成纤维激活蛋白α为靶点的肿瘤DNA疫苗及病毒载体疫苗的制作方法
【专利摘要】本发明涉及以成纤维激活蛋白α为靶点肿瘤DNA疫苗和病毒载体疫苗领域。具体地说，本发明涉及重组DNA载体CpVR?FAP、重组腺病毒Ad?FAP和重组痘病毒MVA?FAP疫苗，以及DNA疫苗和病毒载体疫苗以及病毒载体疫苗之间免疫方式的优化组合或联合环磷酰胺在制备抗肿瘤疫苗中的用途。
【专利说明】
成纤维激活蛋白α为卽点的肿瘤DNA疫苗及病毒载体疫苗
技术领域
[0001] 本发明设及肿瘤DNA疫苗和病毒载体疫苗领域。具体地说，本发明设及重组DNA载 体CpVR-FAP、重组腺病毒Ad-FAP和重组痘病毒MVA-FAP疫苗，W及DNA疫苗和病毒载体疫苗 组合在制备抗肿瘤疫苗中的用途。
【背景技术】
[0002] 成纤维细胞激活蛋白a(FAPa)就是特异性表达于肿瘤相关成纤维细胞(CAF)表面 的一种抗原分子，属于丝氨酸蛋白酶家族，具有胶原酶和二肤基肤酶活性，在肿瘤宿主界面 基质的降解和重建中发挥着重要作用，参与肿瘤的生长、浸润和转移，FAPa选择性表达于 90% W上恶性上皮性肿瘤(如乳腺癌、卵巢癌、肺癌、结肠癌、膜腺癌、皮肤黑色素瘤等)的基 质，胚胎组织、愈合创面及生理性重建的器官中，而在正常成体组织中一般无表达。运些特 点使FAPa成为肿瘤发生，发展和治疗等领域中的一个新祀点。近年来，CAFs及FA阳作为一种 适用于肿瘤祀向治疗的祀标正倍受关注。目前国内外策略有：（1)利用对人源抗FAPa抗体昔 洛珠单抗Sibrotuzumab进行的免疫疗法(2)祀向FAPa的DNA疫苗和基因治疗(3)改构的FAPa 底物药物来抑制酶活性W及FAPa酶激活式祀向前体药物。（4)针对FAP基因的修饰导致FAP 基因沉默。
[0003] 因为FAP全长具有肤水解酶活性，该活性与肿瘤的生长和转移有直接的联系，如果 用其全长来设计疫苗可能存在安全隐患，可能会迫使肿瘤生长加速，根据国内外文献的报 道采取FAP酶活突变体作为抗原，在保证水解酶活性缺失的情况下尽量保存长度W提高免 疫原性。因此本发明采用的FAP丝氨酸蛋白激酶催化功能缺失的突变体来设计疫苗。该催化 区域的关键结构是由氨基酸序列第624位的丝氨酸(Ser624)，702位的天冬氨酸(Asp702)和 734位的组氨酸化is734)构成的催化Ξ联体，其中Ser624对FA阳活性发挥至关重要，若将其 转变为丙氨酸，FAPa水解活性将消失;基于运点本发明采用酶活缺失的点突变体作为抗原 设计疫苗，可W确保疫苗的安全性和效率，避免抗原大量表达加速肿瘤生长不利于治疗。
[0004] 从发现FAPa到现在已用其进行了一些的疫苗研究工作，并有一些肿瘤免疫治疗策 略(CAR-T)已经进入临床研究阶段，但对于疫苗来说大多数都处于临床前探索，并且因为治 疗的肿瘤模型都是小鼠肿瘤，所W目前抗原选择都是鼠源FAPa,采用人源FAPa作为疫苗治 疗小鼠肿瘤还没被报道过，因为人鼠同源性较高(90%)，预测CTL结合抗原肤两个种属之间 有十分相似，所W本发明采取人源FAPa作为疫苗设计祀点，运样更有利于向将来临床治疗 提供直接的数据，如果人源FA阳引起的CTL[7]可W杀伤小鼠肿瘤CAF，那么杀伤人肿瘤CAF的 可能性就越高，治疗人类肿瘤的可行性也就越高。目前肿瘤疫苗进入临床的基因疫苗主要 是DNA疫苗，重组腺病毒疫苗和重组痘病毒疫苗，DNA载体疫苗由于免疫原性较弱，病毒载体 系统是最有效的基因转运方法，其基因转运效率通常在90% W上，因此目前的基因治疗临 床试验中77% W上都是使用病毒载体。
[0005] 随着FA阳作为一种极具潜力的抗肿瘤祀标分子正受到关注，我们有必要在运里总 结一下FAPa作为一种微环境抗原相对于肿瘤相关抗原的优势有哪些，总结起来有五点：（1) 90% W上的上皮性肿瘤间质中FA阳呈阳性表达，正常组织仅限于创伤愈合和胚胎组织少量 表达；（2)FAPa阳性成纤维细胞是肿瘤基质的主要构成成分，抗原祀位十分丰富；（3)间质成 纤维细胞是非转化细胞，与肿瘤细胞相比其基因组较稳定，避免出现抗原丢失和治疗耐受 的风险；（4)FA阳阳性基质细胞主要围绕癌巢的肿瘤血管内皮细胞分布，运为WFAPa为祀标 的细胞毒性药物选择性富集在肿瘤血管周围提供了有利条件；（5) W表达FA阳为标志的CAF 和肿瘤微环境具有很强的免疫抑制功能，针对FAPa可W有效地减少CAF，从而破坏肿瘤微环 境，一方面减少微环境的屏障和供养肿瘤的功能，另一方面又可W有效地降级肿瘤微环境 起到的抑制作用，为联合免疫治疗排除了免疫抑制因素方面的威胁和障碍。总结起来可W 说FAPa作为祀点，祀向精确，广谱性高，过程稳定，方便富集，针对微环境抑制和保护，可W 说一石二鸟，所W本发明选择FAPa作为肿瘤疫苗设计的祀抗原。
【发明内容】
[0006] 本发明首先WFAPa为祀点进行肿瘤基因疫苗的研究，分别构建DNA载体疫苗 (CpVR-FAP)和腺病毒载体疫苗(Ad-FAP)，采用DNA初免-重组腺病毒加强免疫(DNA prime- rAd boost)免疫策略，通过免疫小鼠检测FAPa基因疫苗的免疫原性及抗肿瘤活性，结果表 明：小鼠可产生针对FAPa的特异性细胞免疫反应和体液免疫反应(见图9、图10、图11 )，该疫 苗具有一定的保护力和抗肿瘤活性，在预防性实验中，与PBS组比较，CpVR-FAP DNA疫苗组 肿瘤生长抑制率为22 %，CpVR-FAP/Ad-FAP疫苗免疫组模型小鼠肿瘤生长抑制率为23 % (见 图12和图13)。联合环憐酷胺后小鼠肿瘤生长抑制率提高至87% (见图14和图15)。
[0007] 本发明之后又WFAPa为祀点构建了痘病毒载体疫苗(MVA-FAP)，采用DNA初免-重 组痘病毒加强免疫(DNA prime-MVA boost)免疫策略，通过免疫小鼠检测FAPa基因疫苗的 免疫原性及抗肿瘤活性，结果表明：小鼠同样可产生针对FAPa的特异性细胞免疫反应(见图 16、图17、图18)，该疫苗具有一定的保护力和抗肿瘤活性，在预防性实验中，与PBS组比较， CpVR-FAP/MVA-FAP疫苗免疫组模型小鼠肿瘤生长抑制率为19% (见图19和图20) Jrime- boostc策略联合环憐酷胺后小鼠肿瘤生长抑制率提高至90% (见图23和图24)。
【附图说明】
[000引图1、2. DNA载体及重组DNA载体疫苗图谱。图1为CpVR载体图谱；
[0009] 图2为重组质粒CpVR-FAP图谱；
[0010] 图3-5.重组腺病毒载体图谱及制备流程。图3为AdMax?腺病毒载体及重组病毒制 备流程;图4为穿梭载体PDC316图谱；图5为重组穿梭载体PDC316-FAP图谱；
[0011] 图6-8.MVA重组原理及相关载体图谱。图6为MVA重组示意图；图7为穿梭载体 pSCll图谱；图8为重组穿梭载体pSCll-FAP图谱，FAP结构基因表达框架重组到MVA的TK基因 中，基因表达的启动子采用P7.5。
[0012] 图9-11. W不同形式FAP基因疫苗免疫健康小鼠后，小鼠脾淋己细胞的特异性CTL 杀伤活性检测和IFN-丫分泌性T细胞检测。从被免疫小鼠脾细胞中分离的淋己细胞为效应 细胞，并用特异性抗原肤化-2d限制性)标记的小鼠癌细胞株P815作为祀细胞，采用CFSE巧 光标记法检测免疫鼠的CTL应答（图9)。同时用化ISPOT法检测T细胞释放IFN- 丫的能力（图 10)，阴性刺激物为培养基(R10)，阳性刺激物为FAP混合小肤。小鼠免疫前和每一针免疫后 一周进行采血，获得血清用FA的的蛋白包被，通过化ISA的方法检测免疫后小鼠产生的特异 性抗体(图11)。
[OOK]图12、13.不同形式FAP基因疫苗对4T1肿瘤细胞体内生长的免疫预防作用。Ba化/C 小鼠经PBS对照组、Ad-FAP、CpVR-FAP、CpVR-FAP/Ad-FAP在间隔2周免疫Ξ次后一周，接种 4T1肿瘤细胞，测量肿瘤大小（图12)至24天，处死统计瘤重情况(图13)。
[0014] 图14、15.不同形式FAP基因疫苗疫苗诱导小鼠产生特异性细胞免疫反应比较。用 特异性抗原肤化-2d限制性)标记的小鼠癌细胞株P815作为祀细胞，采用CFSE巧光标记法检 测免疫鼠的CTL应答（图14)。同时用化ISP0T法检测T细胞释放IFN- 丫的能力（图15)，阴性刺 激物为培养基(R10)，阳性刺激物为FAP混合小肤。
[0015] 图16、17.不同形式FAP基因疫苗联合环憐酷胺对4T1肿瘤细胞体内生长的预防作 用。在给Ba化/C小鼠皮下接种4T1肿瘤细胞后，分别给予PBS对照组、环憐酷胺（〔￥)^9￥尺- FAP，CpVR-FAP/Ad-FAP、CpVR-FAP/CY、CpVR-FAP/Ad-FAP/CY 疫苗，测量肿瘤大小（图 16)至22 天，测量瘤重情况(图17)。
[0016] 图18-20. W不同形式FAP基因疫苗免疫健康小鼠后，小鼠脾淋己细胞的特异性 CTL杀伤活性检测和IFN-丫分泌性T细胞检巧U。小肤混合物与P815祀细胞混合后与不同比例 皮细胞混合，采用CFSE巧光标记法检测免疫鼠的CTL应答（图18)。同时用化ISPOT法检测T细 胞释放IFN-丫的能力（图19)，阴性刺激物为培养基(R10)，阳性刺激物为FAP混合小肤。小鼠 免疫前和每一针免疫后一周进行采血，获得血清用FA阳的蛋白包被，通过化ISA的方法检测 免疫后小鼠产生的特异性抗体(图20)。
[0017]图21、22.不同形式FAP基因疫苗对4T1肿瘤细胞体内生长的免疫预防作用。Balb/C 小鼠经PBS对照组、MVA-FAP、CpVR-FAP、CpVR-FAP/MVA-FAP在间隔2周免疫Ξ次后一周，接种 4T1肿瘤细胞，测量肿瘤大小（图21)至24天，处死统计瘤重情况(图22)。
[001引图23、24.不同形式FAP基因疫苗疫苗诱导小鼠产生特异性细胞免疫反应比较。小 鼠脾淋己细胞的特异性CTL杀伤活性检测和IFN-丫分泌性T细胞检测。用特异性抗原肤化- 2d限制性)标记的小鼠癌细胞株P815作为祀细胞，采用CFSE巧光标记法检测免疫鼠的CTL应 答（图23)。同时用化ISP0T法检测T细胞释放IFN-丫的能力（图24)，阴性刺激物为培养基 (R10)，阳性刺激物为FAP混合小肤。
[0019] 图25、26.不同形式FAP基因疫苗联合环憐酷胺对4T1肿瘤细胞体内生长的治疗作 用。在给Ba化/C小鼠皮下接种4T1肿瘤细胞后，分别给予PBS对照组、环憐酷胺（CY)、CpVR- FAP/MVA-FAP、CpVR-FAP/MVA-FAP/CY疫苗，测量肿瘤大小（图25)至22天，测量瘤重情况（图 26)。
【具体实施方式】
[0020] -.上述片段FA阳的制备方法和条件
[0021] l.FAPa 的制备
[0022] FA阳含有2281个碱基，GenBank号为NM_004460(沈Q ID N0:1)。根据其的序列设计 了一对引物，人肠癌患者样本cDNA中中扩增出了FAPa的基因片段，序列为SEQ N0:1所示的 碱基序列。具体方法如下：
[0023] l)pGEM-T-FAP的构建、酶切鉴定及序列分析
[0024] 将肠癌患者样本cDNA的扩增FAPa的PCR产物与pGEM-T-easy载体进行连接得到含 有FA阳的pGEM-T-FAP质粒。经序列分析证实正确。
[0025] 二.重组疫苗的获得方法及相应的条件
[0026] 1.DNA载体疫苗
[0027] l)CpVR-FAP 的构建
[002引 CpVR载体含有CpG基序，CMV启动子，卡那霉素抗性基因，内含子A和BGH PolyA翻译 终止信号等常规部件组成，共4913bp，图谱见图1dWpGEM-T-FAP为模板，WF3和F4为引物通 过PCR扩增序列（SEQ ID NO: 1)，正向引物F3引入Bgl 11和Sal I的酶切位点，反向引物F4引入 了 Κρη I、Sa 11和BamHI的酶切位点。
[0029] 将上述制得的PCR产物和载体经Bglll和BamHI双酶切后用胶回收试剂盒（北京天 根生化科技有限公司）回收基因片段和载体片段，双酶切后具有相同粘性末端运一性质将 所回收的目的基因片段和载体片段，WT4DNA连接酶，在16°C下连接过夜。用所得连接产物 转化感受态大肠杆菌ToplO(invitrogen公司），涂布卡那霉素抗性的LB平板，并于37°C下培 养过夜，挑选阳性菌落于5mlLB培养基中37°C下培养1化，l，20(K)rpm离屯、收获菌体，用质粒 提取试剂盒(北京天根生化科技有限公司）提取质粒，用Bglll和BamHI进行双酶切和测序鉴 定，结果正确，即得到了重组质粒CpVR-FAP，图谱见图2。
[0030] 2.重组腺病毒疫苗(Ad-FAP)的获得
[0031] 腺病毒是一种无外壳的双链DNA病毒，基因组长约36kb，衣壳呈规则的20面体结 构，直径约80-110皿。腺病毒基因组的两端各有一段l(K)bp的反向末端重复序列（ITR)，是复 制的起始位点。在左端ITR的3M则有一段长约3(K)bp的包装信号(Φ)介导腺病毒基因组包装 入病毒衣壳。对腺病毒而言，只有包括两端的ITR和包装信号(Φ)的约0.化b的序列是顺式作 用元件，即必须由腺病毒载体自身携带，而其他的30余种蛋白都可W通过辅助病毒（或细 胞)反式补足。
[0032] 本实验中采用的腺病毒系统是AdMax? Adenovirus载体系统(Microbix公司），该 系统是位点特异性重组系统，位点特异性重组是发生在两条DNA链特异位点上的重组，重组 的发生需一段同源序列即特异性位点和位点特异性的蛋白因子即重组酶参与催化。重组酶 只能催化特异性位点间的重组，不能催化其它任何两条同源或非同源序列之间的重组，因 而重组具有特异性和高度保守性。据此，位点特异性重组又称保守重组，该重组过程不需 RecA酶参与。目前应用较多的有Cre/loxP、FLP/FRT和BP/attBP系统，其中Cre、化P和BP均为 特异性重组酶，属重组酶λ整合酶家族，它们催化的反应类型、祀位点及重组机制十分相似， loxP、FRT和attBP为特异性位点，也有相似的结构。AdMaxTM Adenovirus载体应用的是化e/ loxP系统，Cre基因表达产物为343个氨基酸的单聚体蛋白，分子量为38kDa，它是位点特异 性重组发生所需的特异性重组酶，其识别位点被称为loxP(locus of crossing-over P1)， 为一段34bp的DNA序列，由两个13bp的反向重复序列和一个8bp的不对称间隔序列（又称为 核屯、序列）组成5' -ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT-3'。loxP位点碱基重排后形成 十字形的结构，核屯、序列形成一单链环，它为Cre重组酶切割的底物，也是DNA识别与重组的 位点，对称的13bp反向重复序列是化e重组酶结合的序列。
[0033] AdMaxTM Adenovirus载体系统是由穿梭载体和骨架载体(pBHGlox Δ E1,3Cre)构 成，各含有一个同向排列的LoxP位点，其中骨架载体还含有由CMV启动子调控的Cre基因。将 穿梭载体与骨架载体共转染包装细胞株293,骨架载体所携带的Cre基因开始表达，介导两 个LoxP位点之间的重组，剪切掉骨架载体上的细菌内复制元件、抗性基因 W及Cre基因，同 时完成目的基因的插入。由于骨架载体虽然携带有大部分的腺病毒基因组DNA却缺少形成 有感染能力腺病毒颗粒所必需的包装信号(Φ)，而穿梭载体则含有Φ，因此只有在两个载体 之间发生了重组，才能完成腺病毒生活周期，形成有感染能力的重组腺病毒颗粒;另外，骨 架载体缺失E1基因，因此需要转染组成型表达E1蛋白的293细胞。将骨架载体和穿梭载体 (本研究选用的穿梭载体为PDC316,图谱见图4)共转染293细胞，利用293细胞中的E1蛋白， 10左右天就可W产生出含有外源基因的重组腺病毒隧斑(见图3)，挑取隧斑，进行PCR(反应 条件为:951：3〇3、531：3〇3、72°(：1111111，进行30个循环)鉴定，选取正确的克隆进行大量扩增、 纯化和滴度测定。
[0034] 1)穿梭重组质粒PDC316-FAP的获得
[0035] 将PGEM-T-S8用Bglll/Sall双酶切后回收得到FAPa目的片段，将PDC316用Bglll/ Sail双酶切后回收作为载体，利用Bglll/Sall具有相同粘性末端的性质，将回收目的基因 片段和载体片段进行用T4DNA连接酶，16度连接过夜。用所得连接产物转化感受态大肠杆菌 ToplO(Invitrogen公司），涂布卡那霉素抗性的LB平板，并于37°C下培养过夜，挑选阳性菌 落于5mlLB培养基中37°C下培养16h，l，2000巧m离屯、收获菌体，用质粒提取试剂盒(北京天 根生化科技有限公司）提取质粒，用Bglll/Sall进行双酶切和测序鉴定，结果正确，即得到 了重组质粒PDC316-FAP(图谱见图5)质粒。
[0036] 2)Ad-FAP重组病毒的获得
[0037] 将pBHGloxAEl，3Cre和PDC316-FAP共转染293细胞后，经过四轮筛选、扩增、纯化 后，获得含有FA阳片段的重组腺病毒Ad-FAP。
[003引 3.重组MVA疫苗(MVA-FAP)的获得
[0039] 改良安卡拉痘苗(MVA，Modified Vaccinia Ankara)具有安全性高、外源基因容量 大等优点使其得W广泛应用于肿瘤免疫治疗中。MVA含有胸巧激酶基因（TK)(参见图6); PSCIU参见图7)是它的穿梭质粒，具有多克隆酶切位点可W插入外源基因、具有胸巧激酶 的左臂和右臂（TKL、TKR)可W与MVA进行同源重组，同时含有lacZ基因，可W用于重组MVA (rMVA)的蓝斑筛选。
[0040] 1)穿梭重组质粒pSCll-FAP的获得
[0041 ] 将CpVR-FAP和pSCll经Sail/时nl双酶切后回收，将回收目的基因片段FAPa和 pSCl 1载体片段用T4DNA连接酶，16度连接过夜。用所得连接产物转化感受态大肠杆菌ToplO (invi化ogen公司），涂布卡那霉素抗性的LB平板，并于37°C下培养过夜，挑选阳性菌落于 5mlLB培养基中37°C下培养16h，1200化pm离屯、收获菌体，用质粒提取试剂盒(北京天根生化 科技有限公司）提取质粒，用Sall/Kpnl进行双酶切和测序鉴定，结果正确，即得到了重组质 粒 pSCll-FAP(见图8)。
[0042] 2)MVA-FAP重组病毒的获得
[0043] 首先 W滴度 0.05pfu/cell 的 MVA 感染 tk-tsl3 细胞（购自 ATCC，ATCC 号为 CR^ 1632?，是不含有TK基因的BHK-21的突变株）。感染2小时后，利用Lipofection2000 (INVITR0GEN)的方法将pSCll-FAP转染到感染了 MVA的tk-tsl3细胞中。MVA在tk-tsl3细胞 内复制的过程中，由于pSCl 1-FAP具有与MVA的TK基因同源的T化和TKR，所W有一定比例的 MVA病毒与pSCl 1-FAP发生重组，结果FA阳和LacZ阅读框架被重组到MVA病毒基因组中，形成 MVA-FAP重组病毒。W上被感染细胞培养Ξ天后，收集细胞，裂解细胞，超声波处理，300化pm 离屯、lOmin除去细胞残渣保留上清。取一定量上清，作为种毒，在6孔板中将病毒依次稀释成 1〇-2、1〇-3、1〇-4、1〇-5、1〇- 6，感染*4-*813细胞2}1。将等体积的在42°(：下预溫的2%低烙点琼脂 糖和2 X DMEM-10/Br加(化加，5-漠脈喀晚，可被TK憐酸化，憐酸化的化加可渗入到野生型 MVA中，产生致死性突变，从而可W使野生型MVA逐渐减少)培养基混匀，每孔加入3ml培养 基，在室溫下凝固，在37Γ下于含5%C02的培养箱中培养4她。铺上层选择性培养基，成分比 下层琼脂多了 1/120体积的4%X-gal。培养过夜，挑选蓝色单斑，反复冻融Ξ次裂解释放病 毒，进行下一轮的筛选，步骤相同，如此进行4轮W上筛选，最后直至得到只含重组病毒MVA- FAP的克隆株。经过扩增纯化，获得大量的重组病毒MVA-FAP。
[0044] 疫苗免疫效果
[0045] 1.FA阳疫苗免疫效果
[0046] 1.1 FAPa疫苗的免疫原性
[0047] 本部分实验从体液免疫和细胞免疫两个方面探讨FAPa的DNA疫苗和重组腺病毒疫 苗共免疫诱导小鼠的免疫应答。实验将Balb/C小鼠按表1进行分组，1组在第0、2、4周注射 PBS; 2组在第0、2周注射PBS，第四周注射Ad-FAP疫苗。3和4组在第0、2周注射CpVR-FAP疫苗， 第四周分别注射CpVR-FAP和Ad-FAP疫苗;考察DNA疫苗单独免疫的免疫效果、W及重组腺病 毒的免疫增强作用。
[004引表1 FAP疫苗免疫原性 [0049]
[0051 ] 1.1.1细胞免疫一细胞毒性T淋己细胞(CTL)活性，刺激脾细胞产生IFN- 丫的能力
[0052] 末次免疫后两周处死小鼠，取脾并分离淋己细胞。W从被免疫小鼠脾细胞中分离 的淋己细胞为效应细胞，并W用FAP特异性抗原肤混合物标记的P815细胞(购自ADCC)，按一 定比例混合上述效应细胞和祀细胞，采用CFSE巧光标记法最后通过流式检测淋己细胞对祀 细胞的杀伤情况，用来表征所述疫苗在小鼠体内诱导的特异性CTL反应强度。
[0053] 本发明根据SYFPEITHI算法(WWW. syf-peithi.de)预测生存素的H-2Dd MHCI限制 性表位肤，选择与H-2〇d MHCI的结合常数值较高的抗原肤F105-113化SPDRQFVY)，F275-283 (VGP犯VPVP)and F542-550(GGPCSQSVR)，作为抗原肤进行上述实验。
[0054] 实验结果由图9可W看出，与PBS对照组相比，Ad-FAP组未检测到FAP特异性CTL(p >0.05) ;CpVR-FAP组在效祀比为100:1时可检测到CTL应答并且统计学意义（p<0.05); CpVR-FAP/Ad-FAP组在注射了两针DNA疫苗后又注射了 一针重组腺病毒疫苗Ad-FAP加强免 疫，结果在效祀比为100:1、50:1时均检测到了特异性CTL应答(p<0.05)，与CpVR-FAP组比 较CTL应答也明显提高(p<0.05)。
[0055] 图10是W用FAP特异的限制性表位肤与相应数目的各个疫苗组脾细胞解育，检测 不同的疫苗诱导小鼠产生FAP特异性IFN- 丫的情况。由图可W看出与PBS对照组和其他疫苗 组但不加抗原肤刺激(R10)相比，Ad-FAP、CpVR-FAP、CpVR-FAP/Ad-FAP组，均产生了 FAP特异 性的IFN-丫，产生的IFN-丫水平依次升高，联用组加肤实验组与不加肤刺激的对照组之间 相比具有统计学意义(p<〇.05)，CpVR-FAP/Ad-FAP相对于CpVR-FAP组也有明显的提高(P< 0.05)。
[0056] 1.1.2体液免疫一化ISA检测特异性抗体
[0057] 每次免疫后1周，对小鼠进行眼静脉取血，加上免疫前取血共四次，将所分离血清 用于特异性抗体检测。FAP蛋白包被化ISA板，作为检测小鼠血清的抗原。从各实验组中取1: 125稀释(稀释液为PBS配制的1%的牛奶)的免疫血清作为第一抗体，加入1:3000稀释的HRP 标记抗鼠二抗，之后加入TMB显色液显色，每孔加入50ul 2M此S化终止后马上用酶标仪在 450nm处读数并记录数据。由图11可W看出各组产生了针对FAP的特异性抗体，每次免疫后 抗体水平均被增强，CpVR-FAP/Ad-FAP与CpVR-FAP组刺激产生抗体滴度水平相当。
[0058] 由上述体液免疫和细胞免疫结果可W看出单独应用CpVR-FAP基因疫苗可W诱导 小鼠产生针对FAPa的特异性抗体和CTL免疫应答。重组腺病毒疫苗在两针针DNA疫苗免疫后 进行加强免疫可明显提高CpVR-FAP疫苗免疫组的CTL应答水平和IFN-丫分泌能力，起到了 加强免疫的作用。
[0059] 1.2 FA阳疫苗的肿瘤保护性
[0060] 1.2.1 预防性
[0061] 根据前面的结果可知FAPa基因疫苗能够诱导小鼠产生特异性体液免疫和细胞免 疫，本节采用FAPa的DNA疫苗和重组腺病毒疫苗进行模型小鼠肿瘤的预防实验，W考察生存 素基因疫苗W及prime-boost免疫方式是否可W在小鼠体内诱导产生保护性抗肿瘤免疫应 答。
[0062] 表2 FAP疫苗预防分组
[0063]
[0064] 将Ba化/C小鼠按表2随机分为4组（10只/组）。1组在第0、2、4周注射PBS;2组在第0、 2周注射PBS，第四周注射Ad-FAP疫苗。3和4组在第0、2周注射CpVR-FAP疫苗，第四周分别注 射CpVR-FAP和Ad-FAP疫苗;所有小鼠均在末次免疫一周后于小鼠右侧背下部皮下接种4T1 肿瘤细胞，考察成瘤时间和肿瘤大小的变化.
[00化]1.2.1.1肿瘤生长的抑制作用
[0066] 实验结果表明，与PBS免疫组相比，CpVR-FAP和CpVR-FAP/Ad-FAP免疫组的模型小 鼠肿瘤生长明显减慢.图12、图13为预防实验各组肿瘤体积变化和瘤重情况，由图可W看出 Ad-FAP免疫组与PBS对照组比较，肿瘤生长也有明显变化;CpVR-FAP W及CpVR-FAP/Ad-FAP 免疫组与PBS组比较，小鼠肿瘤的生长缓慢，二者有显著差异（在接种肿瘤后16-24天，p< 0.001);与CpVR-FAP单独免疫组比较，CpVR-FAP/Ad-FAP共免疫组肿瘤生长没有明显缓慢。
[0067] 1.2.1.2细胞免疫一细胞毒性T淋己细胞(CTU活性，刺激脾细胞产生I FN-丫的能 力
[0068] 末次免疫后两周处死小鼠，取脾并分离淋己细胞。W从被免疫小鼠脾细胞中分离 的淋己细胞为效应细胞，并W用FAP特异性抗原肤混合物标记的P815细胞(购自ADCC)，按一 定比例混合上述效应细胞和祀细胞，采用CFSE巧光标记法最后通过流式检测淋己细胞对祀 细胞的杀伤情况，用来表征所述疫苗在小鼠体内诱导的特异性CTL反应强度。
[0069] 实验结果图14可W看出，与PBS对照组相比，Ad-FAP组未检测到FAP特异性CTL(p> 0.05); CpVR-FAP与CpVR-FAP/Ad-FA组在效祀比为100:1时可检测到CTL应答并且统计学意 义(p<0.05);与CpVR-FAP组比较CTL应答没有明显提高(p>0.05)。
[0070] 图15是W用FAP特异的限制性表位肤与相应数目的各个疫苗组脾细胞解育，检测 不同的疫苗诱导小鼠产生FAP特异性I FN- 丫的情况。由图可W看出与PBS对照组和其他疫 苗组但不加抗原肤刺激(R10)相比，CpVR-FAP、CpVR-FAP/Ad-FAP组，均产生了FAP特异性的 IFN-丫，产生的IFN-丫水平依次升高，联用组加肤实验组与不加肤刺激的对照组之间相比 具有统计学意义(P<〇.〇5)，CpVR-FAP/Ad-FAP相对于CpVR-FAP组也有所提高，但不具有统计 学意义(P大于0.05)
[0071] 1.2.2 prime-boost策略联合环憐酷胺的预防性作用
[0072] Ba化/C小鼠随机分为6组，攻瘤前第5,3，1周按照下表的顺序进行免疫，第0天于小 鼠右后背部皮下接种2X 1〇4 4T1细胞，肿瘤接种后第3，10，17天每只小鼠腹腔注射Img环憐 酷胺(CY).肿瘤接种后第22天，处死全部实验小鼠，剥瘤称取瘤重，取脾检测疫苗在荷瘤小 鼠体内产生的细胞免疫反应。实验设计如下：
[0073] 表3:联合疫苗免疫情况分组
[0074]
[0075]
[0076] 1.2.2.1肿瘤生长的抑制作用
[0077] 图16为治疗实验各组肿瘤体积变化情况。相对于CpVR-FAP、CpVR-FAP/Ad-FAP组， CpVR-FAP/CY组、CpVR-FAP/AD-FAP/CY组均能更明显抑制肿瘤的生长(p<0.01 ;!)<0.0001); CpVR-FAP/AD-FAP/CY与CpVR-FAP/CY二组相比较，肿瘤生长速度也有所减慢，并且具有统计 学意义(p<〇.05)，CY与疫苗联合应用能起到协同和累加的效果。图17为治疗各个组肿瘤质 量的变化情况。相对于 CpVR-FAP、CpVR-FAP/Ad-FAP 组，CpVR-FAP/CY 组与 CpVR-FAP/AD-FAP/ CY组抑制肿瘤的水平明显更强且具有统计学意义(P<0.05)，具体数据如下：PBS肝〇叫= 1.211±0.5315g, CpVR-FAP group = 0.8±0.4586g, CpVR-FAP/Ad-FAP group = 0.8013 ± 0.3978g，CY group = 0.3788 ±0.101 Ig，CpVR-FAP/CY grow = 0.2438±0.0778g，CpVR- FAP/Ad-FAP/CY group = 0.1623±0.0703g，瘤重的数据与肿瘤生长曲线的结果相对应，联 合疫苗组的抑瘤率相对于CpVR-FAP/Ad-FAP组提高了53%，再次证明联合疫苗展现出良好 的协同作用。
[007引 1.3 MVA-FAP疫苗的免疫原性
[0079] 本部分实验从体液免疫和细胞免疫两个方面探讨FAPa的DNA疫苗和重组腺病毒疫 苗共免疫诱导小鼠的免疫应答。实验将Balb/C小鼠按表1进行分组，1组在第0、2、4周注射 PBS; 2组在第0、2周注射PBS，第四周注射MVA-FAP疫苗。3和4组在第0、2周注射CpVR-FAP疫 苗，第四周分别注射CpVR-FAP和MVA-FAP疫苗;考察DNA疫苗单独免疫的免疫效果、W及重组 腺病毒的免疫增强作用。
[0080] 表4 MVA-FAP疫苗免疫原性
[0081]
[0083] 1.3.1细胞免疫水平检测
[0084] 本组实验中主要通过体外检测CD8+细胞数目和化I SPOT来评价疫苗刺激产生细胞 免疫水平。IFN- 丫分泌性T细胞方面检测：处理好免疫的小鼠脾细胞，加入全长FAPa蛋白作 为刺激剂，培养基R10作对照，结果显示如图18。由图可W看出，除PBS组外，与未加刺激对照 相比，各实验组刺激后T细胞分泌IFN- 丫有显著提高。即各组都产生了针对FA阳特异性IFN- 丫细胞免疫反应。而且prime-boost免疫策略的实验组产生分泌性IFN- 丫高于DNA疫苗免疫 组(P<0.05)，符合我们的预期。同时将各组脾细胞进行CD3XD8表面分子抗体的巧光染色， 解育一段时间后用Cell Staining buffer洗两次，最后在重悬送去流式检测CD8+细胞在脾 细胞的比例，结果如图19所示，可W看出prime-boost疫苗组刺激产生CD8+化k例高于DNA疫 苗免疫组。1.3.2体液免疫一特异性FA阳抗体检测
[0085] 每次免疫后1周，对小鼠进行眼静脉取血，加上免疫前取血共四次，将所分离血清 用于特异性抗体检测。FAP蛋白包被化ISA板，作为检测小鼠血清的抗原。从各实验组中取1: 125稀释(稀释液为PBS配制的1%的牛奶)的免疫血清作为第一抗体，加入1:3000稀释的HRP 标记抗鼠二抗，之后加入TMB显色液显色，每孔加入50ul 2M此S化终止后马上用酶标仪在 450nm处读数并记录数据。由图20可W看出DNA疫苗组和prime-boost组产生了针对FAP的特 异性抗体，每次免疫后抗体水平均被增强，CpVR-FAP/Ad-FAP与CpVR-FAP组刺激产生抗体滴 度水平相当。
[0086] 由上述体液免疫和细胞免疫结果可W看出单独应用CpVR-FAP基因疫苗可W诱导 小鼠产生针对FAPa的特异性抗体和CTL免疫应答。重组MVA-FAP在两针针DNA疫苗免疫后进 行加强免疫可明显提高CpVR-FAP疫苗免疫组的CTL应答水平和IFN- 丫分泌能力，起到了加 强免疫的作用。
[0087] 1.4 prime-boost疫苗的肿瘤保护性
[008引 1.4.1预防性
[0089] 根据前面的结果可知FAPa基因疫苗能够诱导小鼠产生特异性体液免疫和细胞免 疫，本节采用FAPa的DNA疫苗和重组痘病毒疫苗进行模型小鼠肿瘤的预防实验，W考察生存 素基因疫苗W及prime-boost免疫方式是否可W在小鼠体内诱导产生保护性抗肿瘤免疫应 答。
[0090] 表5 MVA-FAP疫苗预防分组
[0091]
[0092] 将Ba化/C小鼠按表2随机分为4组（10只/组）。1组在第0、2、4周注射PBS;2组在第0、 2周注射PBS，第四周注射MVA-FAP疫苗。3和4组在第0、2周注射CpVR-FAP疫苗，第四周分别注 射CpVR-FAP和MVA-FAP疫苗;所有小鼠均在末次免疫一周后于小鼠右侧背下部皮下接种4T1 肿瘤细胞，考察成瘤时间和肿瘤大小的变化.
[0093] 1.4.1.1肿瘤生长的抑制作用
[0094] 实验结果表明，与PBS免疫组相比，CpVR-FAP和CpVR-FAP/MVA-FAP免疫组的模型小 鼠肿瘤生长明显减慢.图21，22为预防实验各组肿瘤体积变化和瘤重情况，由图21和22可W 看出MVA-FAP免疫组与PBS对照组比较，肿瘤生长无明显变化;Cp VR-FAP W及Cp VR-FAP/Ad- FAP免疫组与PBS组比较，小鼠肿瘤的生长缓慢，二者有显著差异(在接种肿瘤后22-24天，p< 0.001);与CpVR-FAP单独免疫组比较，CpVR-FAP/MVA-FAP共免疫组肿瘤生长没有明显缓慢。 [00对 1.4.1.2细胞免疫一细胞毒性T淋己细胞(CTU活性，刺激脾细胞产生I FN-丫的能 力
[0096] 我们通过体外检测CTL和化ISP0T来评价疫苗产生抗肿瘤细胞免疫水平。体外CTL 杀伤检测：用FAPa特异性抗原肤混合物标记的P815细胞作为祀细胞，被免疫小鼠中分离的 脾细胞作为效应细胞，按照效祀比50:1混合上述脾细胞和祀细胞，共解育一段时间后流式 检测祀细胞被杀伤的比例。结果如图23所示;ELISP0T检测疫苗组脾细胞与FAP蛋白解育刺 激后产生IFN-丫的水平，结果Prime-boost组相对于PBS虽然展现了一定特异性的CTL杀伤 作用和刺激T细胞分泌IFN- 丫能力（图24)，但是相对于DNA疫苗组，Prime-boost组的杀伤能 力和IFN-丫分泌能力没有得到显著的提高。
[0097] 1.4.2治疗性FAP疫苗的抑瘤效果
[0098] 因为前期的工作基础可W确定预防性疫苗的抗肿瘤效果，而治疗性疫苗的意义通 常要高于预防性疫苗，所W运次我们直接把Ba化/C小鼠随机分为7组检测疫苗治疗4T1的能 力，其治疗效果在之前是评价过的，第0天于小鼠右后背部皮下接种2Xl〇4 4T1细胞，攻瘤 后第2,9,16天按照下表的顺序进行免疫，每次疫苗免疫前一天每只小鼠腹腔注射Img环憐 酷胺(CY)。肿瘤接种后第25天，处死全部实验小鼠，剥瘤称取瘤重，取脾处理计数检测疫苗 在荷瘤小鼠体内产生的免疫反应。实验设计如下：
[0099] Table 6治疗性疫苗免疫程序
[0100]
[0101] 1.4.2.1肿瘤生长的抑制作用
[0102] 图25和26为治疗实验各组肿瘤体积变化情况。因为组数稍多，肿瘤生长曲线放在 一起比较乱，所W分为两组展示，结果显示相对于CpVR-FAP、CpVR-FAP/MVA-FAP组，CpVR- FAP/CY组、CpVR-FAP/MVA-FAP/CY组均能更明显抑制肿瘤的生长(p<0.01; !)<0.001); CpVR- FAP/MVA-FAP/CY与CpVR-FAP/CY二组相比较，肿瘤生长速度也有所减慢，并且具有统计学意 义(p<0.05)，CY与FAP疫苗联合应用能起到协同和累加的效果。
[0103] 从上述治疗性和预防性实验结果可W看出，CpVR-FAP，W及CpVR-FAP prime-Ad- FAP/MVA-FAP boost策略能明显抑制4T1模型小鼠肿瘤的生长，但DNA疫苗和prime-boost策 略之间没有显著性差异，CpVR-FAP，CpVR-FAP/Ad-FAP，CpVR-FAP/MVA-FAP疫苗与环憐酷胺 联合应用不但能显著抑制模型小鼠肿瘤的生长而且相对与单独疫苗组具有协同作用。因 此，我们认为环憐酷胺与FAP疫苗联合应用与二者单独应用相比对模型鼠肿瘤的保护力和 抗肿瘤能力有明显提高。
【主权项】
1. 一种序列为SEQ ID NO: 1的DNA片段FAPa片段在制备用于进行抗肿瘤免疫的蛋白疫 苗、DNA疫苗、病毒载体疫苗或树突状细胞疫苗中的用途。2. -种重组质粒Cp VR-FAP，其特征在于所述重组质粒骨架载体为如图1的CpVR，在所述 CpVR的多克隆位点中插入一种序列为SEQ ID NO: 1的DNA片段FAPa片段;优选地，其中所述 插入的多克隆位点为Bglll/BamHI。3. -种重组腺病毒Ad-FAP，其特征在于在腺病毒中插入一种序列为SEQ ID NO: 1的DNA 片段FAPa片段;优选地，其中所述腺病毒载体构架为pBHGlox Δ El，3Cre;更优选地，其中所 述插入的多克隆位点为Bglll/Sall。4. 一种重组改良安卡拉痘病毒MVA-FAP，其特征在于在所述重组改良安卡拉痘病毒中 插入权利要求1中所述的FAPa序列;优选地，其中所述痘病毒载体构架为改良安卡拉痘苗病 毒MVA;更优选地，其中所述插入的多克隆位点为Sa11/KpnI。5. -种疫苗组合物，包括权利要求2中的重组质粒Cp VR-FAP;优选地，还包括权利要求3 中的重组腺病毒Ad-FAP或/和权利要求4中的重组痘病毒MVA-FAP;更优选地，采用Cp VR-FAP 初免，Ad-FAP或/和MVA-FAP加强的免疫策略。6. 权利要求2所述的重组质粒，权利要求3所述的重组腺病毒，权利要求4所述的重组痘 病毒和权利要求5所述的疫苗组合物在制备用于治疗肿瘤的疫苗中的用途;优选地，其中所 述的疫苗还包括化疗药物;更优选地，其中所述化疗药物选自环磷酰胺、异环磷酰胺、甘磷 酰芥、尼莫司汀、紫杉醇、顺铂和奥沙利铂。
【文档编号】C12N15/85GK105879060SQ201610363126
【公开日】2016年8月24日
【申请日】2016年5月27日
【发明人】张海红, 于湘晖, 孔维, 夏秋, 耿飞
【申请人】吉林大学