Fam96a基因及其编码蛋白的新应用

Fam96a基因及其编码蛋白的新应用
【专利摘要】本发明涉及人类基因FAM96A及其编码蛋白的新应用。FAM96A及其编码蛋白作为生物药治疗炎症(急性和慢性)和自身免疫性疾病的作用。本发明还涉及FAM96A及其编码蛋白可以通过调控TH17细胞的相关细胞因子IL-23/IL-22/IL-17的通路治疗炎症、自身免疫病以及进行免疫调节的作用。本发明还涉及用于治疗炎症和自身免疫病的药物组合物。
【专利说明】
FAM96A基因及其编码蛋白的新应用
技术领域
[0001] 本发明设及FAM96A的新应用，具体地说，本发明设及FAM96A蛋白或编码其的多核 巧酸制备用于治疗急、慢性炎症、自身免疫病及免疫调节的应用。
【背景技术】
[0002] 炎症是机体对应激，组织损伤，感染等的反应，炎症反应是一个复杂的过程，对炎 症的调控也是一个复杂的过程，各种细胞和分子参与其中，构成了炎症调控的复杂网络。巨 隧细胞和树突状细胞在炎症反应中发挥着核屯、作用，是炎症反应的主要介导者。巨隧细 胞和树突状细胞通过其表面的模式识别受体识别多种抗原分子，如Toll样受体（TLRs)， RIG-I样受体巧LRs)，N孤样受体WLRs)等；不同的受体识别不同的分子，包括病原相关模 式分子和损伤相关模式分子，模式分子结合到模式识别受体后活化固有免疫细胞，释放各 种炎性细胞因子和趋化因子，如IL-6、TNF-a、MCP-1等，触发一系列炎症反应。除此之外， 巨隧细胞和树突状细胞还直接向T细胞提呈抗原成分，同时分泌一系列细胞因子调节T细 胞，启动适应性免疫。固有免疫细胞通过分泌一系列细胞因子对适应性免疫和炎症反应类 型起着核屯、的调控作用，如由固有免疫细胞分泌的IL-1 β，IL-6和IL-23可W促进化17细 胞的分化，促进其分泌IL-17和IL-22,介导化17相关的炎症反应，抵抗外来入侵和诱导病 理性炎症反应。而由活化的树突状细胞感受抗原刺激后分泌的IL-12可W促进Thl细胞的 分化，DC 的 TLR3，TLR4、TLR7、TLR8、TLR9 和 TLR11 被激活后，在 I 型干扰素和 IFN-丫，CD40L 的共同刺激下能够分泌大量的IL-12,介导化1型炎症反应，化细胞分泌大量的IFN-丫，反 过来又促进IL-12的分泌，由此形成一个正反馈环路，进一步促进T细胞向化1型分化。由 此可见，固有免疫细胞中不同的通路和分子调控着不同的固有免疫反应类型，它们之间存 在着精细的平衡和复杂的调控。固有免疫细胞在炎症反应过程中起着重要的纽带作用，它 连接着致炎因子（如感染、损伤等）和适应性免疫，同时又可W通过直接的抗原提呈和间接 的通过其分泌细胞因子调控着T细胞和炎症反应的类型。因此固有免疫细胞是炎症调控和 治疗的重要祀点，研究其对炎症的作用具有重要意义。
[0003] 人类基因组计划确定了人类基因组的全部序列，然而许多基因的功能仍然一无 所知。根据人类转录组数据库H-Invitational化t油ase(H-InvDB)的最新释放的数据 库统计信息，在目前已注释的36, 789个人类编码基因中，有功能报道的只有16, 139个 化ttp:http://h-invit曰tion曰 1. jp/hinv/曰hg-db/st曰tistics. jsp)。因此，大量人类亲jf基 因的功能及开发有待发掘，其中必然包括众多免疫相关基因。本实验室一直致力于通过 免疫组学和反向生物学技术发现新的免疫相关基因，免疫组学研究免疫相关的全套分子、 它们的作用祀分子及其功能，主要包括免疫基因组学（Immunogenomics)、免疫蛋白质组学 (Immunoproteomics)和免疫信息学（Immunoinformatics) Ξ方面的研究。免疫组学强调在 基因组学和蛋白质组学研究的基础上，充分利用生物信息学、生物忍片、系统生物学、结构 生物学、高通量筛选等技术，开展大规模免疫系统和免疫应答分子机理研究，发现新的免疫 相关分子，为全面系统了解免疫系统和免疫应答奠定基础。基础免疫学、临床免疫学（肿瘤 和感染免疫学）和疫苗设计运些免疫学领域都充分体现了免疫组学战略的成功应用。反向 生物学方法即：从核酸到蛋白质途径，主要包括：细胞因子产生细胞的cDNA的大规模测序 和生物信息学分析；染色体中细胞因子聚集区的大规模测序；差异显示技术；生物信息学 技术等。
[0004] 本研究基于整个人类基因组数据库，利用生物信息学分析高通量筛选潜在细胞因 子，得到动态的细胞因子候选库；构建真核细胞表达质粒并验证分泌；对于存在分泌形式 的蛋白进行广泛表达谱分析；在此基础上，对潜在新细胞因子进行分泌蛋白的表达优化、纯 化、鉴定、N端测序及分泌途径的分析；对N端明确的分泌蛋白构建原核细胞表达载体，并进 行原核蛋白的诱导表达、纯化和鉴定；利用纯化的重组蛋白进行系列体内、外功能研究；功 能明确者，将制备、纯化单克隆抗体和多克隆抗体，研究其受体和信号转导通路；对于功能 重要者，将构建转基因小鼠和基因敲除小鼠，并进行表型鉴定和功能研究。
[0005] 通过高通量筛选技术成功的筛选出了 FAM96A运一功能未知的基因，本实验室前 期的研究发现该基因可W调控上皮细胞间质转分化过程（EMT)，当内源性敲减FAM96A后可 W强烈的诱导上皮细胞向间质细胞分化，表现为一系列上皮细胞特征的消失和间质细胞特 征的出现W及一些相关转录因子的变化。我们在刚开始进行此研究时还没有该基因功能文 章发表，后来有文章报道该基因编码的蛋白产物在体外能够形成二聚体，与FAM96B和CIA0 有相互作用参与铁硫中屯、的成熟，参与细胞生物化学过程。
[0006] 炎症性肠病包括克罗恩病（化ohn' S disease, CD)和溃瘍性结肠炎（ulcerative colitis, UC)，其发病机制尚未完全阐明，多种因素参与其发病过程。固有免疫细胞，如巨隧 细胞和树突状细胞，在IBD发病过程中发挥重要作用。巨隧细胞分泌多种炎症性细胞因子 和趋化因子，如TNF-a、比-6、IL-1 β、MIP等，介导一系列炎症反应。DSS (葡聚糖硫酸钢） 是由薦糖合成的一种硫酸多糖，具有抗止血和抗凝血作用。在小鼠饮水中加入3% (w/v)的 DSS能够诱导小鼠明显的结肠炎症状，主要表现为血性腹泻、结肠溃瘍W及大量炎性浸润。 目前认为DSS诱导的结肠炎主要由固有免疫细胞介导，因为在RAG1-/-小鼠中也能诱导出 类似的结肠炎改变，因为其临床症状与人类炎症性肠病极为相似，目前被广泛运用于人类 炎症性肠病的研究。体外实验证实内源性FAM96A在炎性刺激过程中下调，且Fam96a-/-巨 隧细胞中11-6, 11-1 β和11-23产生降低，而且大量的文献均证实IL-23参与肠炎过程。 因此我们推测FAM96A可能在DSS诱导的小鼠结肠炎中发挥作用。

【发明内容】

[0007] 本发明的一个目的是提供FAM96A蛋白或其编码的多核巧酸在治疗炎症（包括急、 慢性炎症）、自身免疫病及免疫调节中的应用。
[0008] 在一个方面中，本发明提供了 FAM96A蛋白或编码其的多核巧酸在制备炎症（包括 急性炎症和慢性炎症）损伤之药剂中的用途。
[0009] 在另一个方面中，本发明提供了 FAM96A蛋白或编码其的多核巧酸在制备用于自 身免疫病中的应用。
[0010] 在另一个方面中，本发明提供了 FAM96A蛋白或编码其的多核巧酸在制备用于免 疫调节疗法中的应用。
[0011] 本发明还设及一种用于治疗炎症及治疗自身免疫病的药物组合物，其包含治疗有 效量的选自抗生素类或者其任意组合药W及增敏有效量的FAM96A蛋白。
[001引在一个实施方案中，所述FAM96A蛋白选自下组：（1)具有SEQ ID N0:2所示氨基 酸序列的多肤；或（2)包含与SEQ ID N0:2所述氨基酸序列有至少70%、75%、80%、85%、 90%、95%或97%同源性的氨基酸序列的多肤，其具有与（1)所述多肤基本相同的生物学 功能或活性；或（1)或（2)所述多肤的功能性片段、变体、类似物或衍生物，它们具有与（1) 或（2)所述多肤基本相同的生物学功能或活性。
[0013] 在另一个实施方案中，所述多核巧酸包括：（a)编码SEQ ID No :1所示氨基酸序列 的核巧酸序列；化）在严格条件下与（a)所述的核巧酸序列杂交的核巧酸序列；或（C)与 (a)所示核巧酸序列具有至少70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、95 %或97 % -致性的核巧酸序 列。
[0014] 在本发明中，所述蛋白的生物学功能或活性例如但不限于，如本文所述的，治疗 急、慢性炎症和治疗自身免疫病。
【附图说明】
[001引附图1、FAM96A在免疫系统中广泛表达
[0016] 研究显示，FAM96A在全身各组织中广泛表达，为了探明FAM96A在免疫系统中的表 达情况，我们采用Clontech公司的免疫组织cDNA为模板，用real-time PCR对FAM96A的转 录本进行扩增，结果表明FAM96A广泛表达在免疫系统各个组织中，其中胎肝表达量最高， 骨髓，胸腺，白细胞，淋己结和脾都有比较均一的相对低水平的表达，W上数据说明FAM96A 可能在胚胎造血过程中发挥着重要作用。
[0017] 附图2、FAM96A内源性表达水平在LPS和炎性细胞因子刺激后降低
[0018] 为探讨FAM96A在炎性环境中的表达，在THP1细胞中加入10化g/ml的LPS，分别 刺激化、1化、24h后收集细胞进行mRNA检测，定量PCR结果显示FAM96A的转录被明显的抑 制；纯化的小鼠腹腔巨隧细胞，分别加入LPS、polyI :C刺激化后发现Fam96a的转录也被抑 审IJ。在人外周血单个核细胞加入PMA分别刺激化、1化后发现FAM96A的表达量明显降低， 在人肺癌上皮A549细胞中加入IL-10后也得出类似的结论。W上数据说明，在抗原和炎 性细胞因子刺激下FAM96A表达明显下调，提示FAM96A在炎症反应尤其是固有免疫免疫介 导的炎症反应过程中可能发挥重要的作用。
[0019] 附图3、FAM96A存在分泌形式
[0020] 生物信息学分析发现FAM96A存在N端信号肤，预测其切割位点位于第26和27个 氨基酸之间，由此推断FAM96A可能存在分泌形式。实验结果首次证实FAM96A蛋白在细胞 培养上清中存在，同时检测了 β -actin，结果显示其不存在于上清中，由此排除细胞死亡导 致的细胞内容物释放到培养上清中的可能。
[0021] 附图4、重组人FAM96A蛋白诱导、表达及纯化
[002引为了研究FAM96A的功能，大量的高纯度的FAM96A重组蛋白是必不可少的T具，我 们构建了去掉信号肤序列的FAM96A原核表达载体，诱导、表达、纯化了人重组FAM96A蛋白， 纯化后通过DEAE柱去除内毒素，最后得到了高纯度的重组FAM96A蛋白。
[002引 附图5、Fam96a基因敲除鼠结肠炎症状明显加重
[0024] 前述实验提示FAM96A可能参与肠炎的发生过程。为了探究FAM96A在肠炎发病过 程中的具体作用，我们选取性别和周龄一致的Fam96a基因敲除小鼠和WT对照鼠，分别在它 们的饮水中加入3 %的DSS，每天监测小鼠的体重，腹泻，便血情况。DSS处理小鼠9天后， Fam96a基因敲除小鼠平均体重下降了 30%左右，而WT对照小鼠体重只下降了 10%左右。疾 病活动指数（DAI)是肠炎活动的综合反应，其指标囊括了体重减低情况，腹泻和血便情况， 评分越高则反应出疾病越严重。评估显示Fam96a基因敲除小鼠疾病活动指数（DAI)更高； 结肠长度是反应肠炎严重程度的另一个重要的宏观指标，肠炎发生时，小鼠结肠水肿缩短， 肠炎症状越严重，结肠越短。3% DSS处理9天后处死小鼠，分离小鼠结肠组织，测量结肠长 度后发现，Fam96a基因敲除小鼠结肠长度明显较WT对照鼠短。将小鼠结肠组织固定包埋 后切片肥染色，镜下观察小鼠结肠组织学改变情况。与WT小鼠相比，Fam96a基因敲除小 鼠总体组织学评分明显升高，结肠炎性细胞浸润程度，结肠组织损坏程度也明显高于WT对 照鼠，差异具有统计学意义。W上数据说明FAM96A对DSS肠炎具有保护作用。
[002引 附图6、FAM96A转基因小鼠对DSS诱导的肠炎抵抗
[0026] 为了进一步证实FAM96A对DSS诱导的小鼠结肠炎的作用，在FAM96A转基因小鼠 中又做了类似的实验；选取性别和周龄匹配的FAM96A转基因小鼠和野生对照鼠，在其饮 水中加入3% DSS，6天后处死小鼠。实验结果显示，WT体重下降比FAM96A转基因鼠明显严 重，疾病活动指数也明显升高；结肠长度的测量发现，FAM96A转基因鼠结肠长度明显较WT 小鼠结肠长，检测小鼠结肠组织中炎性细胞因子的含量，ELISA和qPCR结果均显示，FAM96A 转基因小鼠结肠组织中IL-1 β，IL-6 W及TNF-a的含量均明显低于WT小鼠，W上结果进 一步证实FAM96A对DSS诱导的肠炎具有明显的保护作用。
[0027] 附图7、人重组FAM96A原核蛋白对DSS诱导的小鼠结肠炎具有保护作用
[002引通过序列对比发现FAM96A人鼠同源性具有高度的同源性（高达87% )。给小鼠 注射人重组FAM96A蛋白观察其对DSS诱导的小鼠结肠炎的作用，为避免微量内毒素残留对 实验的影响，采用煮沸加热的FAM96A蛋白作为对照，运种方法能够灭活掉FAM96A蛋白的活 性，但是不能去除里面残留的内毒素活性。8周龄，性别，体重均匹配的小鼠，在其饮用水中 加入3 %的DSS诱导小鼠肠炎，同时每组每天分别注射人重组FAM96A原核蛋白50ug/25g体 重，100yg/25g体重和等量加热灭活的FAM96A蛋白。每天记录小鼠的体重。DSS处理8天 后，对照组小鼠体重降低了 10% W上，而注射FAM96A蛋白组小鼠体重至多下降了 5%左右， 100 μ g组保护作用比50 μ g组保护作用更明显。FAM96A重组蛋白注射组小鼠的结肠长度 明显比对照组小鼠长，W上实验数据证明重组人FAM96A蛋白在体内同样具有抗炎活性。
[0029] 附图8、Fam96a-/-小鼠腹腔巨隧细胞刺激后与化17分化相关细胞因子产生减少
[0030] 为探讨Fam96a在炎症反应过程中的作用，分别分离Fam96a+/+和Fam96a-/-小鼠 腹腔巨隧细胞，在体外加入l(K)ng/ml LI^刺激6小时后收集细胞，提取RNA，用qPCR检测巨 隧细胞中细胞因子和趋化因子的表达情况。通过筛查发现Fam96a-/-巨隧细胞中11-10， 11-6,11-23表达量明显下调，其中11-6和11-23尤为明显；而与化1细胞分化密切相关的 细胞因子11-12没有明显变化，同时还发现趋化中性粒细胞的趋化因子Cxcll也有明显下 调，但Ccl20, Mcp-1没有明显变化，与巨隧细胞极化相关的分子iNOS和Argl也没有明显变 化。
[003。 附图9、Fam96a基因敲除小鼠结肠组织中比-22的表达量降低
[0032] 比-22主要由ILC细胞和T细胞分泌，它作用于肠上皮细胞，诱导肠上皮损伤 修复，促进上皮杯状细胞细胞分泌粘液和抗菌肤类物质进而保护肠上皮。在DSS诱导 的肠炎模型中比-22表达上调，介导肠上皮的保护作用，抑制肠道炎症反应。检测了 Fam96a-/-和Fam96a+/+小鼠结肠组织中IL-22的表达情况，在用3 % DSS水喂养小鼠8天 后，Fam96a-/-结肠组织中比-22表达量明显降低，Regllie和Reglll 丫是由肠道上皮分 泌的一种C型凝集素，它能够阻止病原体与肠上皮结合，保护肠上皮，是IL-22发挥作用的 效应分子，运用qPCR检测发现，在Fam96a-/-小鼠结肠组织中，RegHI β和RegllI 丫的表 达量明显降低。值得注意的是，我们还发现Fam96a-/-小鼠结肠组织中11-17的表达也有 所下降，有文献报道，IL-17A敲除的小鼠对DSS诱导的小鼠结肠炎敏感性增加，我们的实 验结果与文献报道是一致的。结果显示Fam96a可能通过影响IL-22的表达对DSS诱导的 肠炎起保护作用。
[0033] 附图10、Fam96a通过比-23调控比-22的分泌
[0034] 体外实验发现Fam96a-/-小鼠腹腔巨隧细胞11-23、11-6产生减少，比-23可W调 控IL-22的表达，11-23敲除小鼠11-22产生减少，对巧樣酸杆菌易感；此外，在抗CD3和 CD28抗体的刺激下，11-6可W直接促进naive T分泌11-22。首先用化ISA检测了小鼠结肠 组织中11-23的表达情况，结果显示，Fam96a-/-小鼠结肠组织中11-23的表达量明显下调， FAM96A转基因小鼠结肠组织中11-23的表达量明显高于WT对照鼠，W上数据提示Fam96a 对11-23具有重要的调控作用，Fam96a可能是通过11-23调控11-22。比-23通过比-23R 活化STAT3调控一系列祀基因的转录，包括112化和Rorc。R0R 丫 t是化-17细胞分化的关 键转录因子，在正常小鼠，它表达于未成熟的胸腺细胞和肠固有层淋己细胞，R0R 丫 t直接结 合在IL-22的上游启动子区域调控IL-22的转录。用qPCR检测了小鼠结肠组织中Ι123Γ 和Rorc的表达情况，Fam96a-/-小鼠结肠组织中112化和Rorc表达下调。因此，DSS诱导 的肠炎过程中Fam96a通过影响11-23来调节11-22和11-17分泌。
[003引附图11、FAM96A基因敲除鼠的构建
[0036] 小鼠 Fam96a基因具有5个外显子，通过在2号和3号外显子两侧插入Loxp标签 构建打祀载体，电穿孔转染胚胎干细胞，筛选出阳性克隆，囊胚注射后得到带有Loxp标签 的Fam96a-floxed小鼠。Loxp序列位于Fam96a基因第二和第Ξ外显子两侧，中间插入肥0 新霉素筛选基因。 具体实施例
[0037] 在本发明中，FAM96A包括FAM96A基因或FAM96A蛋白。所述FAM96A蛋白为如沈Q ID NO : 2所示的氨基酸序列，其编码160个氨基酸。所述FAM96A基因为编码本发明的SEQ ID NO :2的多核巧酸序列，其可W为SEQ ID NO :2所示氨基酸的编码序列，或者除了上述氨 基酸序列的编码序列之外，还可W包括非编码序列，例如内含子、编码序列5'或3'端的非 编码序列等。所述多核巧酸序列可W是DNA或RNA，其中DNA包括cDNA、基因组DNA W及合 成的DNA。其中优选的基因为SEQ ID NO :1所示的多核巧酸序列，该序列全长1108个核巧 酸，编码序列为第1-1108位核巧酸（CDS :第1-1108位核巧酸）。或者，更优选一种分离的 核巧酸序列，其只包含编码FAM96A蛋白序列，例如SEQ ID NO :1所示的编码序列：核巧酸 1-1108。本领域普通技术人员已知，本发明的FAM96A的核巧酸序列可W完全相同于如SEQ ID NO :1所示的编码序列，也可W由于遗传密码的简并性，不完全等同于上述核巧酸的编码 序列。
[003引本发明的FAM96A多核巧酸序列可W依据标准的PCR扩增技术将cDNA，mRNA或者 基因组DM作为模板，并选取合适的寡核巧酸引物扩增得到。运样得到的核巧酸可W克隆 进合适的载体中，并用DNA分析技术进行序列描述。也可W通过标准DNA合成技术得到。 本发明的FAM96A蛋白可W通过常规方法获得，例如通过转化宿主细胞并在被转染的宿主 细胞生长到适当的细胞密度后，用适当的方法（如溫度变动或化学特质诱导）诱导启动子， 然后继续培养。培养完成后，可用离屯、法收集细胞，并用任何已知的方法，如冻融法、超声 处理法、溶菌酶溶解法或机械破碎法破碎细胞。可W用各种已知的方法从宿主细胞培养物 中回收和纯化本发明的FAM96A蛋白，运些方法包括硫酸锭或乙醇沉淀法、酸萃取法、超滤 法、离子交换层析法、憐酸纤维层析法、疏水相互作用层析法、凝胶过滤法、亲和层析法及高 压液柱层析法。也可W通过原核表达载体转化到大肠杆菌中，通过适当的方法（如溫度变 动或化学特质诱导）诱导启动子，然后继续培养。培养完成后，可用离屯、法收集细胞，并用 任何已知的方法，如冻融法、超声处理法、溶菌酶溶解法或机械破碎法破碎细胞。可W用各 种已知的方法从宿主细胞培养物中回收和纯化本发明的FAM96A蛋白，运些方法包括硫酸 锭或乙醇沉淀法、酸萃取法、超滤法、离子交换层析法、憐酸纤维层析法、疏水相互作用层析 法、凝胶过滤法、亲和层析法及高压液柱层析法。
[0039] 本发明的FAM96A还可W通过慢病毒，腺病毒等载体感染哺乳动物细胞，在细胞内 和体内发挥作用。
[0040] 本发明的FAM96A蛋白还可W通过化学的方法合成得到。
[0041] 在本发明的一个实施方式中，FAM96A可W抑制比-22和IL-17信号通路，因此可 W抑制炎症性疾病和自身免疫性疾病。
[0042] 根据本发明的另一方面，本发明还提供一种治疗炎症的药物组合物。该药物组合 物包含FAM96A的重组蛋白。还可W包含一种或多种药学可接受的载体或赋形剂。所述载 体或赋形剂可W包括生理盐水、等渗葡萄糖溶液、缓冲盐水、甘油、乙醇及上述溶液的组合。 所述药物组合物还可W进一步包含渗透促进剂、抗氧化剂和/或蛋白酶抑制剂等。
[0043] 为治疗目的，所述药物组合物可W采用适当的给药途径来施用。可W将所述药物 组合物制成各种剂型，例如溶液剂、脂质体制剂、聚合物制剂、微胶囊剂及其他缓释制剂等。
[0044] 本发明的药物组合物可W全身给药，例如通过静脉注射；或者局部给药，例如对患 癌部位局部注射。最适的剂量要根据患者的病情、年龄、性别或体重，给药方式和所需功效 而定，本领域的技术人员可在其知识范围内无需创造性劳动就可确定最佳的施用方式。
[0045] W下将参考实施例来对本发明进行进一步的阐述。
[0046] 本发明的一个方面提供了 FAM96A蛋白或编码其的多核巧酸在制备炎症治疗药物 的用途。在一些实施方案中，所述FAM96A蛋白或编码其的多核巧酸通过抑制IL-22和IL-17 信号通路抑制炎症和自身免疫病。
[0047] 本发明的一个方面提供了使用FAM96A蛋白或编码其的多核巧酸治疗炎症和自身 免疫病的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的FAM96A蛋白或编码其的多核巧 酸。在又一些实施方案中，所述多核巧酸可W是多种形式，包括但不限于克隆载体、表达载 体、腺病毒、慢病毒、质粒、隧粒、粘粒、裸DNA等形式。在另一些实施方案中，所述FAM96A蛋 白或编码其的多核巧酸通过抑制炎症细胞因子的分泌实现抑制炎症和自身免疫病。在又一 些实施方案中，治疗炎症和自身免疫病通过w上两种方式实现。优选地，所述方法在体内或 离体实施。
[0048] 本发明的又一个方面提供了一种用于治疗炎症和自身免疫病的药物组合物，其包 含治疗有效量的FAM96A蛋白和化疗药物。
[0049] 在本发明的一些实施方案中，所述FAM96A蛋白选自下组：（1)具有SEQ ID N0:2 所示氨基酸序列的多肤；或（2)包含与SEQ ID NO :2所述氨基酸序列有至少70%同源性的 氨基酸序列的多肤，其具有与（1)所述多肤基本相同的生物学功能或活性；或（1)和（2)所 述多肤的功能性片段、变体，类似物和衍生物，它们具有与（1)或（2)所述多肤基本相同的 生物学功能或活性；其中所述多核巧酸包括：(a)编码上述（1)、（2)或（3)所述的FAM96A 蛋白的多核巧酸；化）在严格条件下与（a)所述的多核巧酸杂交并与其有至少70%-致性 的多核巧酸；和（C)包含（a)或化）所述多核巧酸的多核巧酸片段。
[0050] 优选地，在本发明的一些实施方案中，所述FAM96A蛋白包含与SEQ ID N0:2所述 氨基酸序列有至少75 %，优选地至少80 %，更优选地至少85 %，还更优选地至少90 %，甚至 更优选地至少95 %，最优选地至少97 %同源性的氨基酸序列。
[0051] 优选地，在本发明的一些实施方案中，编码所述FAM96A蛋白的多核巧酸具有与 沈Q IDN0 :1所示核酸序列至少70%，优选至少75%，更优选至少80%，至少85%，至少 90%，至少95%，甚至至少97%-致性的序列，最优选其中所述多核巧酸具有SEQ ID NO :1 所示核酸序列。
[0052] 本发明人经过研究显示人FAM96A蛋白是一分泌蛋白，具有细胞因子的特点，通过 与细胞的相关受体结合转导抑制炎症的信号而发挥作用。。
[0053] 如本文中所使用的，术语"受试者"是指哺乳动物，如人类，但也可W是其它动物， 如家养动物（如狗、猫等），家畜（如牛、羊、猪、马等）或实验动物（如猴子、大鼠、小鼠、兔 子、豚鼠等）。
[0054] 如本文中所使用的，术语"多肤"指通过共价键（例如肤键）相互连接的一串至少 两个氨基酸残基，可W是重组多肤、天然多肤或合成多肤。
[0055] 如本文所使用的，FAM96A蛋白的功能性片段、变体、衍生物和类似物可W是：一个 或多个氨基酸残基被保守或非保守的氨基酸残基所取代（优选保守的氨基酸残基），取 代的氨基酸残基是或不是由遗传密码所编码的氨基酸；一个或多个氨基酸残基带有取代基 团；成熟多肤与另一化合物融合在一起；一个或多个另外的氨基酸与成熟多肤相融合，诸 如帮助纯化成熟蛋白的序列或蛋白原序列；在一端或两端或内部插入和/或添加和/或缺 失一个或多个氨基酸。从运些公开内容看，运样的片段、衍生物和类似物相信处于本领域技 术人员的知识范围内。
[005引如本文所使用的，术语"一致性"、"百分比一致性"、"同源性"或"同一性"指两个氨 基酸序列之间或者核酸序列之间的序列同一性。可W通过比对两个序列来确定百分比一致 性，百分比一致性指所比较的序列共有位置相同残基（即氨基酸或核巧酸）的数量。可使 用本领域的标准算法（例如 Smith 和 Waterman, 1981，Adv. Appl. Math. 2 :482 ;Needleman 和 Wunsch，1970, J.Mol. Biol. 48 :443 ;化arson 和 Lipman，1988, Proc.化tl. Acad. Sci.，USA， 85 :2444)或者通过运些算法的计算机化版本（Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer G;roup，575Science Drive, Madison, WI)进行序列比对 和比较，所述计算机化版本公开可用为BLAST和FASTA。另外，通过美国国家卫生研究院 度ethesda MD)可用的ENTREZ可用于序列比较。当使用BLAST和缺口 BLAST程序时，可使 用各个程序（例如BLASTN，在美国国家生物技术信息中屯、的因特网站点上可用）的缺省参 数。在一个实施方案中，可使用缺口权重为1的GCG来确定两个序列的百分比同一性，使得 每个氨基酸缺口给予权重如同它是两个序列间的单氨基酸不匹配。或者，可使用ALIGN程 序（2. 0版），其是GCG(Accebys，San Diego, CA)序列比对软件包的一部分。
[0057] "杂交"指两个单链多核巧酸非共价结合W形成稳定双链多核巧酸的过程。术语 "杂交"还可W指Ξ链杂交。所产生的（通常是）双链的多核巧酸为"杂交体"或"双链体"。 "杂交条件"一般包括低于约1M、更通常低于约500mM和低于约200mM的盐浓度。杂交溫度 可W低至5°C，但通常高于约22°C，更通常高于约30°C，优选高于约37°C。杂交通常在严格 条件（即探针会与其祀序列杂交的条件）下进行。严格杂交条件取决于序列，并在不同的 情况下存在差异。较长的片段可能需要较高的杂交溫度来进行特异性杂交。由于其他因素 (包括互补链的碱基组成和长度、有机溶剂的存在和碱基错配程度）可能影响杂交的严格 度，因此参数的组合比任何一个单独参数的绝对值更为重要。一般而言，将严格条件选择成 比确定的离子强度和抑下该特定序列的Tm低约5°C。示例性严格条件包括抑7. 0至8. 3下 至少0. 01M至不高于1M的化离子浓度（或其他盐）和至少25°C的溫度。对于严格条件， 参阅女日 Sambrook，Fritsche 和 Maniatis. "Molecular Cloning A laboratory Manual"第 二版 Col d Spring Harbor Press (1989) W及 Anderson "Nucleic Acid Hybridization" 第一版，BIOS Scientific化blishers Limited (1999)，它们对于所有上述目的均通过参考 整体并入本文。
[0058] 药物组合物
[0059] 本发明还提供了包含FAM96A蛋白（或者编码FAM96A蛋白的核酸）的药物组合物。 除了活性成分之外，根据本发明W及根据本发明使用的药物组合物可包含药学可接受赋形 剂、载体、缓冲剂、稳定剂或其它本领域技术人员公知的物质。运些物质应为非毒性的，并且 应不干扰所述活性成分的疗效。所述载体或其它物质的确切性质会取决于施用途径，所述 途径例如可W是经口、静脉内或局部。
[0060] 所述制剂可W是液体，例如含有P册.8-7. 6的非憐酸缓冲液的生理盐溶液或者冻 干粉末。
[0060 剂量
[0062] 本文所述的FAM96A蛋白优选W "治疗有效量"或"有效量"施用给个体。所述组 合物优选治疗有效量"施用给个体，所述治疗有效量或增敏有效量或有效量足W显示其 对于所述个体的益处。施用的实际量，W及施用的速率和时间过程会取决于所治疗者的自 身情况和严重程度。治疗的处方（例如对剂量的决定等）最终是全科医生及其它医生的责 任并依赖其做决定，通常考虑所治疗的疾病、患者个体的情况、递送部位、施用方法W及对 于医生来说已知的其它因素。
[0063] 在一些实施方案中，FAM96A蛋白的剂量范围可W是加 g/只鼠/天至lOug/只鼠/ 天。
[0064] 施用
[0065] 本发明中的蛋白质单独施用，其通常包括根据施用的计划方式所选的适合的药物 赋形剂、稀释剂或载体。多肤可w通过任何适合的方式适用于需要治疗的患者。精确的计 量将取决于多个因素，包括该多肤精确的性质。
[0066] 在本发明的一些实施方案中，FAM96A蛋白与抗炎药或者免疫抑制药分开施用。在 另一些实施方案中，FAM96A蛋白与抗炎药或者免疫抑制药组合施用。
[0067] 一些合适的使用方式包括（但不限于）口服、直肠、鼻部、局部（包括口腔和舌 下）、皮下、阴道或胃肠外的（包括皮下、肌肉、静脉、皮内、銷内和硬脑膜外）施用。
[0068] 对于静脉注射和在病痛位置的注射，活性成分将为一种胃肠外接受的水溶液形 式，其不含热源并具有合适的抑值、等张性和稳定性。
[0069] 本领域中相关技术人员使用，例如：等张赋形剂如氯化钢注射液、林格氏注射液， 乳酸林格氏注射液，能够很好的制备适合的溶液。根据要求，可W加入防腐剂、稳定剂、缓冲 剂、抗氧化剂和/或其它一些添加剂。口服施用的药物组合物可W是片剂、胶囊、粉剂或口 服液等形式。片剂可W包括固体载体，如明胶或辅剂。液体药物组合物通常包括液体载体， 如水、石油、动物或植物油、矿物油或合成油。也可W包括生理盐水溶液、葡萄糖或其它糖溶 液或二醇类，如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇。
[0070] W上所提到的技术和方案的例子W及其它一些根据本发明所使用的技术和方案 可 W在 Remington，S Pharmaceutical Sciences，16th edition, Oslo, A. (ed)，1980.中找 到。
[0071] 实施例1、FAM96A转基因鼠表达载体构建
[0072] 转基因小鼠用pCAGGS质粒由美国范德比尔大学吴冠青教授馈赠，PCAGGS-FAM96A 质粒由本实验构建，真核细胞表达质粒PCDNA3. 1-Myc/化sB(-)(本论文中简称PCDB)购白 Invitrogen公司，其基本过程如下：设计包含化〇1酶切序列的FAM96A基因特异性引物，W PCDNA3. 1-Myc/化sB(-)质粒为模板，克隆方案中，上下游引物具体序列分别为：
[0073] FAM96A-PCAGGS-F ：5'-CCGCTCGAGATGCTGCCGCTTCTGCT-3' ；
[0074] FAM96A-PCAGGS-R :5--CCGCTCGAGTCAATGATGATGATGATG-3-，
[007引 PCR扩增得到的片段连同真核表达载体PCDNA3. l-myc/his(-)B采用同样的限制 性内切酶进行酶切。酶切产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，切胶回收回收目的条带。回 收的载体和PCR片段用T4DNA连接酶进行连接，16°C，12小时。将连接产物进行转化，W下 为转化过程：将连接产物放入感受态大肠杆菌化1-BLUE中，冰上解育半小时，然后42°C水 浴热激90秒，LB培养液培养45分后将菌液均匀涂抹在含有氨节青霉素的固体LB培养板 上培养过夜，挑取克隆扩增培养，提取质粒进行鉴定。鉴定是否有插入片段、插入片段的大 小、片段插入的方向。对符合目的要求的阳性克隆进行质粒测序，测序结果与NCBI标准数 据库中的FAM96A 0RF序列进行比对，准确无误后进行质粒大量提取，质粒线性化，定量除菌 后提供给中国医学科学院医学实验动物研究所制作转基因小鼠。
[0076] 实施例2、Fam96a条件性基因敲除打祀载体构建
[0077] 小鼠 Fam96a基因具有5个外显子，通过在2号和3号外显子两侧插入Loxp标签 构建打祀载体，电穿孔转染胚胎干细胞，筛选出阳性克隆，囊胚注射后得到带有Loxp标签 的Fam96a-floxed小鼠。Loxp序列位于Fam96a基因第二和第Ξ外显子两侧，中间插入肥0 新霉素筛选基因。
[0078] 实施例3、质粒提取
[0079] 实验中所用质粒均使用Qiagen Maxi纯化柱制备，过程简述如下。小提纯化的质 粒转化大肠杆菌化化lue后涂至相应抗性的细菌培养皿上，14-16小时后挑单细菌菌落于 1ml抗性培养基中，37°C摇床（300转/分钟）培养8小时，扩大培养体系至lOOmU继续培 养14-16小时；6, OOOg离屯、10分钟收获细菌，加入lOmlPl (含0. 5mg/mL RNase)，充分重悬 后加入10ml P2,轻柔翻转3-4次，液体澄清后加入10ml 4°C预冷的P3,轻柔翻转3-4次， 冰浴10分钟后20, OOOg离屯、15分钟；用15ml地T预先平衡Qiagen纯化柱，将离屯、上清 经滤纸过滤后上柱，用30ml QC洗涂纯化柱，重复1次；加入10ml QF洗脱质粒，重复1次， 在洗脱液中加入12ml异丙醇，翻转充分混匀后4°C离屯、30分钟；弃上清，加入70%乙醇洗 涂，离屯、15分钟；弃上清，空气干燥10分钟后加入400ul超纯水，待沉淀完全溶解后移入EP 管；紫外分光光度计定量，琼脂糖凝胶电泳检测质量，高速离屯、除菌并分装备用
[0080] 实施例4、鼠尾基因组提取W及PCR鉴定
[0081] 鼠尾裂解液配制：
[0082] 12. 5ml 20%SDS/10ml 5M 化Cl/lOml 0. 5M 邸TA/lOml 1M Tris pH 7. 6/加水定 容至500ml
[0083] 蛋白酶Κ保存液（lOmg/ml，MILI Q水配制）分装-20保存
[0084] 鼠尾基因组提取：在剪取鼠尾的前一天配制鼠尾裂解液；编号并剪去小鼠的尾己 0. 5cm左右，放入EP管中；在每个EP管中加入上述的裂解液500ul并加入0.1 mg/ml的蛋白 酶K(化oteinase K)放入55°C水浴锅里过夜；第二天，加入300 μ 1饱和的化C1 (35. 2g化C1 定容至100ml)，颠倒混匀6-8次，冰浴15分钟；12000巧m，，室溫离屯、15分钟；转移400 μ 1 上清液至另一新的离屯、管，加入700 μ 1的异丙醇，颠倒直至形成絮状沉淀；12000rpm室溫 离屯、15分钟；弃掉上清，加入1ml 70%乙醇洗涂沉淀，弃除乙醇并惊干；根据得到的沉淀 (即DNA)的量加入适量的双蒸水溶解。
[0085] FAM96A 转基因鼠 PCR 鉴定：PCR 反应体系：5μ1 2*TAQ-Mix，4yl 肥0,0. 2μ1 前 向引物，0. 2 μ 1反向引物，0. 6ul模板，反应结束后取5 μ 1进行1 %琼脂糖电泳，如果出现有 条带则表明该小鼠基因组带有人FAM96A基因序列。
[0086] Fam96a条件性敲除鼠 PCR鉴定：Fam96a floxed小鼠基因组上带有Loxp序列，因 此我们根据该序列设计引物用于检测小鼠是否带有Loxp序列。化e重组酶的PCR鉴定： Fam96a基因敲除鉴定
[0087] 鼠 Fam96a共含有5个外显子，根据敲除策略，如果该基因被敲出将缺失第2和第 3外显子，据此设计引物可W扩出特异大小的条带。
[0088] 实施例5、FAM96A转基因鼠繁殖
[0089] 小鼠编号：小鼠出生后10-12天左右采用剪趾法进行编号，采用此方法可W编号 1-99 〇
[0090] 转基因小赢F1代的繁殖：将FAM96A转基因赢首建赢（founder) (FAM96A & 1、7、 17、23、66,罕5、14、22、3、65、29、54、18)分别与育龄期的野生型C57BL/6J小鼠交配，小鼠一 般在受精后19-21天分娩，据此，我们在大约两周之后观测小鼠腹部并用指揉法判断小鼠 的胚胎情况，如果证实确已受孕，即把雌鼠分笼。小鼠一代生育的子鼠在6-12只左右，在F1 代小鼠出生12天左右对小鼠编号并鉴定小鼠的基因型，得到FAM96A杂合子转基因小鼠，在 4周时将新生小鼠离乳。
[00川 F2代转基因小鼠的繁育：用FI代鉴定阳性的FAM96A杂合子小鼠进行近亲交配， 即同窝阳性小鼠的雌雄交配，根据最适的雌雄比例（雄：雌=1 : 2)进行，编号及鉴定方 法同F1代。
[009引 F2转基因纯合子小鼠的筛选：根据孟德尔遗传定律，我们知道F2代小鼠中有一定 概率出现纯合子，因此我们通过测交的方法来筛选F2代中的纯合子小鼠，即我们把得到的 每一只FAM96A阳性F2代小鼠与野生型的巧7BL/6J小鼠进行交配，通过子代小鼠判断F2 代小鼠是否为纯合子，如果子代小鼠经过PCR鉴定100%为FAM96A阳性，则表明亲代小鼠为 纯合子小鼠，否则则为杂合子小鼠。PCR鉴定方法同上。
[0093] 阴性鼠的来源：把F1代小鼠中的阴性小鼠进行交配，并大量繁殖，得到用于实验 对照的阴性小鼠。
[0094] 实施例6、Fam96a条件性基因敲除鼠的繁殖
[009引化e重组酶工具鼠：为了能够在小鼠全身敲除Fam96a，我们选取了只在卵细胞表 达化e重组酶的Zp3-化e小鼠作为工具鼠。
[0096] 繁殖策略：第一步，将Fam96a floxed/-鼠与Zp3-Cre转基因鼠杂交得到floxed 和化e双阳性小鼠，由于Zp3-化e只在卵细胞表达，因此只有雌性的小鼠被保留。
[0097] 第二步，将上述的雌性floxed和化e双阳性小鼠与雄性野生型巧7BL6/J交配，根 据遗传规律，后代有50 %的小鼠为Fam96a+/-杂合性敲除小鼠。
[009引第Ξ步，将上述杂合敲除小鼠同窝繁殖即可得到Fam96a-/-纯合敲除小鼠和同窝 的野生型小鼠。后续实验所用小鼠均为此种繁殖方式得到的。
[0099] 实施例7、Fam96a条件性基因敲除鼠的鉴定
[0100] 小鼠组织RT-PCR检测：分离小鼠组织300mg，置于匀浆管中，加入1ml TRIzol，匀 浆3至4次，每次20s ;4度12000g离屯、5min后吸上清，按照TRIzol说明书所述步骤提取 总RNA，RNA定量后用化ermo化rmentas逆转录试剂盒合成cDNA文库用于后续基因检测。
[0101] 小鼠组织蛋白提取及Western blot检测
[0102] 1)分离小鼠各器官，称重，每lOOmg组织中加入500 μ1的RIPA裂解液（其中加入 ImM的PMS巧至匀浆管中，匀浆20S后，将匀浆管从匀浆机上取回迅速插入冰上30s W防止 蛋白降解，然后再匀浆20s。2)把组织匀浆液放入离屯、机1200化pm，4°C，20分钟，小屯、吸取 上清液至另一离屯、管中。
[0103] 3)蛋白定量：按BCA定量试剂盒说明书提供的方法进行蛋白定量。
[0104] 4)收集上一步的组织匀浆液上清，加入SDS加样缓冲液（β琉基乙醇，甘油， 20%505,0.1漠酪蓝），99°(：保溫10分钟，离屯、后取上清，12.5%的不连续聚丙締酷 胺凝胶电泳，电泳分离蛋白样品后，用1〇〇ν，1.5小时，湿法电转印至硝酸纤维素膜上， W TBSTUris-肥1，化C1，0. 1 % Tween-20)配制5 %脱脂牛奶，4 °C封闭2小时后，与 一抗结合4°C过夜，之后用TBST震荡洗膜Ξ次，每次10分钟，再加入相应的IRDyeTM 800/700conjugated二抗避光反应一小时，TBST重复洗膜Ξ次，然后用Odyssey Imaging System仪器扫描成像分析。
[0105] 流式细胞术分析
[0106] 小鼠细胞的获取
[0107] 1) PC (腹腔细胞）
[010引准备：冰PBS20ml ; 10ml针筒；26号针头，尖吸管，眼科剪，眼科綴。
[0109] 将小鼠安乐死，吸入5-lOml PBS到针筒中，安装上针头注入小鼠腹腔内，按摩 2mins。在小鼠下腹部开一小口，用眼科綴夹住开口的边沿提起腹壁，防止液体流出，将尖吸 管伸入腹腔吸出打入的PBS，转移到15ml离屯、管中。
[0110] 。脾脏
[0111] 准备：6cm培养皿中加入5mll640培养基，200目筛网，无菌玻璃试管。
[0112] 取出脾脏至筛网上，用无菌玻璃试管捣碎研磨，1640冲洗几遍转移到15ml离屯、管 中。加入5ml培养基冲洗一遍，转移到15ml离屯、管中，共10ml。1200巧m 40C离屯、5min。吸 掉上清，加入红细胞裂解液2ml，室溫2min，加入10ml培养基中和。1200巧m 4oC离屯、5min。 吸掉上清，用10ml培养基重悬，通过200目筛网转移至新15ml离屯、管中。
[011引扣骨髓
[0114] 准备：1ml针筒、针头、6cm培养皿中加入5mll640培养基，眼科剪，眼科綴。
[0115] 眼科剪分离腿部肌肉，完整取出股骨，剪断股骨下端的盲端，吸入1ml培养基于 1ml注射器内，用注射器针头在股骨大转子和小转子之间钻孔，钻穿后向髓腔注入培养基， 将骨髓吸入6cm培养皿中，至股骨变白。吹打骨髓细胞使之成单细胞悬液，将细胞转移到 15ml离屯、管，120化pm 4oC离屯、5min。吸掉上清，加入红细胞裂解液2ml，吹打到无大块沉 淀，加入10ml培养基混匀。1200巧m 40C离屯、5min吸掉上清，用7ml培养基重悬，通过200 目筛网转移至新15ml离屯、管中。
[011引 4)胸腺
[0117] 准备：6cm培养皿中加入5mll640培养基，200目筛网，眼科剪，眼科綴，玻璃试管。
[0118] 将小鼠安乐死，取出胸腺，至200目筛网上，用玻璃试管捣碎研磨，用1640冲洗筛 网然后转移到15ml离屯、管中。1200巧m 40C离屯、5min。吸掉上清，加入红细胞裂解液2ml， 室溫2min，加入10ml培养基中和。1200巧m 4oC离屯、5min。吸掉上清，用10ml培养基重 悬，通过200目筛网转移至新15ml离屯、管中。
[0119] 流式细胞术检测
[0120] 膜表面分子的流式细胞术检测：收获上述需要染色的细胞，用PBS洗涂1次；加 入100 μ 1封闭液（2. 5% FBS/PB巧，4°C封闭30分钟；加入PBS，离屯、洗一遍，随后加入巧光 素标记抗体，4°C避光解育30min ;使用巧光素标记的相应IgG作为同型对照。最后用PBS 洗涂两次后，用100 μ 1 PBS重悬，通过流式细胞仪收集细胞，使用Flow化软件对结果进 行分析。抗体配在封闭液中，所有步骤和试剂均保持在4°C。胞内分子流式细胞术检测： 将上述需要检测的细胞按1X106每孔铺到12孔板内，加入10化g/ml PMA和lOOOng/ml ;[0]1〇1]17(^]1，同时加入1〇11旨/1]111^^4培养化后收集细胞，用？135洗两遍，4%多聚甲醒固定 30min，然后用打孔封闭液打孔30min，随后加入巧光标记的流式抗体4°C避光解育半小时， PBS洗两遍，用lOOul PBS重悬细胞，然后流式细胞仪收集细胞，使用Flow化软件分析数据。
[0121] 肥染色
[012引1)将小鼠安乐死，分离小鼠各器官组织，W中性甲酸液固定组织，石蜡包埋切片， 常规脱蜡至水。，
[0123] 2)流水冲洗化nin，苏木紫染5min，流水冲洗Imin。
[0124] 3)0. 5 %盐酸乙醇分化30s，流水冲洗。
[0125] 4)95%酒精1111111，伊红染色1111111。
[0126] 5)70%、85%、95% . 100%酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。
[0127] 实施例8、FAM96A分泌验证及原核蛋白的载体构建、诱导表达和蛋白纯化
[0128] 将肥K293T细胞铺如6孔板，待培养到对数生长其后，准备PCDA3. 1-FAM96A-His 质粒，用Vigo化ct转染细胞。6小时后换成无血清的肥KG条件培养基继续培养细胞4她， 然后收集上清，用0. 45阳的滤器过滤后，免疫印迹法检测上清中FAM96A的表达情况。
[0129] FAM96A原核表达载体阳T32a-GST-FAM96A的构建：
[0130] 使用带化〇1的上游引物和带化ndlll的下游引物从人cDNA文库中扩增 FAM96A (带信号肤），产物经琼脂糖凝胶电泳回收纯化后连入pGEM-Teasy T载体，连接产 物转化大肠杆菌化-IBlue，蓝白斑筛选，挑选白色菌落，并测序验证无误。再使用化〇1， HinduI酶切构建好的pGEM-Teasy-FAM96A质粒，释放FAM96A片段，电泳，回收纯化后，分别 连接至化〇I，HindIII酶切的阳T32a载体中，连接产物转化大肠杆菌化-1B1 μ e，酶切鉴定 阳性克隆，测序验证，获得阳T32a-GST-FAM96A质粒。FAM96A上游引物：5' -CTCGAGATGGACC TTCTTCAGTTCCTG-3'，下游引物：5' -AAGCTTCGCAACTCAGACTGGGATCTTGAA-3'。扩增条件为： 94°C 巧min) - 94°C (30s)，56°C (30s)，72°C (30s)，扩增 30 个循环一 72°C (7min)。
[0131] riiFAM96A蛋白原核表达及纯化
[0132] 基本步骤如下：
[0133] 1、1L无菌摇瓶，加入含Amp的LB (Amp终浓度为lOOug/ml)培养基200ml。
[0134] 2、Wl : 100的比例加入活化的菌种，220rmp，37°C，振荡培养大约2h。检测0D600 值，在0. 6-0. 8之间。加诱导剂IPTG (终浓度为0. 2mM)，30°C，220巧m振荡培养化。
[0135] 3、收集菌液，冰上超声裂解细菌，提取蛋白。
[0136] 4、将细菌裂解液穿过谷脫甘肤偶联的se地arose 4B柱料，在紫外分光光度计的 监控下先用PBS洗去未结合和非特异结合的杂蛋白，直到吸光度值不再变化为止。
[0137] 5、向柱料中加入凝血酶，4°C，酶切24h。
[0138] 6、分别用PBS和G甜进行洗脱，分别得到FAM96A-V1和GST蛋白。
[0139] 7、用DEAE Se地arose去除内毒素，采用PBS缓冲系统，平衡柱料至抑值7. 4,然后 将柱料和上述得到的FAM96A-V1蛋白结合，再用不同浓度的氯化钢和谷脫甘肤洗脱。
[0140] 实施例9、FAM96A转基因表达载体构建
[0141] 转基因小鼠用pCAGGS质粒由美国范德比尔大学吴冠青教授馈赠，PCAGGS-FAM96A 质粒由本实验构建，真核细胞表达质粒PCDNA3. 1-Myc/化sB(-)(本论文中简称PCDB)购 自Invitrogen公司，其基本过程如下：设计包含化〇1酶切序列的FAM96A基因特异性 引物，WpcDNA3. 1-Myc/化sB(-)质粒为模板，PCR扩增得到的片段连同真核表达载体 PCDNA3. l-myc/his(-)B采用同样的限制性内切酶进行酶切。酶切产物通过琼脂糖凝胶电 泳进行分离，切胶回收回收目的条带。回收的载体和PCR片段用T4DNA连接酶进行连接， 16°C，12小时。将连接产物进行转化，W下为转化过程：将连接产物放入感受态大肠杆菌 XL1-BLUE中，冰上解育半小时，然后42°C水浴热激90秒，LB培养液培养45分后将菌液均 匀涂抹在含有氨节青霉素的固体LB培养板上培养过夜，挑取克隆扩增培养，提取质粒进行 鉴定。鉴定是否有插入片段、插入片段的大小、片段插入的方向。对符合目的要求的阳性克 隆进行质粒测序，测序结果与NCBI标准数据库中的FAM96A 0RF序列进行比对，准确无误后 进行质粒大量提取，质粒线性化，定量除菌后提供给中国医学科学院医学实验动物研究所 制作转基因小鼠。
[0142] 小鼠骨髓来源巨隧细胞度MDM)的诱导：
[0143] 1、准备无血清的RPMI1640和56°C灭活过的胎牛血清，常规配置培养基。
[0144] 2、按照第一部分所述方法分离小鼠股骨及腔骨，收集骨髓细胞，裂解红细胞。
[0145] 3、骨髓细胞计数，调整细胞数量至每毫升1 X 107个细胞，接种细胞质25cm细胞培 养瓶，加入终浓度为lOng/ml的GM-CSF放入5 % C02细胞培养箱连续培养7天，中间第Ξ天 更换含有GM-CSF的新鲜培养基。
[0146] 4、7天后收集细胞，CDUb，F4/80流式检测细胞分化情况。
[0147] 小鼠腹腔巨隧细胞的分离
[0148] 第一天，每只小鼠腹腔注射无菌的β琉基乙酸肉汤2ml。
[0149] 第Ξ天，放血处死小鼠，向腹腔内注射5ml冰浴过的PBS，并按摩腹腔50下左右。
[0150] 在下腹部开一小口，用綴子提起腹壁防止液体流出，用尖吸管伸入腹腔小屯、的吸 出腹腔灌洗液，将液体吸入15ml离屯、管。
[0151] 300g离屯、5min，弃上清，如有红细胞，用红细胞裂解液裂解红细胞。
[0152] 用含10% 56°C灭活的胎牛血清（FB巧的1640培养基重悬细胞，将细胞铺入60mm 直径细胞培养皿中，静置化使巨隧细胞贴壁。
[0153] 用尖吸管吸走未贴壁的悬浮细胞，更换新鲜培养基，用细胞刮刀轻轻将巨隧细胞 刮下来，计数进行后续试验。
[0154] 实施例10、FAM96A在免疫系统中广泛表达，LI^刺激后内源性表达下调
[0155] 用Clontech公司的免疫组织cDNA为模板，rea]_-time PCR对FAM96A的转录本进 行扩增，结果表明FAM96A广泛表达在免疫系统各个组织中，其中胎肝表达量最高，骨髓，胸 腺，白细胞，淋己结和脾都有比较均一的相对低水平的表达，但是，FAM96A在炎性环境中的 表达变化仍不清楚。我们在THP1细胞中加入10化g/ml的LPS，分别于刺激化、1化、24h后 收集细胞进行RT-PCR检测，realtime PCR结果显示FAM96A的转录被明显的抑制；同时用 贴壁法纯化了小鼠腹腔巨隧细胞，分别加入LPS、polyl :C刺激化后发现Fam96a的转录也 被抑制。在人的外周血单个核细胞（PBMC)加入PMA分别刺激化、1化后发现FAM96A的表 达量明显降低，最后在人肺上皮A549细胞中加入IL-10后也得出类似的结论。W上数据 说明，FAM96A广泛表达在免疫细胞和上皮细胞中，在抗原和炎性细胞因子刺激下其表达明 显下调，提示FAM96A在炎症反应尤其是固有免疫免疫介导的炎症反应过程中可能发挥重 要的作用。
[0156] 实施例11、检测腹腔巨隧细胞中细胞因子mRNA和蛋白水平的表达
[0157] 将分离的腹腔巨隧细胞铺入12孔板，每孔铺IX 106个细胞。
[015引每孔加入浓度为10化g/ml的LI^刺激化后收集细胞。
[0159] 运用QIAGEN公司生产的RNA提取试剂盒，按照操作手册提取RNA。
[0160] RNA定量，逆转录试剂盒合成cDNA第一条链。
[016。 qPCR仪检测目的基因表达。
[0162] LPS刺激细胞20小时收集培养上清，ELISA检测IL-6, TNF- α，比-10等细胞因 子的表达情况，步骤如下：100 μ 1包被抗体（cap化re antibody)包被过夜；PBST(0. 05% Tween/PBS，v/v)洗五遍；200 μ 1 封闭液（1 Xassay diluent)封闭，室溫 1 小时；PBST 洗五遍；加入100 μ 1细胞培养上清，室溫解育2小时；PBST洗五遍；100 μ 1检测抗体 化iotin-detection antibody)，室溫解育 2 小时；PBST 洗五遍；100 μ 1 Avidin-HRP，室溫 解育1小时；PBST洗五遍；加入50 μ 1TMB显色5分钟，50 μ 1 2M肥S04终止；酶标仪测定 0D490-570。每个样本设立Ξ个复孔。ELISA试剂盒购于eBIOSCIENCE公司。
[0163] 实施例12、FAM96A基因敲除鼠在DSS诱导的小鼠结肠炎模型中症状明显加重
[0164] 葡聚糖硫酸钢（dextran sulfate sodium, DS巧具有抗止血和抗凝血作用，能够 影响肠上皮的通透性，导致腹泻W及肠道菌群移位及肠道溃瘍的发生。其诱导的动物模型， 在临床表现、病理学改变与人类炎症性肠病极为相似，被广泛应用于实验性I抓研究。3% DSS在饮水中供给实验小鼠，持续给药6-10天，每天定时监测小鼠的体重变化、粪便状态和 直肠出血，并按照
[0165] W下标准进行评分记录。
[0166] 粪便状态（Stool) :0-正常：2软便；4-水样腹泻。
[0167] 直肠出血度leeding) :〇-正常；2-可见血便；4-直肠出血
[016引根据每天的体重和腹泻血便情况计算出小鼠每天的疾病活动指数，W此来判断小 鼠肠炎的严重程度。计算方法如下：0 :无体重减轻，正常粪便，无血便；1 :体重减轻1-3% ; 2 :3-6%体重减轻，松软变，肉眼血便；3 :体重减轻6-9% ;4 :> 9%体重减轻，腹泻，和大量 出血。指数评分最高12分。
[0169] 持续观测到第6~10天后取小鼠结肠进行组织化学检测（H&E)，观察炎性浸润程 度W及结直肠表面的溃瘍形成，并进行病理学评分。同时记录小鼠结肠长度作为结肠炎严 重程度的指标进行统计学分析。
[0170] 实施例13、人FAM96A转基因鼠在DSS诱导的小鼠结肠炎模型中症状明显减轻
[0171] 使用实施例6的方法诱导小鼠结肠炎模型，人FAM96A转基因鼠的症状明显减轻
[0172] 实施例14、人重组FAM96A蛋白在DSS诱导的小鼠结肠炎模型中具有明显的保护作 用
[0173] DSS水饲饮小鼠，分3组，腹腔注射，煮沸的人重组FAM96A蛋白作为对照，人重组 FAM96A蛋白的小鼠按注射的不同剂量分两组，50ug/只/天，lOOug/只/天。连续7天，结 果表明人重组FAM96A蛋白在DSS诱导的小鼠结肠炎模型中具有明显的保护作用。
[0174] 实施例15、LPS刺激K0鼠腹腔巨隧细胞后，TH17相关细胞因子表达下调
[0175] 前述实验发现FAM96A在炎性刺激条件下表达下调，为了探讨Fam96a在炎症反 应过程中的作用，我们分别分离Fam96a+/+和Fam96a-/-小鼠腹腔巨隧细胞，在体外加入 lOOng/ml LI^刺激化后收集细胞，提取RNA，用qPCR检测巨隧细胞中细胞因子和趋化因子 的表达情况。通过筛查发现Fam96a-/-巨隧细胞中11-1 β，11-6, 11-23表达量明显下调， 其中11-6和11-23尤为明显；而与化1细胞分化密切相关的细胞因子11-12没有明显变 化，同时我们还发现对趋化中性粒细胞有重要趋化作用的趋化因子Cxcll也有明显下调， 但Ccl20, Mcp-1没有明显变化，与巨隧细胞极化相关的分子iNOS和Argl也没有明显变化
[0176] 实施例16、DSS诱导小鼠结肠炎模型组织学评分
[0177] 结肠 H&E染色：将小鼠安乐死，分离小鼠结肠组织，在靠近肛口处去一段1cm左 右组织，W中性甲酸液固定组织，石蜡包埋切片，常规脱蜡至水，流水冲洗化nin，苏木紫染 5min，流水冲洗Imin。
[0178] 0. 5%盐酸乙醇分化30s，流水冲洗。95%酒精Imin，伊红染色Imin。70%、85%、 95% . 100%酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。结肠标本组织学评分有专业的病理学 专家来完成，参考文献中的评分方法进行评分。组织损伤评分标准：〇,正常组织，无组织损 伤；1，肠上皮轻微损伤无溃瘍2,粘膜局部发生溃瘍；3,深度溃瘍。炎性细胞浸润评分标准： 0 :散在的少量炎性细胞浸润；1 :粘膜固有层炎性细胞浸润；2 :成片状分布的炎性细胞浸润 至粘膜下层；3 :炎性细胞深度浸润，进入肌层。
[0179] 实施例17、结肠组织RT-PCR检测
[0180] 分离小鼠结肠组织，沿长轴剪开，用冰PBS彻底洗净后，与每只小鼠结肠组织同 一位置剪1cm左右结肠组织，放入无 RNAase的匀浆管中，每管加入1ml TRIzol，匀浆30s 后置于冰上冷却后，重复几次，直至匀浆完全为止。匀浆后离屯、取上层粉红色液体，按照 TRIzol说明书所述操作步骤提取总RNA，RNA定量后，使用逆转录试剂盒合成cDNA第一条 链，rea^timePCR检测目的基因表达。
[0181] 实施例18、结肠组织中炎性细胞因子检测
[0182] 3% DSS水喂养小鼠6-8天后，处死小鼠，分离小鼠结肠组织，沿结肠长轴剪开，用 无菌冰浴PBS洗净肠内容物，将结肠组织剪成5mm左右的小段，加入含有2%青霉素和链霉 素的无血清的1640培养基培养24后，离屯、收集培养上清，放入-80°C冰箱保存W备化ISA 检测炎性细胞因子。
【主权项】
1. 人类基因 FAM96A及其编码蛋白在制备用于治疗受试者急、慢性炎症药物的用途，其 中所述多肽选自下组： (1) 具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多肽；或（2)包含与SEQ ID NO :2所述氨基 酸序列有至少70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、95 %或97 %同源性的氨基酸序列的多肽，其具 有与（2)所述多肽基本相同的生物学功能或活性；或 (2) 所述多肽的功能性片段、变体、类似物或衍生物，它们具有与（2)所述多肽基本相 同的生物学功能或活性。2. 权利要求1的用途，其中所述多核苷酸包括： (1)编码SEQ ID No :1所示氨基酸序列的核苷酸序列；（2)在严格条件下与（1)所述 的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；或（1)所示核苷酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、 90 %、95 %或97 % -致性的核苷酸序列。3. 人类基因 FAM96A及其编码蛋白的新应用在制备用于受试者自身免疫病的药物和免 疫调节的用途，其中所述多肽选自下组： (1) 具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多肽；或（2)包含与SEQ ID NO :2所述氨基 酸序列有至少70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、95 %或97 %同源性的氨基酸序列的多肽，其具 有与（2)所述多肽基本相同的生物学功能或活性；或 (2) 所述多肽的功能性片段、变体、类似物或衍生物，它们具有与（2)所述多肽基本相 同的生物学功能或活性。4. 权利要求3的用途，其中所述多核苷酸包括： (1)编码SEQ ID No :1所示氨基酸序列的核苷酸序列；（2)在严格条件下与（1)所述 的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；或（1)所示核苷酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、 90 %、95 %或97 % -致性的核苷酸序列。5. -种治疗急、慢性炎症药物组合物，该药物组合物包含人类基因 FAM96A氨基酸序列 或编码该序列的多核苷酸序列，以及一种或多种药学可接受的载体或赋形剂；其中所述多 肽选自下组： (1) 具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多肽；或（2)包含与SEQ ID NO :2所述氨基 酸序列有至少70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、95 %或97 %同源性的氨基酸序列的多肽，其具 有与（2)所述多肽基本相同的生物学功能或活性；或 (2) 所述多肽的功能性片段、变体、类似物或衍生物，它们具有与（2)所述多肽基本相 同的生物学功能或活性。6. 权利要求5的药物组合物，其中所述多核苷酸包括： (a)编码SEQ ID No :1所示氨基酸序列的核苷酸序列；（2)在严格条件下与（1)所述 的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；或（1)所示核苷酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、 90 %、95 %或97 % -致性的核苷酸序列。7. -种治疗自身免疫病和免疫调节的药物组合物，该药物组合物包含人类基因 FAM96A的氨基酸序列或编码该序列的多核苷酸序列，以及一种或多种药学可接受的载体或 赋形剂；其中所述多肽选自下组： (1)具有SEQ ID NO :2所示氨基酸序列的多肽；或（2)包含与SEQ ID NO :2所述氨基 酸序列有至少70 %、75 %、80 %、85 %、90 %、95 %或97 %同源性的氨基酸序列的多肽，其具 有与（2)所述多肽基本相同的生物学功能或活性；或 (2)所述多肽的功能性片段、变体、类似物或衍生物，它们具有与（2)所述多肽基本相 同的生物学功能或活性。8.权利要求7的药物组合物，其中所述多核苷酸包括： (1)编码SEQ ID No :1所示氨基酸序列的核苷酸序列；（2)在严格条件下与（1)所述 的核苷酸序列杂交的核苷酸序列；或（1)所示核苷酸序列具有至少70%、75%、80%、85%、 90 %、95 %或97 % -致性的核苷酸序列。
【文档编号】A61K38/17GK105879054SQ201410497615
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2014年9月26日
【发明人】王露, 马大龙, 罗阳, 尹昂
【申请人】北京大学