一种具有还原刺激响应性纳米药物载体及其制备方法

一种具有还原刺激响应性纳米药物载体及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种具有还原刺激响应性纳米药物载体及其制备方法，具有还原刺激响应性纳米药物载体以白蛋白和石墨烯为骨架通过二硫键相互连接。本发明还提供一种具有还原刺激响应性纳米药物载体的制备方法，以油包水型微乳为纳米反应器，以白蛋白和氧化石墨烯或还原性氧化石墨烯或石墨烯量子点为原料，以胱胺为连接试剂，在白蛋白与石墨烯、白蛋白与白蛋白、石墨烯与石墨烯之间形成二硫键，以微乳的空间限域作用获得粒度比较均匀的“白蛋白?石墨烯”纳米复合粒子。本发明获得的纳米复合粒子作为药物载体不仅有很高的载药能力，而且，能在还原剂的刺激下迅速释放其中的药物，在肿瘤靶向治疗领域有重要的应用前景。
【专利说明】
一种具有还原刺激响应性纳米药物载体及其制备方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种具有还原刺激响应性纳米药物载体及其制备方法，具体是涉及在微乳中将白蛋白和石墨烯以二硫键相互连接而形成纳米复合粒子作为药物载体的方法，属于生物材料领域。
【背景技术】
[0002]将药物靶向输送到肿瘤部位，减少药物对正常组织的伤害，是肿瘤治疗领域所需解决的重要课题。作为靶向药物载体，要求其生物相容性好、载药量高、能将药物选择性地释放到肿瘤组织。构建合适的载体是肿瘤药物靶向输送的关键。
[0003]白蛋白是一种重要的药物载体，白蛋白具有生物相容性好，几乎无毒，可生物降解，无抗原性等优点。而且，肿瘤组织中富含类似白蛋白受体的蛋白一一半胱氨酸的酸性分泌蛋白，可以粘附白蛋白(secreted protein acidic and rich in cysteine, SPARC)，因此，静脉注射后的载药白蛋白粒子，除了可以通过肿瘤的EPR效应(enhanced permeabilityand retent1n effect)(肿瘤组织比正常组织有更高的对大分子和纳米粒子的渗透性和滞留性)被动靶向肿瘤组织，还能通过肿瘤组织的SPARC对载药白蛋白的吸引与粘附而聚集到肿瘤部位。如果进一步在白蛋白载体上连接肿瘤特异性的抗体或多肽，则将进一步提高其对肿瘤的靶向送药能力。
[0004]药物可通过共价偶联与白蛋白载体结合，也可以通过物理包埋的方式进入白蛋白载体中。与共价反应相比，物理结合的方式可以最大限度地保留药物的原有特性，也可以使进入靶组织的载药白蛋白彻底释放药物，提高药物的利用率。然而，通过物理包埋的方式获得的载药白蛋白，其载药量有限。
[0005]如果将石墨烯包埋到白蛋白载体中，石墨烯和白蛋白作为药物的共同载体，则不仅能提高载药量，还增强了药物的缓释功能。石墨烯是以SP2杂化的碳原子构成的具有六元环特征的二维周期性点阵结构材料，仅有一层碳原子，因此，是目前世界上最薄的二维材料，具有极大的比表面积。石墨烯的两个表面以及周围边界均能吸附药物，对于与石墨烯分子结构相似的药物具有极高的载药量。当石墨烯的二维尺寸降低到1-1Onm时，就成为具有量子限域效应的石墨烯量子点，石墨烯量子点比大尺寸的石墨烯有更大的比表面积，是药物的优良载体。
[0006]在当前的技术中，白蛋白是通过物理吸附作用与石墨烯结合的，或通过共价键如酰胺键与石墨稀连接的。
[0007]对于采用物理吸附的方法，例如何蔼等人将0.3mL浓度为200 g/mL的牛血清白蛋白(BSA)加入到5 mg/mL的氧化石墨稀(G0)(G0总质量为4 g)中进行机械搅拌2min和超声波分散1min的处理，然后静置过夜，得到石墨烯负载白蛋白的复合物(G0-BSA)，在这种方法中，BSA水过量的，与石墨烯表面接近的BSA是通过分子间力的作用与GO吸附的，而距离较远的BSA，则完全是强制性地与GO简单物理混合，最终形成水凝胶[何蔼，等.生物高分子一氧化石墨烯三维多功能复合凝胶的制备及其血液净化性能.功能高分子学报.2014，27(1):54-61.]。再如，梁汝萍等人将聚多巴胺与GO混合，并将该混合物固定于微流控芯片分离通道内，然后加入BSA水溶液，4°C下静置反应4h，得到的复合物中，BSA通过聚多巴胺的粘附作用与GO结合，与直接的物理吸附相比，具有强粘附性能的聚多巴胺能较牢固地将BSA与GO连接。
[0008]对于采用化学合成的方法，例如Jianfeng Shen等人采用1_(3_二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)处理羧基化的氧化石墨烯(GO)，然后加入牛血清白蛋白(BSA)，G0上活化的羧基与BSA上的氨基反应形成酰胺键，获得BSA包覆的GO，即G0-BSA 复合物[Jianfeng Shen.et al.Covalent attaching protein tographene oxide via diimide—activated amidat1n.Colloids and Surfaces B:B1interfaces 81 (2010) 434-438.]。与物理吸附方法相比，通过酰胺键结合而获得的GO-BSA复合物结构更加稳定，BSA能长时间与GO结合，而且也增加了GO在水溶液中的分散稳定性，GO-BSA的水溶液静置3个月后仍然无明显沉淀。Bing Cai等人采用同样的方法将BSA通过酰胺键结合到GO上，获得血液相容性非常好的GO-BSA复合物[Bing Cai，et al.Bovine serum albumin b1conjugated graphene oxide: Red blood celladhes1n andhemolysis studied by QCM-D.Applied Surface Science 356 (2015) 844-851.]。
[0009]上述通过物理吸附或酰胺键作用而获得的石墨烯与白蛋白的复合物，白蛋白分子层与石墨烯之间的结合，要么比较松散(通过简单物理吸附)，要么比较牢固(如酰胺键结合或通过中间粘附分子结合)，石墨烯与白蛋白之间的结合力，也不会因肿瘤组织与正常组织的差异而有所不同。如果将其作为抗癌药物的输送载体，难以将药物高效选择性地释放到肿瘤组织中。

【发明内容】

[0010]为克服现有技术的不足，本发明目的在于提供一种具有还原刺激响应性纳米药物载体。
[0011]本发明的再一目的在于:提供所述具有还原刺激响应性纳米药物载体的制备方法。
[0012]本发明的又一目的是提供所述具有还原刺激响应性纳米药物载体的应用。
[0013]本发明所提供的一种具有还原刺激响应性纳米药物载体，以白蛋白分子作为壳层包覆在石墨稀上，形成纳米复合粒子，该纳米复合粒子中，白蛋白与石墨稀之间、白蛋白与白蛋白之间、石墨稀与石墨稀之间均由二硫键(-S-S-)连接。
[0014]所述的白蛋白是指牛血清白蛋白或人血清白蛋白中的一种；
所述的石墨烯是指氧化石墨烯、还原性氧化石墨烯或石墨烯量子点中的一种。
[0015]所述的石墨烯量子点是指表面带羧基的石墨烯量子点。
[0016]所述的具有还原刺激响应性纳米药物载体的制备方法，是以油包水型微乳为纳米反应器，以所述的白蛋白和石墨烯为原料，以胱胺为连接试剂，在油包水型微乳中进行制备的，包括如下步骤:
步骤一，配制如下微乳:
(I)表面含羧基的石墨烯的微乳:配制表面含羧基的石墨烯的水溶液，石墨烯浓度为
0.05-20 mg/mL，然后将石墨稀水溶液与环己烧、Triton X-100和正己醇混合； (2)白蛋白的微乳:配制白蛋白的水溶液，白蛋白浓度为0.05-30mg/mL，然后将白蛋白水溶液与环己烧、Triton X-100和正己醇混合；
(3)胱胺微乳:配制胱胺的水溶液，胱胺浓度为0.05-5mg/mL，然后将胱胺水溶液与环己烧、Triton X-100和正己醇混合；
(4)EDC微乳，或EDC/NHS微乳:配制EDC或EDC/NHS的水溶液，EDC浓度在0.02-10mg/mL之间，EDC与NHS的质量比为1:5?1:1之间，然后将EDC水溶液或EDC/NHS水溶液与环己烷、Triton X-100和正己醇混合;其中，所述的EDC，全称为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐;所述的NHS，全称为N-羟基琥珀酰亚胺；
上述步骤(1)-(4)中，Triton X-100与正己醇的体积比在(1:1)?(2:1)之间，TritonX-100与正己醇的混合溶液与环己烷的体积比在(2: 3)?(1:3)之间。向环己烷、Tr i ton X-100与正己醇三者的混合溶液所加入的水相体积的量保证混合体系不发生浑浊。
[0017]步骤二，将步骤一获得的微乳进行如下混合
(1)将EDC微乳或EDC/NHS微乳加入到石墨烯的微乳中，室温振荡15min-60 min，使石墨烯表面的羧基活化，然后加入胱胺微乳，并于室温振荡0.5 - 5h，使石墨烯之间以二硫键相互连接，此混合微乳标记为微乳A;EDC微乳或EDC/NHS微乳与石墨烯微乳以及与胱胺微乳的体积比在2:1:0.5-1:3:0.5之间；
(2)向BSA微乳中加入EDC微乳或EDC/NHS微乳，BSA微乳与EDC微乳或EDC/NHS微乳的体积比5:0.1-1:2，室温振荡15 min-60 min，此混合微乳标记为微乳B;同时，向微乳A中再加入EDC微乳或EDC/NHS微乳，微乳A与EDC微乳或EDC/NHS微乳的体积比为5:0.1-5:2，室温振荡15 min-60 min此混合微乳标记为微乳C ；将微乳B、微乳C和胱胺微乳混合，微乳B与微乳C以及与胱胺微乳的体积比为6:6:1-6:1:1，于室温振荡0.5 - 5h，使白蛋白与石墨稀之间、白蛋白与白蛋白之间形成二硫键，此混合微乳标记为微乳D;
(3)向上述微乳D中滴加甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、丙酮、四氢呋喃中的一种溶剂或几种的混合溶剂，边滴加边进行超声波振荡处理0.5-2 h，所述溶剂与微乳D的体积比为
0.025:1-0.2:1；
(4)在上述步骤(3)完成之后，进行离心，沉淀分散于无水乙醇中，超声波处理l-5min后，再离心，如此重复3-5次，所得沉淀再用去离子水洗涤3-5次，得到白蛋白包覆石墨烯的纳米复合粒子。
[0018]所述的具有还原刺激响应性纳米药物载体，用于装载肿瘤化疗药物或光敏剂药物或同时装载肿瘤化疗药物和光敏剂药物，形成载药纳米粒子，用于肿瘤靶向治疗。
[0019]本发明以微乳为纳米反应器，制备由白蛋白和石墨烯通过二硫键相互连接而成的纳米复合粒子，与不含二硫键的“白蛋白-石墨烯”纳米复合粒子相比，“白蛋白-S-S-白蛋白-S-S-石墨烯-S-S-石墨烯”在药物释放方式方面有很大进步。此外，油包水型微乳内的水相对所构建的“白蛋白-S-S-白蛋白-S-S-石墨烯-S-S-石墨烯”纳米复合粒子的粒度进行控制，因此，所获得的纳米复合粒子不仅小而且比较均匀;这种纳米复合粒子在负载药物并经过静脉注射后，在正常组织中保存结构的完整性，但是，一旦其循环进入到肿瘤组织，就会因肿瘤组织高浓度的谷胱甘肽的还原刺激作用而发生二硫键(-S-S-)断裂，纳米粒子结构破坏，释放其中的药物，达到肿瘤靶向给药的效果。
【附图说明】
[0020]附图1.(BSA-S-S-BSA)-S-S-(GQDs-S-S-GQDs)纳米粒子的透射电子显微镜(TEM)照片；
附图2.(BSA-S-S-BSA)-S-S-(GQDs-S-S-GQDs)-DOX在谷胱甘肽还原刺激下的响应释药，(a) (BSA-S-S-BSA)-S-S-(GQDs-S-S-GQDs) -DOX中加入谷胱甘肽后，药物DOX释放并充满整个溶液，难以离心得到沉淀，表现出良好的还原刺激响应性释药的特性；(b)(BSA-S-S-BSA)-S-S-(GQDs-S-S-GQDs )-D0X仅与去离子水混合，离心后样品全部沉淀，上清液中几乎无药物DOX。
【具体实施方式】
[0021]实施例1
制备石墨烯量子点(GQDs)，方法是:将L-谷氨酸(5 g)置于烧杯中，放入马弗炉中于250° C加热3.5 h，自然冷却后，加入30 mL去离子水，超声波分散，然后离心，取上清液，并加入少许氢氧化钠至碱性，然后透析，多次更换透析外液，直至将收集的上清液变成中心，然后对透析后的上清液进行冷冻干燥，即得GQDs。透射电子显微镜(TEM)下观察显示，GQDs仅5-1 Onm。所得GQDs有极好的水溶性，红外光谱表明GQDs富含羧基。
[0022]制备微乳前液:先将14 mL的Triton X_100、14 mL的正己醇与42 mL的环己烧混合，标记为“微乳前液”。然后配制如下微乳:
(I)石墨烯量子点(GQDs)微乳的配制:将GQDs冷冻干燥粉末分散于去离子水中，GQDs浓度为8 mg/mL，取0.2 mL的GQDs，将其加入到2.5 mL的微乳前液中，室温振荡约3 min；
(2 )EDC/NHS微乳的配制:分别称取EDC和NHS粉末，共同溶于去离子水中，其中，EDC浓度为5 mg/mL，NHS浓度为25 mg/mL，取该EDC/NHS水溶液0.5 mL，加入到6.25mL微乳前液中，室温振荡约3 min；
(3)牛血清白蛋白(BSA)微乳的配制:称取BSA粉末，将其分散于去离子水中，BSA浓度为
2mg/mL，取该BSA溶液0.5 mL，加入到6.25 mL的微乳前液中，室温振荡约3 min；
(4)胱胺微乳的配制:将精确称取的胱胺溶于去离子水中，胱胺浓度为Img/mL，取该胱胺溶液0.2 11^，加入到2.5 mL的微乳前液中，室温振荡约3 min。
[0023]上述各微乳中，“环己烷+ Triton X-100 +正己醇”(即微乳前液)与所加水相的体积比均为25: 2，微乳前液中，Triton X-100与正己醇的体积比为1:1，环己烷与“TritonX-100 +正己醇”的体积比，为3:2。
[0024]然后合成纳米粒子，方法如下:
将所配制的GQDs微乳(约2.7mL)与2.5 mL的EDC/NHS微乳混合，室温搅拌lh，使GQDs上的羧基活化；向该羧基活化的GQDs微乳中加入1.25 mL的胱胺微乳，室温搅拌4 h，使GQDs在微乳的内水相中以二硫键相互交联(标记为混合微乳A)。然后向该混合微乳中再加入1.25mL的EDC/NHS微乳，搅拌I h后(标记为混合微乳B);同时，将1.25mL的EDC/NHS微乳与6.25 mL的BSA微乳混合(标记为混合微乳C);然后将混合微乳C与B混合，并滴加1.25 mL的胱胺微乳，室温搅拌反应4h(标记为混合微乳D)。
[0025]向获得的混合微乳D中滴加ImL的四氢呋喃，使微乳中的BSA变性固化，边滴加边超声分散处理，再加入5mL的无水乙醇，离心，收集沉淀，沉淀用无水乙醇洗涤3次，然后用去离子水洗涤3次，沉淀即为BSA与GQDs以二硫键相互连接的纳米复合粒子，简写为(BSA-S-S-BSA)-S-S-(GQDs-S-S-GQDs) ο
[0026]实验结果:
将上述制备的(BSA-S-S-BSA)-S-S-(GQDs-S-S-GQDs)分散于2 mL去离子水中，TEM观察发现，大部分纳米复合粒子(BSA-S-S-BSA)-S-S-(GQDs-S-S-GQDs)为短棒状颗粒，粒度分布比较均匀，棒长50-100nm，直径 10-20 nm，如附图1 (BSA-S-S-BSA)-S-S-(GQDs-S-S-GQDs)纳米粒子的TEM照片所示。
[0027]为考察(BSA-S-S-BSA)-S-S-(GQDs-S-S-GQDs)的载药能力和其还原刺激响应释药的特性，将 I mL的(BSA-S-S-BSA)-S-S-(GQDs-S-S-GQDs)加入到2mL浓度为 1yg/mL的盐酸阿霉素(DOX)的水溶液中，室温混合12 h，溶液等份2份，同时离心，沉淀用去离子水洗涤2次，即得包埋 DOX 的载药粒子:(BSA-S-S-BSA)-S-S-(GQDs-S-S-GQDs)-DOX。
[0028]由于(BSA-S-S-BSA)-S-S-(GQDs-S-S-GQDs)对DOX有比较强烈的吸附，载药后的粒子即(BSA-S-S-BSA)-S-S-(GQDs-S-S-GQDs)-DOX 的沉淀显示为橘红色。
[0029]按本实施例相同的方法制备不含GQDs的由二硫键交联的BSA纳米粒子，当其与DOX混合后，通过DOX的标准曲线检测可得，(BSA-S-S-BSA)-S-S-(GQDs-S-S-GQDs)-DOX中的DOX的量是(BSA-S-S-BSA) -DOX中的DOX的2倍左右。可见，本发明获得的新型载药粒子有很高的载药能力。
[0030]向上述其中I份(BSA-S-S-BSA) -S-S- (GQDs-S-S-GQDs) -DOX载药粒子沉淀中加入ImL浓度为lmg/mL的谷胱甘肽，另I份载药粒子沉淀中加入ImL的去离子水，2h后进行离心，结果表明，加入谷胱甘肽的样品溶液，离心后几乎没有沉淀，整个溶液显示为橘红色，而加入去离子水的样品溶液，离心后产生沉淀，沉淀为橘红色，上清液接近无色。这表明:
(BSA-S-S-BSA) -S-S-(GQDs-S-S-GQDs) -DOX在谷胱甘肽的作用下，载药粒子中的-S-S-发生断裂，纳米粒子解离成分子状态，并释放其中的药物D0X，于是样品难以通过离心而沉淀，释放出的DOX充满了整个溶液;而仅仅与去离子水混合的(BSA-S-S-BSA)-S-S-(GQDs-S-S-GQDs)-D0X保持结构的完整性，粒子溶液通过离心而沉淀，因几乎无DOX释放，离心后的上清液没有D0X，上清液接近无色，这些结果如附图2所示:(BSA-S-S-BSA)-S-S-(GQDs-S-S-GQDs) -DOX在谷胱甘肽还原刺激下的响应释药。
[0031](a)(BSA-S-S-BSA)-S-S-(GQDs-S-S-GQDs)-DOX 中加入谷胱甘肽后，药物 DOX 释放并充满整个溶液，难以离心得到沉淀，表现出良好的还原刺激响应性释药的特性；
(b)(BSA-S-S-BSA)-S-S-(GQDs-S-S-GQDs)-DOX仅与去离子水混合，离心后样品全部沉淀，上清液中几乎无药物DOX。
[0032]实施例2
制备微乳前液:先将6 mL的Triton X_100、3 mL的正己醇与27 mL的环己烧混合，标记为“微乳前液”。
[0033]GQDs、EDC/NHS、BSA和胱胺的水溶液为实施例1所剩余的样品，即GQDs水溶液的浓度为8 mg/mL;EDC/NHS中的EDC为5 mg/mL，NHS为25 mg/ml^BSASSmg/mLjjfeKSl mg/mL。然后配制如下微乳:
(I)GQDs的微乳:0.35 mL的GQDs水溶液滴加到2.5mL的微乳前液中，室温振荡约3 min; (2)EDC/NHS的微乳:0.875 mL的EDC/NHS水溶液滴加到6.25mL微乳前液中，室温振荡约
3min；
(3沌5六的微乳:0.875 mL的BSA水溶液滴加到6.25mL微乳前液中，室温振荡约3 min；
(4)胱胺微乳:0.35 mL的胱胺水溶液滴加到2.5mL的微乳前液中，室温振荡约3 min。
[0034]上述各微乳中，“环己烷+ Triton X-100 +正己醇”(即微乳前液)与所加水相的体积比均为25: 3.5，微乳前液中，Triton X-100与正己醇的体积比为2:1，环己烷与“Triton X-100 +正己醇”的体积比，为3:1。
[0035]然后按实施例1相同的方法合成纳米粒子，混合时各微乳的量与实施例1相同。
[0036]实验结果:
TEM观察发现，所得纳米粒子(BSA-S-S-BSA)-S-S-(GQDs-S-S-GQDs)仍然呈短棒状，但棒的长度比实施例1的要长，大部分为50-200 nm。
[0037]按实施例1相同的方法装载化疗药物D0X，结果在加入谷胱甘肽之后，DOX很快释放，而对照组中(加入去离子水组)，载药粒子经过离心后很快沉淀，未见有明显的DOX释放，表明所制备的(BSA-S-S-BSA)-S-S-(GQDs-S-S-GQDs)纳米粒子在谷胱甘肽作用下结构破坏，具有非常敏感的还原刺激响应的特点。
[0038]实施例3
按实施例2相同的方法配制GQDs、EDC/NHS、BSA和胱胺的微乳，然后按实施例1相同的方法合成纳米粒子，但混合时各微乳的量与实施例1不同，如下。
[0039]取所配制的GQDs微乳(2.7mL)与5.4 mL的EDC/NHS微乳混合，室温搅拌Ih;向该羧基活化的GQDs微乳中加入1.35 mL的胱胺微乳，室温搅拌4 h(标记为混合微乳A)，该混合微乳A中，EDC/NHS微乳:石墨烯微乳:胱胺微乳=2:1:0.5(体积比)。
[0040]将0.1251111^仙0(:/順5微乳与6.25 mL的BSA微乳混合(BSA微乳:EDC/NHS=5:0.1(体积比))(标记为混合微乳B)，搅拌30min。并向上述混合微乳A中再加入0.189 mL的EDC/NHS微乳(微乳A:后续加入的EDC/NHS微乳=5:0.1 (体积比))，搅拌I h后(标记为混合微乳C);同时，
取上述混合微乳B和C各1.8 mL进行混合，并滴加0.3 mL的胱胺微乳(微乳B:微乳C:胱胺微乳=6:6:1)，室温搅拌反应4h(标记为混合微乳D)。
[0041]另取上述1.8mL的微乳B和0.6 mL的微乳进行混合，然后加入0.3 mL的胱胺微乳(微乳B:微乳C:胱胺微乳=6:2:1)，室温搅拌反应4h(标记为混合微乳D ’ )。
[0042]后续加入四氢呋喃、离心、乙醇和去离子水洗涤沉淀等步骤与实施例1相同。
[0043]实验结果:
虽然在微乳进行混合时，各微乳的体积与实施例1和实施例2不同，但由微乳D和微乳D’得到的原生粒子大多数仍然是小于200nm的纳米颗粒。当由微乳D和微乳D’得到的纳米粒子按实施例1相同的方法装载药物DOX后，两种载药粒子在谷胱甘肽的还原刺激下均表现出快速释放DOX的特性。
[0044]实施例4
按实施例2相同的方法配制GQDs、EDC/NHS、BSA和胱胺的微乳，然后按实施例1相同的方法合成纳米粒子，但混合时各微乳的量与实施例1不同，如下。
[0045]取所配制的GQDs微乳(2.4mL)与0.8 mL的EDC/NHS微乳混合，室温搅拌Ih;向该羧基活化的GQDs微乳中加入0.4 mL的胱胺微乳，室温搅拌4 h(标记为混合微乳A)，该混合微乳A中，EDC/NHS微乳:石墨烯微乳:胱胺微乳=1:3:0.5(体积比)。
[0046]将12.5 1111^细0(:/冊5微乳与6.25 mL的BSA微乳混合(BSA微乳:EDC/NHS=1:2(体积比))(标记为混合微乳B)，搅拌30min。向上述混合微乳A中再加入1.44 mL的EDC/NHS微乳(微乳A:后续加入的EDC/NHS微乳=5:2(体积比))，搅拌I h后(标记为混合微乳C);
取上述混合微乳B 15 mL，微乳C 2.5 mL，混合，然后滴加2.5 mL的胱胺微乳(微乳B:微乳C:胱胺微乳=6:1:1)，室温搅拌反应4h(标记为混合微乳D)。
[0047]后续加入四氢呋喃、离心、乙醇和去离子水洗涤沉淀等步骤与实施例1相同。
[0048]实验结果:
为考察所得纳米粒子的还原刺激响应性，将离心得到的沉淀按实施例1相同的方法与药物DOX混合，结果同样对DOX有很强的吸附，吸附DOX的纳米粒子在谷胱甘肽刺激下，迅速释放其中的DOX。
[0049]实施例5
(I)GQDs微乳的配制:将GQDs冷冻干燥粉末分散于去离子水中，GQDs浓度为20 mg/mL,取0.2 mL的GQDs，将其加入到2.5 mL的微乳前液中，室温振荡约3 min；
(2 )EDC/NHS微乳的配制:分别称取EDC和NHS粉末，共同溶于去离子水中，其中，EDC浓度为10 mg/mL，NHS浓度为1 mg/mL，取该EDC/NHS水溶液0.5 mL，加入到6.25mL微乳前液中，室温振荡约3 min；
(3)BSA微乳的配制:称取BSA粉末，将其分散于去离子水中，BSA浓度为30mg/mL，取该BSA溶液0.5 mL，加入到6.25 mL的微乳前液中，室温振荡约3 min；
(4)胱胺微乳的配制:将精确称取的胱胺溶于去离子水中，胱胺浓度为5mg/mL，取该胱胺溶液0.2 11^，加入到2.5 mL的微乳前液中，室温振荡约3 min。
[0050]然后按实施例丨相同的方法合成(BSA-S-S-BSA)-S-S-(GQDs-S-S-GQDs)纳米粒子。[0051 ]实验结果:
离心并经乙醇和去离子水反复洗涤的样品沉淀，颜色为褐色，这主要是样品中含有大量的GQDs，它们与BSA—起在离心后沉淀下来，表明GQDs与BSA之间已紧密结合形成了颗粒，因为单独GQDs粒子和单独BSA分子水溶液均不易在离心后沉淀。按实施例1相同的方法在(BSA-S-S-BSA)-S-S-(GQDs-S-S-GQDs)纳米粒子中装载药物D0X，载药粒子分散于去离子水中，样品放置数小时后，然后离心，样品接近完全沉淀，未见明显的DOX释放;而当该载药粒子与谷胱甘肽混合，2h后进行离心，所得沉淀显著减少，上层液为橘红色，表明载药粒子结构被破坏，释放了其中的D0X，载药粒子因二硫键断裂而破坏后形成了游离的GQDs和BSA，这些游离的粒子和分子均不易沉淀，显示了良好的还原刺激响应释药的性质。
[0052]实施例6
按实施例5相同的方法配制微乳，但所加入的GQDs、BSA、EDC、NHS、胱胺水溶液的浓度分另Ij是0.05mg/mL、0.05mg/mL、0.02mg/mL、0.lmg/mL、0.05mg/mLo
[0053]然后按实施例丨相同的方法合成(BSA-S-S-BSA)-S-S-(GQDs-S-S-GQDs)纳米粒子。
[0054]实验结果:
离心并经乙醇和去离子水反复洗涤所得的样品沉淀比较少，但它们在装载药物DOX后所表现出的谷胱甘肽还原刺激响应释药的现象与实施例5相似。
[0055]实施例7
先采用改进的Hummers方法合成氧化石墨烯(GO)，用稀盐酸洗涤样品，然后用去离子水洗涤，获得的样品在冰浴中经过5 h左右的超声波破碎处理，然后用水合肼于95°C条件下还原，得到的还原性氧化石墨烯(rGO)再进行超声波处理，然后进行透析至中性，获得30-50nm的rGO。
[0056]然后按实施例1相同的方法制备“白蛋白-石墨烯”纳米复合物，S卩(BSA-S-S-BSA) -S-S- (rG0-S-S-rG0)纳米粒子。
[0057]实验结果:
得到了(BSA-S-S-BSA)-S-S-(rGO-S-S-rGO)纳米粒子为黑色沉淀，对药物DOX有强烈吸附。将分散在去离子水中的装载DOX的(BSA-S-S-BSA)-S-S-(rGO-S-S-rGO)纳米粒子置于截留分子量为3000的透析袋中，当透析外液是去离子水时，I h内仅有少量DOX从透析袋中渗出；而当透析外液是含有谷胱甘肽的去离子水时，透析外液迅速从无色变成浅橘红色，表明由牛血清白蛋白和还原性氧化石墨烯通过二硫键交联而成的纳米载药粒子，有明显的还原刺激响应性释药的优势。
【主权项】
1.一种具有还原刺激响应性纳米药物载体，以白蛋白分子作为壳层包覆在石墨烯上，形成纳米复合粒子，其特征在于: 所述的纳米复合粒子中，白蛋白与石墨稀之间、白蛋白与白蛋白之间、石墨稀与石墨稀之间均由二硫键连接。2.如权利要求1所述的具有还原刺激响应性纳米药物载体，其特征在于:所述的白蛋白是指牛血清白蛋白或人血清白蛋白中的一种;所述的石墨烯是指氧化石墨烯、还原性氧化石墨稀或石墨稀量子点中的一种。3.如权利要求2所述的具有还原刺激响应性纳米药物载体，其特征在于:所述的石墨稀量子点是指表面带羧基的石墨烯量子点。4.如权利要求1至3之任一项所述的具有还原刺激响应性纳米药物载体的制备方法，其特征在于:以油包水型微乳为纳米反应器，以所述的白蛋白和石墨烯为原料，以胱胺为连接试剂，在油包水型微乳中进行制备，包括如下步骤: 步骤一，配制如下微乳: (I)表面含羧基的石墨烯的微乳:配制表面含羧基的石墨烯的水溶液，石墨烯浓度为0.05-20 mg/mL，然后将石墨稀水溶液与环己烧、Triton X-100和正己醇混合； (2 )白蛋白的微乳:配制白蛋白的水溶液，白蛋白浓度为0.05-30 mg/mL，然后将白蛋白水溶液与环己烧、Triton X-100和正己醇混合； (3)胱胺微乳:配制胱胺的水溶液，胱胺浓度为0.05-5mg/mL，然后将胱胺水溶液与环己烧、Triton X-100和正己醇混合； (4)EDC微乳，或EDC/NHS微乳:所述的EDC的全称为l-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimide hydrochloride，也就是1_(3_二甲氨基丙基)_3_乙基碳二亚胺盐酸盐，配制EDC浓度在0.0 2-10 mg/mL之间的水溶液；所述的NHS的全称为N-Hydroxysucc inimide，也就是N-轻基琥泊酰亚胺;配制EDC/NHS的水溶液，EDC与NHS的质量比为1: 5?1:1之间，然后将EDC水溶液或EDC/NHS水溶液与环己烷、Triton X-100和正己醇混合； 上述步骤(1)-(4)中，Triton X-100与正己醇的体积比在(1:1)?(2:1)之间，TritonX-100与正己醇的混合溶液与环己烷的体积比在(2: 3)?(1:3)之间，向环己烷、Tr i ton X-100与正己醇三者的混合溶液所加入的水相体积的量保证混合体系不发生浑浊； 步骤二，将步骤一获得的微乳进行如下混合: (I)将EDC微乳或EDC/NHS微乳加入到石墨烯的微乳中，室温振荡15 min-60 min，使石墨烯表面的羧基活化，然后加入胱胺微乳，并于室温振荡0.5 - 5h，使石墨烯之间以二硫键相互连接，此混合微乳标记为微乳A;EDC微乳或EDC/NHS微乳与石墨烯微乳以及与胱胺微乳的体积比在2:1:0.5-1:3:0.5之间； (2 )向BSA微乳中加入EDC微乳或EDC/NHS微乳，BSA微乳与EDC微乳或EDC/NHS微乳的体积比5:0.1-1:2，室温振荡15 min-60 min，此混合微乳标记为微乳B;同时，向微乳A中再加入EDC微乳或EDC/NHS微乳，微乳A与EDC微乳或EDC/NHS微乳的体积比为5:0.1-5:2，室温振荡15 min-60 min此混合微乳标记为微乳C ；将微乳B、微乳C和胱胺微乳混合，微乳B与微乳C以及与胱胺微乳的体积比为6:6:1-6:1:1，于室温振荡0.5 - 5h，使白蛋白与石墨稀之间、白蛋白与白蛋白之间形成二硫键，此混合微乳标记为微乳D; (3)向上述微乳D中滴加甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇、丙酮、四氢呋喃中的一种溶剂或几种的混合溶剂，边滴加边进行超声波振荡处理0.5-2 h，所述溶剂与微乳D的体积比为0.025:1?0.2:1; (4)在上述步骤(3)完成之后，进行离心，沉淀分散于无水乙醇中，超声波处理l-5min后，再离心，如此重复3-5次，所得沉淀再用去离子水洗涤3-5次，得到白蛋白包覆石墨烯的纳米复合粒子。5.如权利要求1至3之任一项所述的具有还原刺激响应性纳米药物载体的应用，其特征在于:用于装载肿瘤化疗药物或光敏剂药物或同时装载肿瘤化疗药物和光敏剂药物，形成载药纳米粒子，作为肿瘤革E向治疗的材料。
【文档编号】A61K47/42GK106075464SQ201610515043
【公开日】2016年11月9日
【申请日】2016年7月4日
【发明人】储茂泉, 谢坤
【申请人】同济大学