一种联合输送核酸与多肽的纳米制剂及制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及的是一种药物技术领域的药物输送方法，具体地，涉及一种联合输送 核酸与多肽的纳米制剂及制备方法，特别是一种可用于两种或两种以上生物大分子药物的 联合治疗疾病的生物药物制剂。
【背景技术】
[0002] 癌症是人类面临的难以治愈的重大疾病之一，目前采用的化疗、放疗和外科手术 的方法存在毒性大、缺乏靶向性、对正常组织与细胞伤害大，和以及切除不干净等弊端，并 且开发新的小分子药物周期长花费大。而生物大分子药物（如多肽、核酸与蛋白质）具有 特定的治疗靶点、毒性小。特别是核酸与多肽药物结构明确、制备时间短。但生物大分子 药物大多在体内易被降解难以到达治疗位点，因此需要有合适的载体输送其到达特定的病 变细胞内的治疗位点。近年来，随着生物大分子药物的治病机理的逐渐明确，核酸、多肽以 及蛋白药物成为研究的新的亮点。目前，核酸药物的载体报道的非常多，如文献[Yin，H等 人，用于基因治疗的非病毒载体，自然评论遗传学，2014, 15, 541-55]中的记载。但多肽药 物的载体研究较少，事实上，多肽药物分子量较小，靶点明确，在阻断或调控病变基因方面 发挥着重要的作用，参见文献[Ellerby，H.M等人，靶向促凋亡肽的抗肿瘤活性，自然医学， 1999, 5, 1032-8]中的记载。
[0003] 如果我们能够设计出同时有效输送多肽与核酸的载体，那将为生物大分子的输送 治疗做出突破性工作。本发明利用对人体安全的生物医用材料，构建出同时输送核酸药物 与多肽药物的生物响应性载体。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于克服现有多肽与核酸输送技术中的不足，提供一种联合输送核 酸与多肽的纳米制剂及制备方法，所述纳米制剂可以同时革G向输送多肽药物与核酸药物。
[0005] 本发明涉及用核酸、阳离子多肽（如表1)、阳离子脂质体组装的三元纳米颗粒，以 及在此基础上包裹透明质酸的四元纳米颗粒。
[0006] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0007] 第一方面，本发明提供一种联合输送核酸与多肽的纳米制剂的制备方法，包括以 下步骤：
[0008] A、将多肽与阳离子脂质体混合；
[0009] B、将步骤A的混合液加入到核酸药物中孵育制备得到三元纳米颗粒；所述三元纳 米颗粒为表面带正电荷的纳米颗粒；
[0010] C、向所述三元纳米颗粒中加入透明质酸钠水溶液，混合均匀，放置得四元纳米颗 粒，即所述纳米制齐1J。所述四元纳米颗粒为表面带负电荷的可以革G向到肿瘤细胞的纳米颗 粒。
[0011] 优选地，步骤A中，所述阳离子脂质体通过以下步骤制得：将质量比为0. 5~2:1 的阳离子脂质与中性脂质的氯仿溶液，旋转蒸发掉溶剂，然后水合过夜，超声30-60分钟。
[0012] 优选地，所述阳离子脂质为2, 3-二油酰基-丙基-三甲胺、2, 3-二油酰氧丙 基-1-溴化三甲胺，或其它合成的两亲性阳离子脂质；所述中性脂质为二油酰磷脂酰乙醇 胺或其它合成的两亲性具有融膜作用的中性脂质。
[0013] 优选地，步骤A中，所述多肽包括通过步骤Al制备得到的其中一种或多种多肽和 通过步骤A2制备得到的其中一种或多种多肽的混合物：
[0014] AU将多肽药物与阳离子多肽通过可降解键连接起来获得；
[0015] A2、先将靶向多肽或肿瘤细胞穿透肽与阳离子多肽通过不同的间隔肽序列来制备 多功能多肽。
[0016] 优选地，所述多肽包括如SEQ ID No. 1、SEQ ID No. 2或SEQ ID No. 3中的一种或 多种的组合，其氨基酸序列如表1所示。
[0017] 表 1
[0019] 所述Pa与Pb的制备为利用可降解的键将作为多肽药物的GGWYRQV序列与聚精氨 酸（Rll)通过不同的序列端连接起来即构建得到两个可以不断降解释放多肽药物GGWYRQV 的多肽Pa与Pb。
[0020] 优选地，所述多肽为Pl与Pa或Pb按质量比为1: (0~4)的组合。
[0021] 优选地，所述阳离子脂质体、多肽和核酸药物的质量比为（0. 5~2) : (2~7) : 1进 行混合。
[0022] 优选地，步骤A中，所述核酸药物是指DNA，siRNA，shRNA，以及microRNA。
[0023] 优选地，步骤A中，所述孵育为常温下孵育25-35分钟。
[0024] 第二方面，本发明还提供一种通过所述的制备方法制备得到的纳米制剂。
[0025] 本发明可用于生物大分子核酸与多肽联合输送的纳米制剂是通过模块化组装而 成，各组分之间没有通过化学共价键连接。模块化组装，是指各组分之间通过静电作用、疏 水作用以及氢键等非共价键组装形成的纳米颗粒。
[0026] 第三方面，本发明还提供一种联合输送核酸与多肽的纳米制剂在治疗疾病中的用 途。
[0027] 本发明针对生物大分子核酸与多肽药物在体内易降解和难以到达靶细胞的缺点， 采用对人体安全的多功能阳离子多肽和阳离子脂质体/核酸非病毒载体同时包裹多肽药 物与核酸药物形成纳米颗粒，制备出可以利用多肽与核酸联合治疗疾病的生物大分子药物 载体。该载体的特点是利用模块组装的原理，将阳离子脂质、含有特定细胞靶向肽或细胞穿 透肽的多功能阳离子多肽与多肽药物进行混合，然后通过静电作用与核酸药物组装成表面 带正电的纳米颗粒，并进一步通过静电作用和氢键覆盖透明质酸进一步形成表面带负电荷 的纳米靶向颗粒。其优势是同时装载多肽药物与核酸药物，通过多肽药物与聚精氨酸之间 可降解的键的断裂来实现多肽药物的不断释放，通过载体的解组装实现核酸的有效释放。
[0028] 本发明方法与现有的Iipopolyplexes相比，不仅避免了聚阳离子的毒性（多肽是 人体内源性分子），而且有效突破了通过PEG化实现体内长效循环的弊端。兼顾到达靶细胞 之前的稳定性和进入靶细胞之后的生物响应性。
[0029] 与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
[0030] 本发明利用阳离子多肽与阳离子脂质体联合包裹核酸与多肽药物，然后在该纳米 体系的外表面紧密包裹透明质酸，形成表面带负电荷的纳米颗粒，该纳米颗粒可以特定靶 向肿瘤细胞，通过细胞穿透或者受体介导的方式进入内涵体，外面的透明质酸与多肽在内 涵体内降解，暴露出的脂质通过融膜作用进入细胞质。然后解组装释放出核酸药物和多肽 药物。由于多肽分布在整个纳米颗粒内部，所以在进入细胞后通过调节多肽药物与聚精氨 酸的连接键的降解速度来控制多肽药物的释放位点。
【附图说明】
[0031] 通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、 目的和优点将会变得更明显：
[0032] 图1为四元纳米颗粒的示意图；
[0033] 图2为四元纳米颗粒的凝胶电泳图；
[0034] 图3为四元纳米颗粒HLPD的Zeta电位图；
[0035] 图4为四元纳米颗粒HLPD的粒径图；
[0036] 图5为四元纳米颗粒HLH)被肝癌细胞H印G2内吞图；
[0037] 图6为四元纳米颗粒HLPD的肝癌细胞H印G2细胞萤光素酶转染活性图；
[0038] 图7为四元纳米颗粒HLPD的肝癌细胞HepG2细胞的毒性图；
[0039] 其中，H代表透明质酸；L代表阳离子脂质体；D代表DNA。
【具体实施方式】
[0040] 下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术 人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明 的保护范围。
[0041] 本发明对包裹生物大分子核酸药物的四元纳米颗粒的物化性质表征方法包括：凝 胶电泳、动态光散射和Zeta电位；初步的转染活性与毒性实验的DNA质粒是荧光素酶PGL3 质粒；细胞是肝癌细胞ifepG2。
[0042] 本发明实施例涉及一种多肽与核酸共同输送的纳米颗粒的制备方法，包括如下步 骤：
[0043] a、通过薄膜分散法制备阳离子脂质体：本实验采用阳离子脂质（2, 3-二油氧基丙 基）三甲基氯化铵（DOTAP)与中性脂质1，2-二油酰-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺（DOPE)的 质量比为1 :1的氯仿溶液旋转蒸发掉溶剂，然后水合过夜，超声30-60分钟。
[0044] b、利用可降解的键将作为多肽药物的GGWYRQV序列与聚精氨酸（Rll)通过不同的 序列端连接起来构建Pa与Pb两个可以不断降解释放多肽药物GGWYRQV的多肽。
[0045] c、纳米制剂的制备：利用上述制备好的脂质体稀释到一定浓度（0. 04mg/mL)，与 一定浓度的多肽（〇. 16mg/mL)按质量比为1:4进行混合，其中多肽组分为PUPa或Pb中的 一种或多种的组合。再加入到核酸溶液中制备表面带正电荷的纳米颗粒，所述阳离子脂质 体、多肽和核酸的质量比为1:4:1，在常温下孵育25-35分钟制备三元纳米颗粒。然后对应 加入适量的透明质酸钠水溶液，并混合均匀，放置15分钟制备四元纳米颗粒。
[0046] 实施例1四元纳米颗粒的制备方法
[0047] 如图1所示，四元纳米颗粒的用于测物化性质的体系在水溶液中进行。将一定量 的阳离子脂质体与多肽混合后加入到核酸水溶液中继续混合均匀。在室温下孵育30分钟 制得三元纳米颗粒，然后将透明质酸加入该混合物中并充分混合均匀，静置15分钟制得四 元纳米颗粒。用于细胞实验的载体体系用无血清培养基代替超纯水即可。