5 诱导 caspase 活化
[0098] Caspase分子，特别是化spase-3在细胞调亡过程中充当了剑子手的角色，是最 终引起细胞调亡的分子之一。当起始caspase分子如caspase-8、9、10切割并活化下游 效应caspase分子如caspase-3、6、7后，活化的caspase分子可W使细胞内一系列的蛋 白底物发生降解，造成细胞呈现出细胞调亡的一系列形态学和分子生物学特征，如活化的 caspase-3降解ICAD，使CAD释放出来并切割细胞核DNA形成DNA片断化（25, 26, 27)。为 了明确CMTM1-V5所诱导的细胞调亡是否伴随着caspase-3的活化，在化rkat和Raji细 胞转染后大约12小时，收获细胞提取蛋白，进行DEVDase活性（即caspase-3活性）检测。 活化caspase-3对其英光底物Ac-DEVD-AMC切割，释放出游离的AMC可被英光分光光度计 激发出英光，通过检测反应体系中英光强弱，可判断出caspase-3酶活性的强弱，从而反应 caspase-3的活化情况。（图5a)结果显示，与空载体组相比，在调亡出现比较早期时（转 染后12h)，CMTM1-V5组就能引起细胞内caspase-3活性明显升高CJurkat细胞7倍，Raji 细胞中5倍）。Western blot结果还显示CMTM1-V5超表达可W使caspase-3的底物之一 PARP，caspase9,12都发生了活化，即发生了片段切割。
[0099] Caspase-3是细胞半脫天冬氨酸蛋白酶家族的一员，在细胞调亡过程中可特异 识别底物蛋白质的D1E2V3D4-X序列，并切割D4-X共价键。利用上述原理设计合成的 Caspase-3底物-英光偶联四肤Ac-DEVD-AMC，在共价结合时，AMC不被释放，因此不能被激 发出英光。当Ac-DEVD-AMC被化spase-3特异切割，肤键D4-X消失，释放出的游离AMC被 激发后可发出英光。通过检测反应体系中英光强度的大小，可间接反应化spase-3活性的 强度。本实验即基于上述原理而设计，具体操作简要如下：
[0100] 细胞在全细胞裂解液（lOmM Tris-肥 1，pH7. 5，130mM 化Cl，l% Triton X-100, ImM PMSF)中冰上裂解30分钟，蛋白质浓度用BCA蛋白检测试剂盒测定（Pierce, USA)。 取5g细胞总蛋白，与Caspase-3活性检测缓冲液（25mM肥阳S，抑7. 5, lOOmM化Cl， ImM 邸TA，0. 1 % CHAPS, lOmM DTT)，英光底物 Ac-DEVD-AMC (20M)在 37C 共同赔育。使 用POLARStar度MG L油technology, Germany)英光分光光度计检测AMC释放量，激发光 380nm，发射光460nm。每10分钟测定一次，连续监测120分钟。W英光强度的增加值代表 Caspase-3酶活性，每个样品至少做Η个重复孔。
[010。 实施例6、过表达CMTM1-V5可W抑制NF Κ Β通路活化
[0102] 将pcDB-CMTMl-v5, pcDB空载体等真核表达质粒与P-NF Κ B-Luc报告质粒，Ρ化-ΤΚ 内对照质粒按一定比例共同转染至293T细胞或化rkat细胞中。转染后24小时加入终浓 度PMA (lOOng/ml) +Inomycin (ImM)刺激，每个待测质粒的6个复孔中3个加刺激，3个不加 刺激。刺激6-8小时后收获并按Promega双报告系统说明收获细胞，按说明使用Veritas Microplate Illuminometer机器检测英光素酶活性，并使用Excel软件进行数据处理。
[0103] 实施例7、酵母双杂交及免疫共沉淀验证CMTM1-V5在细胞中与CAML相互作用
[0104] 发明人通过酵母双杂交筛选CMTM1-V5的相互作用祀分子。结果提示在酵母细胞 中，过表达的CMTM1-V5和CAML有相互作用。为了进一步在哺乳动物细胞中验证送两个蛋 白的相互作用，又进行了免疫共沉淀实验进行验证。结果显示，用IgG和GST抗体IP，然后 用HA抗体检测，可W在和INPUT GST-CMTM-V5相同的位置上在GST抗体IP组出现了相应 的条带（图7)，提示CAML和CMTM1-V5可W在细胞内环境下相互结合。
[0105] 实施例8、CMTM1-V5与CAML在化La细胞中共定位分析
[0106] 为进一步证实CMTM1-V5可W与CAML在细胞内相互作用，我们构建了 祀GFP-Nl-CMTMl-v5(绿色）和CAMkFlag质粒，并同时转染至化La细胞中，利用间接免疫 英光检测CAMkFlag的英光定位，并使用激光共聚焦显微镜观察两种分子在细胞内定位的 情况。转染祀GFP-N1-CMTM1-V5质粒的化La细胞于盖玻片上爬片培养，分别用内质网特异 性染料邸 Tracker Blue (lOOnM)和线粒体特异性染料 Mito Tracker Red (lOOnM)在 37°C 赔育30分钟，共聚焦显微镜下观察共定位情况。图8显示；过表达的CMTM1-V5与CAML都 位于细胞浆内，并在核周点状聚集，两者的分布几乎完全重叠，提示CMTM1-V5与CAML在细 胞内共定位。综合CMTM1-V5的亚细胞定位情况，我们推测CMTM1-V5与CAML共同定位于 内质网，并在其中相互作用。送与文献报道CAML是一个位于内质网的蛋白，并且可W与 许多其它蛋白相互作用是相符的。CAMU是在淋己细胞中通过酵母双杂交发现的可W与 切clo地ilin-B (切P，环抱素 A结合蛋白）相结合的一个位于内质网的蛋白质。CAML参与了 淋己细胞众多转录因子的活化。特别是CAML可W通过激活巧依赖calcineurin，进而活化 NF-ATo
[0107] 实施例9、在化rkat细胞中共表达CAML与CMTM1-V5对细胞调亡的影响 [010引 为了验证CMTM1-V5、CAML在功能上的相互作用，将CMTM1-V5、CAML的真核表 达质粒分别转染和共转染至化rkat细胞中，检测细胞调亡的情况。与前述的结果相似， 在化rkat细胞中过表达CMTM1-V5可W引起非常明显的细胞调亡（AV+PI双染的细胞达 31% )，单独转染CAML与对照组相比，对细胞调亡没有明显的影响（13. 30%，4. 27% )。而 当CAML与CMTM1-V5共同转染至化rkat细胞时，CMTM1-V5诱导的调亡被明显的抑制住了 (AV+PI双染的细胞由31. 27%减少至17. 50% )。从数值上看，CMTM1-V5诱导调亡效应的 逆转是非常明显的而不是单纯的两个数值的中和，并且在共转染时我们对加入的质粒量进 行了严格控制，所W我们可W初步推测，CAML与CMTM1-V5共同转染的确可W影响CMTM1-V5 所诱导的细胞调亡。
[0109] 实施例10、过表达CMTM1-V5对NF-AT信号通路有抑制作用，并抑制CAML对NF-AT 通路的活化
[0110] 此前的研究发现CMTM1-V5对NF-AT信号通路有抑制作用。利用双英光素酶报告 基因系统我们比较了单独转染CAML、CMTM1-V5 W及共转两者时英光素酶的活性，结果显示 PMA+Ionomycin刺激后，空白对照pcDB组英光素酶活性增加了 4倍左右，说明细胞已经完全 被活化。而与对照相比，过表达CMTM1-V5可W抑制未加刺激（内源性）和刺激后英光素酶 活性。过表达CAML组的细胞英光素酶活性则明显升高，送与文献报道也是相符的。共表达 CMTM1-V5和CAML时，CMTM1-V5对NFAT的抑制效应则被逆转。通过检测CMTM1-V5和CAML 共表达对细胞调亡和NEAT报告基因活性的影响，我们证实了 CMTM1-V5和CAML相互作用是 有生物学效应的，并且送种相互作用可能是一种负性调节，即CMTM1-V5通过与CAML相互作 用可能抑制了 CAML的某些功能，如细胞内巧离子浓度等，从而表现出抑制NFAT的活性和诱 导调亡的效应。
[0111] 实施例1UCMTM1-V5多肤内化动力学
[0112] 化rkat和Raji细胞培养于含10%热灭活的胎牛血清（FB巧（Hyclone，USA)，100U/ ml 青霉素，lOOg/ml 链霉素，2mM k 谷氨醜胺的 RPMI 1640 化ife Technologies, USA)中。 将FITC-CMTM1-V5多肤加到细胞中，流式细胞分析其内化：用24孔板分别培养化rkat和 Raji细胞，然后与5g/ml門TC-CMTM1-V5多肤在37°C赔育，赔育结束后，用PBS洗细胞2次 后用FACS化libur流式细胞仪度D Biosciences)检测。结果显示，門TC-CMTM1-V5多肤可 W进入Jurkat和Raji细胞。
[0113] 激光共聚焦显微镜分析内化的FITC-CMTM1-V5多肤在细胞内的定位：将Raji细胞 培养在特殊的玻璃底的微孔皿（MatTek CO巧oration, U. S.A.)上，洗涂细胞并加入新鲜的 10 % FBS培养基及FITC-CMTM1-V5多肤至终浓度为20ug/ml。用PBS洗2次，2 %多聚甲醒 室温固定15min。然后细胞用TCS-SP激光扫描共聚焦显微镜观察，核用化echst 33342 (红 色，假色）染色处理后成像。用20ug/ml門TC-CMTM1-V5多肤处理细胞后的显微镜分析显 示英光定位在细胞浆里，散点状分布。
[0114] 实施例12、CMTMl-v5多肤可W诱导细胞调亡
[0115] CMTM1-V5多肤与Raji细胞于37°C共赔育相应的时间，收获细胞并制备成单细胞 悬液，预冷的PBS洗涂2遍，重悬于200 μ 1 Binding Buffer (lOmM肥阳S，抑7. 4,140mM NaCl，lmM MgC12,5mM KC1，2. 5mM CaC12)，加入FITC-Annexin V至终浓度0. 5ug/ml，4°C避 光赔育30分钟，加入PI (propidium iodide)至终浓度1 μ g/ml，上流式细胞仪检测细胞调 亡水平。用Annexin-V/PI (宝赛公司）染色，流式细胞仪检测调亡。收获1万个细胞W上， 计算调亡细胞百分比。
[0116] 实施例13、动物模型构建
[0117] SICD/Beige小鼠，雌性，6-8周，5组，每组7只，共35只。实验组分成低（尾静脉 注射CMTM1-V5多肤400 μ g/只）、中（尾静脉注射CMTM1-V5多肤800 μ g/只）、高（尾静 脉注射CMTM1-V5多肤1600 μ g/只）不同剂量组，第0天均尾静脉注射Raji细胞1*10~7/ 只。实验组尾静脉注射Raji细胞后再注射CMTM1-V5多肤，阴性对照组注射Raji细胞后注 射生理盐水，阳性对照组注射了 Raji细胞后注射阿霉素48ug/只，注射总体积lOOul/只。 第1、2天多肤组均各注射多肤一次。此后按照不同的间隔天数加强注射多肤。注射用盐酸 多柔比星按21天/疗程连续治疗。观察小鼠的生存期。死亡鼠立即取其组织和脏器处理。
[0118] 结果发现CMTM1-V5多肤对小鼠具有非常好的保护作用。
[0119] 实施例14、小鼠各脏器细胞悬液制备
[0120] 摘取小鼠脾脏和肝脏，置于预冷的PBS中，在滤网上用5ml注射器内芯轻柔研 磨，收集细胞悬液，再过一遍滤网，160化pm离必5min，弃上清；加入5ml红细胞裂解液 ACK(0. 15M NH4C1，lOmM K肥03,0.1 mM邸ΤΑ,ρΗ 7. 2-7. 4)重悬细胞，室温放置 5min，加入 5ml PBS，160化pm离必5min，弃上清；沉淀用5mlPBS重悬，进行细胞计数。小鼠股骨骨髓细胞分 离方法如下；逐层剥离皮肤和大腿肌肉，将股骨远端剪开，近端于髓关节处游断，取出股骨， 用1ml注射器顺着骨干方向由近端骨爾刺入，将骨髓排出，培养于含10% FBS的1640中。
[0121] 实施例15、统计学分析
[0122] Student' S T检验分析各组之间是否存在有统计学意义的差异；生存曲线用 GraphPad Prism软件分析统计学差异。p<0.05认为具有统计学差异。
【主权项】
1. CMTM1-V5多肽或编码其的多核苷酸在制备用于治疗受试者白血病的药物的用途，其 中所述多肽选自下组： (1) 具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多肽；或（2)包含与SEQ ID NO :2所述氨基 酸序列有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或97%同源性的氨基酸序列的多肽，其具 有与（2)所述多肽基本相同的生物学功能或活性；或 (2) 所述多肽的功能性片段、变体、类似物或衍生物，它们具有与（2)所述多肽基本相 同的生物学功能或活性。2. 权利要求1的用途，其中所述多核苷酸包括： (1)编码SEQ ID No :1所示氨基酸序列的核苷酸序列；（2)在严格条件下与（1)所述 的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；或（1)所示核苷酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、 90 %、95 %或97 % -致性的核苷酸序列。 3. CMTM1-V5多肽或编码其的多核苷酸在制备用于抑制受试者炎症和/或治疗受试者 自身免疫病的药物的用途，其中所述多肽选自下组： (1) 具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多肽；或（2)包含与SEQ ID NO :2所述氨基 酸序列有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或97%同源性的氨基酸序列的多肽，其具 有与（2)所述多肽基本相同的生物学功能或活性；或 (2) 所述多肽的功能性片段、变体、类似物或衍生物，它们具有与（2)所述多肽基本相 同的生物学功能或活性。4. 权利要求3的用途，其中所述多核苷酸包括： (1)编码SEQ ID No :1所示氨基酸序列的核苷酸序列；（2)在严格条件下与（1)所述 的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；或（1)所示核苷酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、 90 %、95 %或97 % -致性的核苷酸序列。5. -种治疗白血病的药物组合物，该药物组合物包含CMTM1-V5的氨基酸序列或编码 该序列的多核苷酸序列，以及一种或多种药学可接受的载体或赋形剂；其中所述多肽选自 下组： (1) 具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多肽；或（2)包含与SEQ ID NO :2所述氨基 酸序列有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或97%同源性的氨基酸序列的多肽，其具 有与（2)所述多肽基本相同的生物学功能或活性；或 (2) 所述多肽的功能性片段、变体、类似物或衍生物，它们具有与（2)所述多肽基本相 同的生物学功能或活性。6. 权利要求5的药物组合物，其中所述多核苷酸包括： (a)编码SEQ ID No :1所示氨基酸序列的核苷酸序列；（2)在严格条件下与（1)所述 的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；或（1)所示核苷酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、 90 %、95 %或97 % -致性的核苷酸序列。7. -种治疗炎症及自身免疫病的药物组合物，该药物组合物包含CMTM1-V5的氨基酸 序列或编码该序列的多核苷酸序列，以及一种或多种药学可接受的载体或赋形剂；其中所 述多肽选自下组： (1)具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多肽；或（2)包含与SEQ ID NO :2所述氨基 酸序列有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或97%同源性的氨基酸序列的多肽，其具 有与（2)所述多肽基本相同的生物学功能或活性；或 (2)所述多肽的功能性片段、变体、类似物或衍生物，它们具有与（2)所述多肽基本相 同的生物学功能或活性。8.权利要求7的药物组合物，其中所述多核苷酸包括： (1)编码SEQ ID No :1所示氨基酸序列的核苷酸序列；（2)在严格条件下与（1)所述 的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；或（1)所示核苷酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、 90 %、95 %或97 % -致性的核苷酸序列。
【文档编号】A61K48/00GK105879053SQ201410497614
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年9月26日
【发明人】王露, 马大龙, 张国英
【申请人】北京大学