一种近红外激光触发的复合纳米制剂的制备方法
【专利说明】
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技术领域： 本发明涉及医药领域，特别是一种近红外激光触发的复合纳米制剂的制备方法。
[0002]
【背景技术】： C6tl，具有独特大小（直径约为0. 71 nm)与中空球形32面体结构，其外表面分布着30 个π电子组成的大π键，易于修饰，含有π电子的分子可通过π电子堆积吸附在C6tl表 面。C6tl上连接一种造影剂后，表面仍存在π电子，对含π电子的化合物依然具有较强作 用力。利用这种特性，可以构建一种近红外激光触发的复合纳米制剂。同时，C 6tl在可见光 照射下产生氧自由基、切割DNA的作用，表现出显著的细胞毒特性，且光毒性随照射时间和 C6tl浓度增加而增强，表明C6tl可作为光敏剂用于肿瘤治疗。
[0003] 上转换纳米颗粒（UCNPs)是一类利用近红外光（通常为980nm)激发、短波长发 射的荧光材料，能克服有机染料光学稳定性差，半导体量子点易引发较强背景荧光的缺点 而备受关注，将其应用在生物标记领域时，具有窄带发射，较大的反斯托克斯位移，较深的 组织穿透深度和空间分辨率，对组织的损伤较小且不会产生自发荧光等优点，核壳式上转 换荧光材料的荧光灵敏度更高。
[0004] 超顺磁性氧化铁纳米颗粒作为一种新型磁共振T2场成像对比剂，可用于选择性 增强网状内皮系统的磁共振成像，对肿瘤病变的成像效果好，能提高图像的清晰度，安全性 高，在癌症的早期诊断中具有重要意义。IOOnm以下的磁性材料进入体内后可选择性浓集 于靶器官并滞留一段时间，使成像组织的弛豫速率比背景部位改变更大，提高磁共振成像 (MRI)诊断的效果。在C 6tl表面通过化学修饰，连接上转换纳米荧光剂和超顺磁性氧化铁纳 米粒，并荷载化疗药物DTX，可构建具有磁靶向性的光/磁双模态成像诊断治疗药物。
[0005] 聚合物胶束的临界胶束浓度低，解离速度慢，能实现体内长循环，同时可包载难溶 性药物并具有较高的载药量，常作为药物控释、靶向给药系统的载体使用。近年来，光敏胶 束因其能在光照条件下，可控制药物的释放，提高治疗效果而被视为一种具有应用前景的 新型药物转运系统，在医药领域得到越来越广泛的重视。然而，紫外光照射对组织的损伤， 限制了光敏胶束在制剂中的应用，而C 6tl虽可在可见光照射下产生活性氧，从而杀死肿瘤细 胞，但因可见光的穿透性差而使其应用受限。
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【发明内容】
： 针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明的目的就是提供一种近红外激光触发 的复合纳米制剂的制备方法，利用近红外980nm激光照射该纳米制剂，借助其中上转换纳 米粒的发射光触发光敏胶束释放药物，达到诊断治疗的目的，解决可见光穿透能力差，诊断 治疗二次服药的问题； 本发明解决的技术方案是采用近红外光980nm激光照射深层组织，使C6tl产生活性氧， 避免紫外光照射引起胶束破膜释药对组织造成的损伤，对肿瘤的治疗更加精准，安全，有 效。据此本发明解决的技术方案，包括以下步骤： (1)将C6tl进行磁性修饰，形成C ^rFe3O4，所述的四氧化三铁和C6tl的重量比为（1-10 ): 1， 方法是：将50mg C6tl溶于50ml甲苯，加0. 5g氢化钠，超声溶解，加入0. 1-0. 5ml溴代丙二酸 二乙酯，15-25°〇在队保护下搅拌5h，过滤除去氢化钠，旋蒸除去甲苯，真空干燥12h，得C6tl 丙二酸酯衍生物，将C6tl丙二酸酯衍生物溶于30ml甲苯中，加入380mg氢化钠，80 °C在N 2保 护下油浴反应l〇h(即甲苯相无色);除去甲苯，加20ml浓盐酸过滤，得滤饼，将滤饼溶于50ml 甲醇中，过滤除去甲醇不溶物，旋蒸除去甲醇，50°C真空干燥得丙二酸取代的C6tl-COOH; 将C6(l-C00H50mg溶解于IOml由乙二醇和二缩醇体积比1:19构成的混合溶剂中，加入 醋酸钠0. 75g，三价铁0. 27g，超声溶解，然后将所得溶液，200°C反应10h，冷至室温，反应产 物依次用无水乙醇洗涤3次，水洗3次，真空干燥，得四氧化三铁负载的C 6tl (C6tl-Fe3O4)(可 直接采用专利申请号为201310138295. 4的"一种磁性水溶性富勒烯及其制备方法和应用" 中的方法对C6tl进行磁性修饰，形成C 6(l-Fe304)，所述的三价铁为氯化铁、溴化铁、高氯酸铁、 硝酸铁、硫酸铁、硫化铁、磷酸铁中的任意一种； (2) 氨基化核壳式上转换荧光材料（UCNPs-NH2)的合成：将0. 10-0. 50g的基质材料 A，0. 05-0.1 Og的敏化剂B和0. 02-0.1 Og的激活剂C置于50ml三口烧瓶中，加5-10ml油 酸，5-15ml十八碳烯，先升温到160°C，保持30分钟，待其降至室温后，将含有0.1 OgNaOH, 0. 15g氟化物的甲醇溶液加入上述溶液中，20-50°C反应30分钟，除去甲醇，200-320°C反应 l-5h，冷至室温后，加丙酮20ml，12000r/min离心10分钟，沉淀用无水乙醇洗3次，最后沉 淀重新分散于正己烷中，即得NaAF 4: Ln3+上转换材料，以其为内核，按上述制备NaAF 4: Ln3+ 方法再合成外层上转换材料，得核壳式上转换荧光材料；所述的基质材料A，为稀土氯化物 YCl3 · 6H20, GdCl3 · 6H20或稀土氧化物Y203, Gd2O3的一种；所述的敏化剂B，为稀土氯化物 YbCl3 · 6H20或稀土氧化物Yb2O3的一种；所述的激活剂C，为ErCl 3 · 6H20或TmCl3 · 6H20的 一种；所述的氟化物，为NH4F、NaF、CaF^ MgF 2的一种； 将0.02g核壳式上转换荧光材料，溶于70ml乙醇中，超声溶解，35°C水浴，加体积浓度 为15%的NH3 ·Η20 IOml搅拌10分钟，加正硅酸乙酯40 μ 1，搅拌2h，然后加3-氨丙基三乙 氧基硅烷0. 2ml，搅拌4h，12000r/min离心，用无水乙醇和水分别洗3次，沉淀真空干燥，即 得氨基化核壳式上转换荧光材料（UCNP s-NH2); (3) C6tl上负载光/磁成像对比剂：按重量比C 6(l-Fe304:UCNPS-NH2=lg : (1-10) g，溶于 IOml水中，加入1-(3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC)0.0 10g，N-羟基琥珀 酰亚胺（NHS) 0.0 lg，室温反应8-24h，收集反应产物，干燥，得C6tl上负载光/磁成像对比剂 (C60/Fe 304-UCNPs)； (4) 光敏壳聚糖胶束的合成：Ig壳聚糖溶于100mL醋酸-甲醇溶液中，醋酸与甲醇的体 积比为1:1，然后加入质量浓度为15%的丁二酸酐丙酮溶液20ml，搅拌8-48h，用质量浓度 5%的NaOH溶液调pH至10,过滤，滤液用无水乙醇重结晶，离心，沉淀真空干燥，得N-琥珀 酰壳聚糖； 称取Ig邻硝基苯甲醇和〇. 8g 丁二酸酐溶于IOml吡啶中，50°C水浴反应24h，将反应 产物用乙酸乙酯萃取(得酯层)，酯层依次用水、饱和碳酸氢钠溶液洗涤，然后弃去乙酸乙酯 层(得水层)，水层加入体积浓度为10%的盐酸溶液，调节pH=5,得沉淀，沉淀物真空干燥，得 N-琥珀酰邻硝基苯甲醇； 称取0. 2g N-琥珀酰邻硝基苯甲醇，加 EDC和NHS，三者重量比为5:2:1，以二甲基甲酰 胺为溶剂溶解，室温反应24h，成反应混合溶液，然后取0. SgN-琥珀酰壳聚糖溶解于20ml超 纯水，逐滴加入上述溶液中，避光反应24h，反应产物用分子量为8000-12000的透析袋透析 3天，冷冻干燥，得光敏壳聚糖胶束（SNSC); (5)制备近红外激光触发的复合纳米制剂：取0. 05gC6(l/Fe304-UCNPS，0.0 lg多西他赛溶 于IOml超纯水中，超声2h，然后加入0. 05gSNSC，室温搅拌12h，离心，得沉淀，沉淀用pH值 为 7. 2-7. 4 的 PBS 复溶，得复合纳米制剂（SNSC@C6(l/Fe304-UCNPs/DTX)。
[0007] 本发明制备的SNSC@C6Q/Fe304-UCNPs/DTX复合纳米制剂可在近红外光980nm照射 下，定时定位释药，同时能使C 6tl在较深的组织内产生活性氧，协同化疗杀死肿瘤细胞，结合 荧光成像和磁共振成像，实现诊断治疗一体化，避免二次服药的问题，原料来源丰富，成本 低，使用效果好，有巨大的经济和社会效益。
[0008]
【具体实施方式】： 以下结合实施例对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。
[0009] 本发明在具体实施中可由以下实施例给出： 实施例1 本发明在具体实施中，所述的一种近红外激光触发的复合纳米制剂的制备方法，由以 下步骤实现： (1) 将C60进行磁性修饰，形成C60-Fe3O4,方法如下：50mg C60溶于50ml甲苯，加0· 5g氢 化钠，超声使其完全溶解，加入〇. Iml溴代丙二酸二乙酯，15°C N2保护下，搅拌5h，过滤除 去氢化钠，旋蒸除去甲苯，真空干燥12h，得C6tl丙二酸酯衍生物；将C 6(|丙二酸酯衍生物溶 于30ml甲苯中，加入380mg氢化钠，80°C，N2保护下，油浴反应IOh ;除去甲苯，加20ml浓盐 酸，过滤，得滤饼，将滤饼溶于50ml甲醇中，过滤除去甲醇不溶物，旋蒸除去甲醇，50°C真空 干燥得丙二酸取代的C 6tl-COOH ; 称取C6(l-C00H50mg溶解于IOmL由乙二醇和二缩醇组成的混合溶剂中，乙二醇和二缩醇 的体积比为1:19,加入醋酸钠0. 75g，三氯化铁0. 27g，超声溶解，然后将所得溶液转移至反 应釜中，200°C反应10h，冷至室温，反应产物分别用无水乙醇洗绦3次，水洗3次，真空干燥， 得负载四氧化三铁的C 6Q (C6tl-Fe3O4); (2) 氨基化核壳式上转换荧光材料（UCNPs-NH2)的合成：将0.1 Og的YCl3 · 6H20,0. 05g 的YbCl3 · 6H20和0· 07g的ErCl3 · 6H20置于50ml三口烧瓶中，加5ml油酸，5ml十八碳 烯，先升温到160°C，保持30分钟，降至室温，得混合溶液，将含有0. 10gNa0H，0. 15gNH4F的 甲醇溶液加混合溶液中，在20°C反应30分钟，除去甲醇，200°C反应lh，冷至室温，加丙酮 20ml，12000r/min离心10分钟，得沉淀，沉淀用无水乙醇洗3次，再重新分散于正己烷中，得 NaYF4: Yb, Er上转换材料；以NaYF4: Yb, Er上转换材料为内核，按上述制备NaYF4: Yb, Er方法 再合成外层上转换材料，得核壳式上转换荧光材料； 称取0.02g上述核壳式上转换荧光材料，溶于70ml乙醇中，超声使其完全溶解，置于 35°C水浴中，加体积浓度为15%的NH3 · H2O IOml搅拌10分钟，加正硅酸乙酯40 μ 1，搅拌 2h，然后加3-氨丙基三乙氧基硅烷0. 2ml，搅拌4h，12000r/min离心，用无水乙醇和水分别 洗3次，沉淀真空干燥，即得氨基化核壳式上转换荧光材料； (3) C6tl上负载光/磁成像对比剂：将IgC 6Q-Fe304和IgUCNPs-NH2，溶于IOml水中，取 EDC0.0 10g，NHSO. Olg，室温反应 8h，磁铁收集产物，干燥，得 C6tZFe3O4-UCNPs ; (4) 光敏壳聚糖胶束的合成：Ig壳聚糖溶于100mL醋酸-甲醇溶液中，醋酸与甲醇的体 积比为1: 1，然后滴加质量浓度15%的丁二酸酐丙酮溶液20ml，搅拌8h，用质量浓度5%Na0H 溶液调pH至10,过滤，滤液用无水乙醇重结晶，离心，得沉淀，沉淀真空干燥，得N-琥珀酰壳 聚糖； 称取Ig邻硝基苯甲醇和〇. 8g 丁二酸酐溶于IOml吡啶中，50°C水浴反应24h，将产物 用乙酸乙酯萃取，酯层依次用水、饱和碳酸氢钠溶液洗涤，然后弃去乙酸乙酯层，水层加入 体积浓度为10%盐酸溶液，调节pH=5,沉淀真空干燥，得N-琥珀酰邻硝基苯甲醇； 称取0. 2g N-琥珀酰邻硝基苯甲醇和EDC、NHS混合在一起，三者重量比为5:2:1，用二 甲基甲酰胺溶解，室温反应24h，然后取0. 8gN-琥珀酰壳聚糖溶解于20ml超纯水，逐滴加 入上述溶液中，避光反应24h，反应产物用分子量为8000-12000的透析袋透析3天，冷冻干 燥，得光敏壳聚糖胶束（SNSC); (5)近红外激光触发的复合纳米制剂的制备：取0. 05gC6(l/Fe304-UCNPs，0.0 lg多西他 赛溶于IOml超纯水中，超声2h，然后加入0.05gSNSC，室温搅拌12h，离心，沉淀用pH为 7. 2-7. 4 的 PBS 复溶，得 SNSC@C6Q/Fe304-UCNPs/DTX 复合纳米制剂。
[0010] 实施例2 本发明在具体实施中，所述的一种近红外激光触发的复合纳米诊疗剂的制备方法，由 以下步骤实现： (1) 将C6tl进行磁性修饰，形成C J5tl-Fe3O4，方法是：50mg C6tl溶于50ml甲苯，加0. 5g氢 化钠，超声溶解，加入〇. 2ml溴代丙二酸二乙酯，201在N2保护下搅拌5h，过滤除氢化钠，旋 蒸除甲苯，真空干燥12h，得C 6tl丙二酸酯衍生物；将衍生物C6tl丙二酸酯衍生物溶于30ml甲 苯，加入380mg氢化钠，80°C在队保护下油浴反应IOh ;除去甲苯，加20ml浓盐酸过滤，得