一种具有抗耐药菌活性的多功能脂质组合物及其制备方法

一种具有抗耐药菌活性的多功能脂质组合物及其制备方法
【专利摘要】本发明公开了一种具有抗耐药菌活性的多功能脂质组合物及其制备方法。所述的多功能脂质组合物，由载药脂质体和表面修饰的配体组成。所述表面修饰的配体为穿膜肽Tat和麦胚凝集素WGA；所述的载药脂质体由磷脂、胆固醇、聚乙二醇脂质衍生物和药物组成。本发明还提供了一种上述脂质组合物的制备方法。该脂质组合物对耐药菌具有优良的抗菌活性。
【专利说明】
-种具有抗耐药菌活性的多功能脂质组合物及其制备方法
技术领域：
[0001] 本发明属于医药技术领域，设及一种多功能脂质组合物及其制备方法。即通过制 备一种新的包载抗生素或抗菌药物的多功能脂质组合物，W显著提高药物抗耐药菌的活 性。
【背景技术】：
[0002] 抗生素的使用使很多细菌感染性疾病得到了有效的控制，但是，细菌对抗生素的 耐药性问题也随之出现。近年来，耐药细菌越来越多，耐药范围越来越广，程度越来越高，多 重耐药菌不断出现，给抗感染治疗带来了严峻挑战，严重威胁着人类的健康。更有甚者，肠 出血性大肠杆菌巧肥C)导致了 2011年在德国爆发并蔓延至多国的大肠杆菌事件；W耐甲 氧西林金黄色葡萄球菌（Methicillin-resistant Staphylococ州S aureus, MRSA)和耐万 古霉素肠球菌（Vancomycin-resistant linterococ州s，VRE)为代表的超级细菌（产NDM-1 耐药细菌），导致了近年来在英国、法国、美国、比利时、印度、日本、中国等接连不断发生的 超级细菌事件。运使得细菌耐药性问题越发成为一个全球密切关注、迫在眉睫的重大问题， 且成为本世纪的医学研究热点之一。
[0003] 就药物治疗方面而言，早期细菌耐药性产生的问题并不太严重，因为具有不同细 胞祀点的其他多种药物仍可能有效。但医疗技术的进步及抗生素误用滥用等导致的多药耐 药，给现今的临床治疗造成了巨大麻烦。与此同时，近些年作用于新祀点的药物研发速度急 剧下降，过去40余年仅发现Ξ种新作用机制的药物（利奈挫胺、达托霉素和Mutilins)。高 昂的成本和漫长的开发周期极大地限制了全新结构抗菌药物的研发，面对急剧增长的耐药 性问题，有限的药物资源就更显得捉襟见肘。因此，深入研究细菌耐药的作用机制，并有针 对性地寻找各种有效的抗耐药治疗措施，已渐趋成为国际药学领域一个研究热点。相对于 抗耐药化学实体药物的开发而言，给药系统的研究显然是一种更为快速高效的方法。
[0004] 近年的研究结果表明，细菌产生耐药性的机制主要有如下几种：（1)产生灭活酶 或纯化酶W修饰或破坏抗生素的结构；（2)药物作用祀位改变或新祀位的产生；(3)细菌细 胞壁或细胞膜通透性改变造成抗生素的渗透障碍；(4)细菌主动外排累系统的增多增强。 其中，前两种耐药机制具有一定特异性，而膜通透性改变和主动外排机制则是非特异性的。 细菌外膜通透性的改变虽只产生低水平的耐药，但当与其他耐药机制协同并存时，将导致 高度的耐药性。因此，成功克服细菌外膜的通透性障碍，有效提高药物进入细胞的浓度，可 能成为解决细菌耐药性问题的主要突破点之一，也是抗耐药给药系统研究要解决的关键问 题之一。 阳0化]细胞穿透肤（cell-penetrating peptide, CP巧又称穿膜肤，或蛋白质转导域 (protein translocationdomain，PTD)，是一系列能够快速穿透细胞脂质膜的小于30个氨 基酸的短肤片段，其肤链结构中富含碱性氨基酸残基并带有高丰度的正电荷。CPP不仅自身 能够可逆性穿越生物体的细胞膜进入细胞内，而且可W作为载体工具，携带难W穿透细胞 膜的生物大分子（如蛋白质、多肤、DNA、核酸片段等）迅速进入细胞内，其运载能力极强，且 毒性很低，对细胞膜不产生永久性损伤，因此作为一种非常有潜力的药物运输载体，得到了 越来越多的关注，成为近年来国际药学领域的研究热点之一。穿膜肤化Utranscriptional activator protein)为近年来研究较多的一种细胞穿透肤。
[0006] 然而，Tat用于抗菌药物的载体系统也存在一些缺陷：Tat可W穿过生物体各种细 胞的细胞膜，其穿膜作用缺乏细胞选择性，因此所携带转运的活性物质也将分布于全身各 个部位，可能导致其祀部位有效浓度低及对正常组织的毒性作用较大。若能够将一种具有 细菌祀向性的配体与Tat共同连接到给药系统表面，构建一种双配体介导的给药系统，用 于包载抗菌药物，则可W同时具有细菌祀向性和耐药菌细胞膜穿透性，从而有效发挥对耐 药菌的治疗作用。
[0007] 麦胚凝集素 （wheat germ agglutinin,WGA)属植物凝集素中最耐热的一种几下质 结合凝集素，可与N-乙酷氨基葡萄糖（Glc Me)或其聚合物的非还原端进行可逆性、专一 性结合。由于细菌细胞表面也具有Glc Me基团，因此WGA可与其结合，从而识别革兰氏阳 性菌的憐壁酸及革兰氏阴性菌的脂多糖，使细菌发生凝集反应。由于凝集素具有结合细菌 细胞壁上糖基的特点，因此可W考虑将其用于抗菌药物祀向递药系统的构建。
[0008] 经过几十年的发展，脂质体的研究已经取得长足的进步，主动载药脂质体、长循环 脂质体、主动祀向脂质体和递送生物分子的阳离子脂质体相继问世。基于运些成果，脂质体 药物传输系统逐步实现了商业化。脂质体作为药物载体，具有缓释、祀向、提高药物稳定性 等诸多优点。若将Tat和WGA分别连接到普通脂质体的表面，构建一种包载抗生素或抗菌 药物的双配体修饰的脂质体给药系统（本发明中称为多功能脂质组合物），则有望通过WGA 的细菌细胞壁祀向作用，W及Tat的细胞膜穿透特性，使其中所包载的药物能够有效进入 耐药菌的细胞内，发挥优良的抗耐药菌活性。

【发明内容】
：
[0009] 本发明的目的是提供一种新的具有抗耐药菌活性的多功能脂质组合物及其制备 方法。
[0010] 为实现上述目的，本发明的技术方案是：一种新的多功能脂质组合物，其特征在 于：所述多功能脂质组合物由载药脂质体和表面修饰的配体组成。
[0011] W下为上述技术方案的进一步阐述：
[0012] 所述表面修饰的配体为穿膜肤Tat和麦胚凝集素 WGA。所述穿膜肤Tat是氨基酸 序列为YGRKKRRQRRR的直链肤；所述麦胚凝集素 WGA为来源于麦胚的具有糖蛋白结构的外 源性凝集素。
[0013] 所述载药脂质体由憐脂、胆固醇、聚乙二醇脂质衍生物和药物组成。
[0014] 所述憐脂选自所有类型的憐脂，包括但不限于天然来源的大豆憐脂或卵憐脂，W 及合成的憐脂酷胆碱、憐脂酷乙醇胺、憐脂酷丝氨酸、憐脂酷肌醇、憐脂酷甘油及其衍生物； 优选合成的憐脂酷胆碱；
[0015] 所述胆固醇选自胆固醇和DC-胆固醇；
[0016] 所述聚乙二醇脂质衍生物选自聚乙二醇2000 (PEG 2000)，W及各种合成憐脂酷乙 醇胺与聚乙二醇2000形成的偶联物，运些偶联物包括聚乙二醇化二硬脂酷憐脂酷乙醇胺 (DS阳-PEG)、聚乙二醇化二油酷憐脂酷乙醇胺值0阳-PEG)、聚乙二醇化二栋桐酷憐脂酷乙 醇胺（DM阳-PEG)、聚乙二醇化二肉豆違酷憐脂酷乙醇胺值P阳-PEG)。
[0017] 所述药物选自大环内醋类抗生素、头抱菌素类抗生素，W及哇诺酬类抗菌药。所述 的大环内醋类抗生素，选自红霉素、阿奇霉素、克拉霉素、罗红霉素、麦迪霉素、螺旋霉素、乙 酷螺旋霉素、交沙霉素、柱晶白霉素；所述的头抱菌素类抗生素，选自头抱嚷吩、头抱挫嘟、 头抱氨节、头抱拉定、头抱径氨节、头抱克罗、头抱孟多、头抱替安、头抱巧新、头抱美挫、头 抱西下、头抱替坦、头抱嚷目亏、头抱挫目亏、头抱曲松、头抱他定、头抱Ξ嗦、头抱米诺、头抱匹 罗、头抱挫南；所述的哇诺酬类抗菌药选自糞晚酸、化咯酸、化赃酸、西诺沙星、诺氣沙星、依 诺沙星、环丙沙星、氧氣沙星、洛美沙星、培氣沙星、氣罗沙星、妥舒沙星、司帕沙星、莫西沙 星、克林沙星、吉米沙星、西他沙星。
[0018] 本发明所述多功能脂质组合物，其特征在于，所述表面修饰的配体制备方法为：
[0019] (1)将穿膜肤Tat与带有活泼醋基团的脂质衍生物反应，制得Tat修饰的脂质衍生 物；
[0020] (2)将麦胚凝集素 WGA与带有活泼醋基团的脂质衍生物反应，制得WGA修饰的脂质 衍生物。
[0021] 上述（1)和（2)中带有活泼醋基团的脂质衍生物为末端为班巧酷亚胺的聚乙二醇 化二硬脂酷憐脂酷乙醇胺值SPE-PEG-N服）。Tat与DS阳-PEG-N服的摩尔比，W及WGA与 DS阳-PEG-NHS的摩尔比，均为0.7~1.1 : 1.0~1.3,优选0.9~1.0 : 1.0~1.2;再 优选 1. 0 : 1. 2。
[0022] 本发明所述多功能脂质组合物，其特征在于，制备方法为：
[0023] 将药物、憐脂、胆固醇、聚乙二醇脂质衍生物混合，采用薄膜分散法制备普通脂质 体溶液；然后采用后插入的工艺，即向普通脂质体溶液中加入Tat修饰的脂质衍生物和WGA 修饰的脂质衍生物，共解育，制得所述多功能脂质组合物。
[0024] 上述制备方法中，Tat修饰的脂质衍生物、WGA修饰的脂质衍生物、憐脂、胆固醇、 聚乙二醇脂质衍生物的摩尔比为1~15 : 1~15 : 40~80 : 20~50 : 2~20;优 选1~10 : 1~10 : 50~70 : 25~50 : 2~15;再优选2~10 : 2~10 : 55~ 65 : 30 ~50 : 3 ~8。
[00巧]上述的多功能脂质组合物，对于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌W 及大肠杆菌等，具有优良的抗菌活性。
[0026] 有益效果：
[0027] 本发明采用W上技术方案，制备了一种新的多功能脂质组合物，该脂质组合物由 载药脂质体和表面修饰的配体Tat和WGA组成。利用WGA的细菌细胞壁祀向特性，W及Tat 的细菌细胞膜穿透特性，与游离药物或普通脂质体相比，该脂质组合物中所包载的药物能 够更有效地进入耐药菌的细胞内，从而发挥优良的抗耐药菌活性。
[0028] 本发明所制备的多功能脂质组合物，为抗耐药菌治疗提供了一种可能的新途径， 为研究出低毒、高效、通用性强、具有良好应用前景的抗耐药菌给药系统提供了一个良好的 范例，所W具有较高的经济价值和社会推广价值。
[0029] 另外，本发明所述多功能脂质组合物中采用的配体之一穿膜肤化t，虽然已有很多 相关研究报道，但迄今为止的大量研究和应用都集中在穿过真核细胞的细胞膜方面；而细 菌细胞是原核细胞，除细胞核结构方面与真核细胞有极大区别之外，其细胞表面的结构和 组成也不同于真核细胞，且具有独特的细胞壁结构。对于Tat穿过细菌细胞膜的研究极少， 且未见到将Tat修饰到脂质体等给药系统表面，作用于细菌细胞的研究报道。而将WGA与 Tat两种配体联合应用，构建一种多功能给药系统，作用于耐药细菌，国内外更是无任何文 献报道。因此，我们的发明将运二种配体联合应用，构建的运一多功能脂质组合物，是全新 的；其所产生的优良的抗耐药菌效果，也是无法通过已有的研究理论和研究结果来预见的。
【附图说明】：
[0030] 图1为Tat/WGA与DS阳-PEG-N服反应的反应式；
[0031] 图2为载克拉霉素的多功能脂质组合物（实验例）粒径分布图；
[0032] 图3为载克拉霉素的多功能脂质组合物（实验例）杀菌曲线图
[0033] 图4为载香豆素 6的多功能脂质组合物摄取能力（W巧光强度表征）图
【具体实施方式】：
[0034] 实施例1 :载克拉霉素的多功能脂质组合物，所述多功能脂质组合物由载药脂质 体和表面修饰的配体组成。其制备方法如下： 阳0对 （1)取TAT和DS阳-PEG-畑S，加入抑9的憐酸盐缓冲液牌巧中，TAT和 DS阳-PEG-N服摩尔比为1 : 1，室溫下磁力揽拌反应48小时，透析，冻干，得到Tat修饰的 脂质衍生物DS阳-PEG-Tat (反应式见图1);
[0036] (2)取WGA和DSPE-阳G-N服，加入抑9的PBS中，WGA和DSPE-阳G-N服摩尔比为 1 : 1，室溫下磁力揽拌反应4她，透析，冻干，得到WGA修饰的脂质衍生物DS阳-PEG-WGA (反 应式见图1);
[0037] (3)分别称取克拉霉素3. 6mg、大豆憐脂45mg、胆固醇18mg，DS阳-PEG9. 9mg，置于 圆底烧瓶中，加适量氯仿使其全部溶解，减压条件下旋转蒸发Ih，除去有机溶剂。5(TC条件 下，向其中加入4ml pH7. 4的PBS，超声3分钟使水化，随后于冰浴中探头超声10分钟，W 0. 22 μ m微孔滤膜过滤，即得普通脂质体溶液。
[0038] 取上述制得的DS阳-PEG-Tat 20mg和DS阳-PEG-WGA 40mg，溶于抑7. 4的PBS中， 与上述制得的普通脂质体溶液于37°C共解育比，即得多功能脂质组合物。
[0039] 实验例：
[0040] 对实施例1所制得的载克拉霉素的多功能脂质组合物进行评价和研究，必要时W 克拉霉素原料及上述制得的普通脂质体溶液作为对照。具体方法如下：
[0041] 1、采用动态光散射法测定载克拉霉素的多功能脂质组合物粒径和电位；
[0042] 2、采用HPLC法测定所制得载克拉霉素的多功能脂质组合物中的药物含量；采用 微孔滤膜过滤的方法除去游离的药物，用Triton X 100破膜，采用HPLC法测定药物浓度， 计算出被包封的药物量。计算包封率和载药量。
[0043] 3、选择非耐药的金黄色葡萄球菌（Staphylococ州S aureus ATCC 29213)和耐甲 氧西林的金黄色葡萄球菌（methicillin resistant S. aureus),采用管碟法测定载克拉霉 素的多功能脂质组合物最低抑菌浓度（MIC)和杀菌曲线，并与克拉霉素原料（游离药物） 及普通脂质体进行比较。
[0044] 4、选择上述3中所述两种细菌进行培养，所得细菌悬液用PBS洗涂3次，取适量细 菌悬液，与包载巧光标记物香豆素6的多功能脂质组合物（该脂质组合物采用实施例1所 述方法制备，与实施例1的唯一不同仅在于将药物克拉霉素替换为香豆素6)在37Γ下共 解育，350化/min离屯、15min，弃去上清液，W PBS洗涂两次，再加适量PBS重新混悬，过细胞 筛。W流式细胞仪测定巧光强度，其数值高低反应细菌对多功能脂质组合物的摄取能力高 低。
[0045] 结果如下：
[0046] 1、载克拉霉素的多功能脂质组合物平均粒径为87. 47 + 1. 64皿，多分散指数 0. 208 + 0. 012 (见图2)，电位8. 99 + 2. 22mV。表明该脂质组合物粒径均一，具有较好的稳定 性；粒子带一定量正电荷，因此具有一定的电性稳定性；由于细菌表面一般荷负电，因此该 脂质组合物与细菌表面可能具有较强的相互作用。
[0047] 2、经计算，该多功能脂质组合物中药物克拉霉素的包封率为（83. 02 + 3. 19) % ;载 药量为（1. 30 + 0. 05) %。
[0048] 3、抗菌实验结果见表1。
[0049] 表1载克拉霉素的多功能脂质组合物最低抑菌浓度结果 阳化0]
[0051] 上述试验结果表明，载克拉霉素的多功能脂质组合物与克拉霉素原料对非耐药的 金黄色葡萄球菌敏感性基本一致；但耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌（MRSA)对克拉霉素原 料表现出明显的耐药性，而载克拉霉素的多功能脂质组合物对MRSA却具有较好的抑菌效 果。
[0052] 杀菌曲线结果（见图3)与上述MIC结果相近，即克拉霉素、普通脂质体和实验例 均显示了优良的杀金黄色葡萄球菌能力；但对于MRSA，只有实验例的载克拉霉素多功能脂 质组合物体现了良好的杀菌能力。
[0053] 4、摄取试验结果（见图4)表明，MRSA对Tat和WGA修饰的多功能脂质组合物的 摄取显著高于其对普通脂质体的摄取。表明耐药菌对其摄取能力的提高可能是多功能脂质 组合物相比于普通脂质体具有更好抗菌效果的原因。
[0054] W上列举的仅是本发明的一个具体实施例和实验例，从本发明公开的内容推导出 的所有变形，均属于本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种多功能脂质组合物，由载药脂质体和表面修饰的配体组成，其特征在于，所 述表面修饰的配体为穿膜肽Tat和麦胚凝集素 WGA ;所述穿膜肽Tat是氨基酸序列为 YGRKKRRQRRR的直链肽；所述麦胚凝集素 WGA为来源于麦胚的具有糖蛋白结构的外源性凝 集素。2. 如权利要求1所述的多功能脂质组合物，其特征在于，所述的载药脂质体由磷脂、胆 固醇、聚乙二醇脂质衍生物和药物组成。3. 如权利要求2所述的载药脂质体，其特征在于，所述的磷脂选自所有类型的磷脂，包 括但不限于天然来源的大豆磷脂或卵磷脂，以及合成的磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰 丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油及其衍生物；优选合成的磷脂酰胆碱； 所述的胆固醇选自胆固醇和DC-胆固醇； 所述的聚乙二醇脂质衍生物选自聚乙二醇2000(PEG 2000)，以及各种合成磷脂酰乙 醇胺与聚乙二醇2000形成的偶联物，这些偶联物包括聚乙二醇化二硬脂酰磷脂酰乙醇胺 (DSPE-PEG)、聚乙二醇化二油酰磷脂酰乙醇胺（DOPE-PEG)、聚乙二醇化二棕榈酰磷脂酰乙 醇胺（DMPE-PEG)、聚乙二醇化二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺（DPPE-PEG)。4. 如权利要求2所述的载药脂质体，其特征在于，所述的药物选自大环内酯类抗生素、 头孢菌素类抗生素，以及喹诺酮类抗菌药。所述的大环内酯类抗生素，选自红霉素、阿奇霉 素、克拉霉素、罗红霉素、麦迪霉素、螺旋霉素、乙酰螺旋霉素、交沙霉素、柱晶白霉素；所述 的头孢菌素类抗生素，选自头孢噻吩、头孢唑啉、头孢氨苄、头孢拉定、头孢羟氨苄、头孢克 罗、头孢孟多、头孢替安、头孢呋新、头孢美唑、头孢西丁、头孢替坦、头孢噻肟、头孢唑肟、头 孢曲松、头孢他定、头孢三嗪、头孢米诺、头孢匹罗、头孢唑南；所述的喹诺酮类抗菌药选自 萘啶酸、吡咯酸、吡哌酸、西诺沙星、诺氟沙星、依诺沙星、环丙沙星、氧氟沙星、洛美沙星、培 氟沙星、氟罗沙星、妥舒沙星、司帕沙星、莫西沙星、克林沙星、吉米沙星、西他沙星。5. 如权利要求1所述的多功能脂质组合物，其特征在于，所述表面修饰的配体制备方 法为： (1) 将穿膜肽Tat与带有活泼酯基团的脂质衍生物反应，制得Tat修饰的脂质衍生物； (2) 将麦胚凝集素 WGA与带有活泼酯基团的脂质衍生物反应，制得WGA修饰的脂质衍生 物。6. 如权利要求5所述的表面修饰的配体制备方法，其特征在于，所述Tat与带有活泼 酯基团的脂质衍生物的摩尔比，以及WGA与带有活泼酯基团的脂质衍生物的摩尔比，均为 0· 7 ~LI : LO ~L 3;优选 0.9 ~LO : LO ~L 2;再优选 LO : 1.2。7. 如权利要求1所述的多功能脂质组合物，其特征在于，制备方法为：将药物、磷脂、胆 固醇、聚乙二醇脂质衍生物混合，采用薄膜分散法制备普通脂质体溶液；然后采用后插入的 工艺，即向上述普通脂质体溶液中加入Tat修饰的脂质衍生物和WGA修饰的脂质衍生物，共 孵育，制得所述多功能脂质组合物。8. 如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述Tat修饰的脂质衍生物、WGA修饰 的脂质衍生物、磷脂、胆固醇、聚乙二醇脂质衍生物的摩尔比为1~15 : 1~15 : 40~ 80 : 20~50 : 2~20 ;优选1~10 : 1~10 : 50~70 : 25~50 : 2~15 ;再优选 2 ~10 : 2 ~10 : 55 ~65 : 30 ~50 : 3 ~8。9. 如权利要求1所述的多功能脂质组合物，对于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、金黄色 葡萄球菌以及大肠杆菌，具有优良的抗菌活性。
【文档编号】A61P31/04GK105879039SQ201410802492
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年12月23日
【发明人】李桂玲, 侯续成, 丁维明, 李馨儒, 孟艳莎
【申请人】中国医学科学院医药生物技术研究所