一种自组装靶向纳米药物载体粒子及其制备方法
【专利摘要】本发明公布了一种自组装靶向纳米药物载体粒子的制备方法，包括：八臂羧基聚乙二醇与双氢青蒿素进行酯化反应，得到八臂聚乙二醇?双氢青蒿素结合物；八臂聚乙二醇?双氢青蒿素结合物用NHS活化；活化后的结合物进一步与靶向分子转铁蛋白利用酰胺键进行化学连接；将转铁蛋白修饰的八臂聚乙二醇?双氢青蒿素结合物用透析的方法除去杂质，过滤后冷冻干燥；自组装得到转铁蛋白修饰的纳米药物载体粒子。该纳米粒子具有双层结构，外层为亲水性的聚乙二醇，内层为疏水的小分子药物双氢青蒿素。本发明的优点：采用八臂羧基聚乙二醇大大的提高了载药量；可以实现药物对肿瘤细胞的靶向作用以及肿瘤细胞内的pH敏感释放；靶向治疗减少对正常组织的毒副作用；制备工艺简单，易于操作。
【专利说明】
-种自组装卽向纳米药物载体粒子及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明设及一种自组装祀向纳米药物载体粒子的制备方法。
【背景技术】
[0002] 癌症已成为危害人类健康的主要疾病，治疗癌症的重要手段之一是化学药物治 疗，然而许多抗癌药物存在着难溶于水、稳定性差等缺陷。此外，抗癌药物的选择性差、不良 反应大W及肿瘤存在抗药性等极大地影响了肿瘤治疗的疗效，严重的毒性反应甚至常常迫 使治疗中断。因此，如何增溶难溶性抗癌药物、提高对癌细胞的选择性和降低药物的不良反 应显得非常重要。
[0003] 目前采用亲水性的聚乙二醇来修饰难溶性的药物能极大的提高药物的溶解性及 稳定性。聚乙二醇(P〇lyethyleneglyool，PEG)是用环氧乙烧与水或乙二醇逐步加成聚合得 到的分子量较低的水溶性聚酸，其重复单元为氧乙締基，端基为两个径基，呈线性或支化链 状结构。阳G是迄今为止已知高分子中蛋白和细胞吸收水平最低的高分子，由于无毒及良好 的生物相容性，PEG已被抑A批准为体内注射用高分子。药物的聚乙二醇修饰即聚乙二醇化， 通常是将活化的聚乙二醇通过化学方法偶联到蛋白质、多肤、小分子药物和脂质体上。1977 年Abuchowski等首次将甲氧基聚乙二醇(metho巧polyethylene glyeol，m阳G)共价连接 到蛋白质上，获得疗效优于未修饰原型药物的mPEG-蛋白质结合物之后，PEG修饰技术逐渐 受到重视，已成为目前药物化学修饰的研究热点。聚乙二醇修饰的药物与未修饰的药物相 比，具有W下突出的优点：（1)溶解性提高；（2)对肿瘤有更强的被动祀向作用；（3)半衰期 延长；（4)最大血药浓度降低；（5)血药浓度波动较小；（6)酶降解作用减少；（7)免疫原性及 抗原性减小；（8)毒性降低；（9)生物活性增强；（10)用药频率减少。
[0004] 为提高药物对肿瘤细胞的选择性，减少对正常组织细胞的毒副作用，通过配体-受 体介导的主动祀向药物传递系统已经成为癌症治疗研究的热点。转铁蛋白是是一种非血红 素结合铁的0-球蛋白，广泛分布于脊椎动物的体液及细胞中，分血清转铁蛋白，卵转铁蛋 白，乳转铁蛋白Ξ种。不同种类的转铁蛋白有不同的物理，化学和免疫特性，但均为具有两 个化结合位点的单肤链糖蛋白，其中W血清转铁蛋白含量最多，广泛分布且提供绝大多数 组织器官所需的铁。转铁蛋白受体是一种跨膜糖蛋白，分子量约170~200 kD。肿瘤细胞表面 的转铁蛋白受体是正常细胞的2~7倍，肿瘤细胞表面转铁蛋白与转铁蛋白受体亲和力是正 常细胞的10倍~100倍。恶性肿瘤表面转铁蛋白受体的超量表达提供了转铁蛋白作为导向基 团的可能性。
[0005] 本发明的目的是建立一种祀向纳米药物载体粒子的制备方法，首先通过八臂簇基 聚乙二醇与小分子疏水药物双氨青葛素进行化学连接，增大药物的溶解性、稳定性W及半 衰期;进一步采用祀向分子转铁蛋白修饰，提高对肿瘤细胞的选择性，减少对正常组织细胞 的毒副作用;最后通过自组装形成祀向纳米药物载体粒子。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是建立一种祀向纳米药物载体粒子的制备方法，该药物载体粒子具 有W下优点:载药量高;稳定性好;可实现药物对癌细胞的祀向传递及癌细胞内pH敏感性释 放。
[0007] 合成的转铁蛋白-聚乙二醇-双氨青葛素结合物通过自组装形成的祀向纳米药物 载体粒子具有双层结构，外层为亲水性的八臂簇基聚乙二醇，进一步通过祀向分子转铁蛋 白修饰；内层为疏水的小分子药物双氨青葛素。
[0008] 所述的转铁蛋白-聚乙二醇-双氨青葛素聚结合物为W下的结构：
其中： 聚乙二醇为八臂簇基聚乙二醇； 本发明的技术方案： 1) 八臂聚乙二醇修饰双氨青葛素
2) 转铁蛋白修饰活化的八臂聚乙二醇-双氨青葛素结合物
3) 纳米粒子的制备 用沉淀法自组装制备纳米粒子。具体方法:将合成的转铁蛋白-聚乙二醇-双氨青葛素 聚结合物溶于DMS0中，逐滴加入到轻微揽拌水溶液中，纯水透析化;过滤后，冷冻干燥得到 祀向纳米药物粒子。
[0009] 本发明的优点： 1) 通过聚乙二醇的改性可对双氨青葛素的结合药物提供保护，提高了其稳定性和水溶 性，降低了毒性，并延长了双氨青葛素在生物体中的循环半衰期，同时具有多个官能团的八 臂聚乙二醇有较大的载药量，保证了适当的药物浓度和提供缓释功能； 2) 自组装祀向纳米药物载体粒子具有祀向释放药物功能，可有效的减少药物对正常组 织细胞的毒副作用； 3)制备工艺简单，易于操作。
【具体实施方式】
[0010]下面给出的实例对本发明进行具体描述，但不限制本发明，本发明的范围由权利 要求限定。
[00川实施例1: 八臂聚乙二醇（10邸a)-双氨青葛素结合物的合成：向50ml干燥的Ξ口瓶中持续通入 化;在化的保护下将0.2?双氨青葛素，1.25g八臂簇基聚乙二醇(Mw 10，000)溶于15ml二氯 甲烧中，再添加0.19g邸C，0.12g DMAP，0 °C下揽拌溶解，揽拌反应1小时，然后室溫揽拌反 应2地；待反应结束后，旋蒸除去溶剂，100ml冰乙酸沉淀，过滤后得到八臂聚乙二醇-双氨 青葛素结合物粗品；用20ml DMF^PA (l:4(v/v))重结晶，滤去不溶物，产物用100ml乙酸沉 淀，过滤，产物真空干燥，得到纯度95%W上的八臂聚乙二醇-双氨青葛素结合物； 转铁蛋白-八臂聚乙二醇（10 KDa)-双氨青葛素结合物的合成:0.05g八臂聚乙二醇-双 氨青葛素结合物溶于20ml水溶液中，加入lOmg抓C，5mg NHS，3mg DMAP活化化；随后加入转 铁蛋白0.36g室溫下伴随轻微的揽拌反应化;反应后的溶液移至透析袋中透析化除去未反 应的试剂，过滤后冷冻干燥得到转铁蛋白修饰的八臂聚乙二醇-双氨青葛素结合物； 纳米粒子的制备：用沉淀法来制备纳米粒子;50mg转铁蛋白-八臂聚乙二醇-双氨青葛 素结合物溶解于0.2ml DMS0中，逐滴加入到3.8ml轻微揽拌的水溶液中；然后将转铁蛋白- 八臂聚乙二醇-双氨青葛素溶液移至透析袋中透析化，滤膜过滤后，冷冻干燥得到祀向纳米 药物载体粒子。
[0012]实施例2: 八臂聚乙二醇(20邸a)-双氨青葛素结合物的合成：向50ml干燥的Ξ口瓶中持续通入 化;在化的保护下将0.14g双氨青葛素，1.25g八臂簇基聚乙二醇(Mw 20，000)溶于15ml四氨 巧喃中，再添加0.10g邸C，0.06g DMAP，0 °C下揽拌溶解，揽拌反应1小时，然后室溫揽拌反 应2地；待反应结束后，旋蒸除去溶剂，100ml冰乙酸沉淀，过滤后得到八臂聚乙二醇-双氨 青葛素结合物粗品；用20ml DMF^PA (l:4(v/v))重结晶，滤去不溶物，产物用100ml乙酸沉 淀，过滤，产物真空干燥，得到纯度95%W上的八臂聚乙二醇-双氨青葛素结合物； 转铁蛋白-八臂聚乙二醇（20邸a)-双氨青葛素结合物的合成：0.05g八臂聚乙二醇- 双氨青葛素结合物溶于20ml水溶液中，加入lOmg抓C，5mg N服，3mg DMAP活化化;随后加入 转铁蛋白0.1?室溫下伴随轻微的揽拌反应化;反应后的溶液移至透析袋中透析化除去未 反应的试剂，过滤后冷冻干燥得到转铁蛋白修饰的八臂聚乙二醇-双氨青葛素结合物； 纳米粒子的制备：用沉淀法来制备纳米粒子;50mg转铁蛋白-八臂聚乙二醇-双氨青葛 素结合物溶解于0.2ml DMS0中，逐滴加入到3.8ml轻微揽拌的水溶液中；然后将转铁蛋白- 八臂聚乙二醇-双氨青葛素溶液移至透析袋中透析化，滤膜过滤后，冷冻干燥得到祀向纳米 药物粒子。
[001引实施例3: 八臂聚乙二醇(40邸a)-双氨青葛素结合物的合成：向50ml干燥的Ξ口瓶中持续通入 化;在化的保护下将0. Hg双氨青葛素，2.50g八臂簇基聚乙二醇(Mw 40，000)溶于20ml 1，3- 二氧六环中，再添加 O.lOg抓C，0.06g DMAP，0 °C下揽拌溶解，揽拌反应1小时，然后室溫揽 拌反应24h;待反应结束后，旋蒸除去溶剂，100ml冰乙酸沉淀，过滤后得到八臂聚乙二醇- 双氨青葛素结合物粗品；用20ml DMF^PA (l:4(v/v))重结晶，滤去不溶物，产物用100ml乙 酸沉淀，过滤，产物真空干燥，得到纯度95%W上的八臂聚乙二醇-双氨青葛素结合物； 转铁蛋白-八臂聚乙二醇(40 KDa)-双氨青葛素结合物的合成:0.05g八臂聚乙二醇-双 氨青葛素结合物溶于20ml水溶液中，加入lOmg抓C，5mg NHS，3mg DMAP活化化；随后加入转 铁蛋白0.09g室溫下伴随轻微的揽拌反应化;反应后的溶液移至透析袋中透析化除去未反 应的试剂，过滤后冷冻干燥得到转铁蛋白修饰的八臂聚乙二醇-双氨青葛素结合物； 纳米粒子的制备：用沉淀法来制备纳米粒子;50mg转铁蛋白-八臂聚乙二醇-双氨青葛 素结合物溶解于0.2ml DMS0中，逐滴加入到3.8ml轻微揽拌的水溶液中；然后将转铁蛋白- 八臂聚乙二醇-双氨青葛素溶液移至透析袋中透析化，滤膜过滤后，冷冻干燥得到祀向纳米 药物粒子。
[0014] 实施例4: 八臂聚乙二醇（10邸a)-双氨青葛素结合物的合成：向50ml干燥的Ξ口瓶中持续通入 化;在化的保护下将〇.2始双氨青葛素，1.25g八臂簇基聚乙二醇(Mw !0,000)溶于15ml 1,4- 二氧六环中，再添加〇.19g EDC，0.12g DMAP，0 °C下揽拌溶解，揽拌反应1小时，然后室溫揽 拌反应2地；待反应结束后，旋蒸除去溶剂，100ml冰乙酸沉淀，过滤后得到八臂聚乙二醇- 双氨青葛素结合物粗品；用20ml DMF^PA (l:4(v/v))重结晶，滤去不溶物，产物用100ml乙 酸沉淀，过滤，产物真空干燥，得到纯度95%W上的八臂聚乙二醇-双氨青葛素结合物； 转铁蛋白-八臂聚乙二醇（10邸a)-双氨青葛素结合物的合成：0.05g八臂聚乙二醇- 双氨青葛素结合物溶于20ml水溶液中，加入lOmg抓C，5mg N服，3mg DMAP活化化;随后加入 转铁蛋白0.3?室溫下伴随轻微的揽拌反应化;反应后的溶液移至透析袋中透析化除去未 反应的试剂，过滤后冷冻干燥得到转铁蛋白修饰的八臂聚乙二醇-双氨青葛素结合物； 纳米粒子的制备：用沉淀法来制备纳米粒子;50mg转铁蛋白-八臂聚乙二醇-双氨青葛 素结合物溶解于0.2ml DMS0中，逐滴加入到3.8ml轻微揽拌的水溶液中；然后将转铁蛋白- 八臂聚乙二醇-双氨青葛素溶液移至透析袋中透析化，滤膜过滤后，冷冻干燥得到祀向纳米 药物粒子。
【主权项】
1. 一种自组装革G向纳米药物载体粒子及其制备方法，其结构特征在于：由粒径为100~ 200 nm的纳米粒子组成，由转铁蛋白-八臂聚乙二醇-双氢青蒿素结合物通过自组装形成， 所述的纳米药物载体粒子的制备步骤如下： (1) 八臂聚乙二醇-双氢青蒿素结合物的制备：以双氢青蒿素为原料，在N2保护下，将双 氢青蒿素、八臂聚乙二醇溶于有机溶剂中，〇 °C下加入有机碱作为催化剂反应1小时，然后 移至室温下反应24 h;待反应结束后，旋蒸除去溶剂，冰乙醚沉淀，过滤后得到八臂聚乙二 醇-双氢青蒿素结合物粗品；二甲基甲酰胺(DMF)-异丙醇(IPA)重结晶、过滤，冰乙醚沉淀过 滤后真空干燥，然后得到纯度95%以上的八臂聚乙二醇-双氢青蒿素结合物； (2) 将（1)所述的八臂聚乙二醇-双氢青蒿素结合物利用N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)进行 活化，然后将靶向分子转铁蛋白在有机碱的作用下与活化后的八臂聚乙二醇-双氢青蒿素 结合物在水溶液中进行化学连接，得到转铁蛋白-八臂聚乙二醇-双氢青蒿素结合物，进一 步采用透析的方法除去杂质； (3) 采用沉淀法制备纳米粒子，将转铁蛋白-八臂聚乙二醇-双氢青蒿素结合物溶解于 二甲基亚砜(DMSO)中，逐滴加入到轻微搅拌的水溶液中；然后将转铁蛋白-八臂聚乙二醇-双氢青蒿素结合物溶液移至透析袋中纯水透析3h，滤膜过滤后，冷冻干燥得到靶向纳米药 物粒子。2. 根据权利要求1所述自组装靶向纳米药物载体粒子及其制备方法，其特征在于，所述 的有机溶剂为二氯甲烷、四氢呋喃、1，3-二氧六环、1，4-二氧六环中的一种。3. 根据权利要求1所述自组装靶向纳米药物载体粒子及其制备方法，其特征在于，所述 的八臂聚乙二醇为八臂羧基聚乙二醇，分子量为10000~40000道尔顿。4. 根据权利要求1所述自组装靶向纳米药物载体粒子及其制备方法，其特征在于，所述 的有机碱为可溶于水的碳二亚胺(EDC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)。5. 根据权利要求1所述自组装靶向纳米药物载体粒子及其制备方法，其特征在于，所述 的有机碱EDC和DMAP与双氢青蒿素的摩尔比都为1:1。6. 根据权利要求1所述自组装靶向纳米药物载体粒子及其制备方法，其特征在于，所述 的的DMF与IPA的比例为1:4。7. 根据权利要求1所述自组装靶向纳米药物载体粒子及其制备方法，其特征还在于，所 述的纳米粒子具有双层结构，外层为亲水性的八臂聚乙二醇，内层为疏水的小分子药物双 氢青蒿素。
【文档编号】A61K31/366GK105879050SQ201610337766
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年5月22日
【发明人】雷建都, 刘刻峰, 何静
【申请人】北京林业大学