类弹性蛋白多肽制备的软组织分离制剂及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及类弹性蛋白多肽制备的软组织分离制剂及应用，属于类弹性蛋白多肽的医药配置品及用途。
技术背景
[0002]在消化道内窥镜治疗中，内窥镜下黏膜切除术(EMR)及内窥镜黏膜下剥离术(ESD)是目前广泛应用于切除消化道癌前病变与消化道早期肿瘤的标准微创治疗手段。它们不仅可以使患者避免外科开腹手术的痛苦，还可以进行剥离后组织回收，进行病理学诊断，指导术后复查及进一步治疗，因此逐渐成为治疗治疗早期消化道肿瘤的首选方法。尽管这种内镜下治疗具有方法简便、创伤性小，疗效可靠的优势，但是其操作技术难度高，存在着相当比例的穿孔、出血等并发症，因而要求操作者具有更加熟练的操作技术，限制了其临床应用的发展和提尚。
[0003]在内镜治疗操作中，有效的黏膜下软组织分离制剂注射，可使使黏膜下层与固有肌层分离，有效的分离病变组织与正常组织，以便于操作，预防和减少并发症，已成为提高内镜下黏膜切除治疗安全性的有效措施。但是，传统的软组织分离制剂如生理盐水等，在注射后的维持时间短、重复注射率高，不能有效地减少内镜治疗并发症的发生率，大大降低了内镜治疗的安全性。因此非常有必要寻找新型理想的软组织分离制剂以提高内镜下黏膜切除治疗的高效性和安全性。
[0004]类弹性蛋白多肽(Elastin-like polypeptides, ELPs)是一种用基因工程方法获得的蛋白质聚合物，其结构主要由五肽重复序列(Val-Pro-Gly-Xaa-Gly，即缬氨酸-脯氨酸-甘氨酸-X氨基酸-甘氨酸)构成，来源于弹性蛋白的疏水区域，其中Xaa可以是除脯氨酸以外任一氨基酸。它具有一定的热敏性，当环境温度低于类弹性蛋白多肽的转相温度时，类弹性蛋白多肽呈液体状态；而当环境温度高于转相温度时，类弹性蛋白多肽聚集呈凝胶状。由于类弹性蛋白多肽具有这种特殊性质，加之有良好的组织相容性、非免疫原性，这为其在生物医学材料方面的研宄和利用提供了依据。
[0005]目前，类弹性蛋白多肽多在组织工程上应用。其水凝胶体已成功应用于软骨、椎骨的组织修复、血管的移植、膀胱干细胞基体神经引导干细胞薄片及手术后的伤口愈合。另外，其在靶向肿瘤和构造药物载体微粒方面也取得了一定的研宄进展。
【发明内容】
[0006]本发明就是为了解决现有技术中，传统的软组织分离制剂在注射后的维持时间短、重复注射率高，不能有效地减少内镜治疗并发症的发生率，提高内镜治疗的安全性等问题，而提供一种以类弹性蛋白多肽制备的软组织分离制剂及应用。
[0007]本发明是按照以下技术方案实现的。
[0008]一种类弹性蛋白多肽制备的软组织分离制剂，将类弹性蛋白多肽风干絮状固体物质溶于磷酸盐缓冲液制成的终浓度为500uM-1000uM的液体制剂，尤其是浓度为500 uM。
[0009]类弹性蛋白多肽分子量为50kD，纯度为大于99%。
[0010]本发明所述的类弹性蛋白多肽制备的软组织分离制剂具有温敏特性，当温度超过其相变温度37°C时，其可由液态转化为凝胶状态。
[0011]本发明所述的类弹性蛋白多肽制备的软组织分离制剂的使用量为单次注射5-lOmlο
[0012]一种类弹性蛋白多肽制备的软组织分离制剂的应用，其是将类弹性蛋白多肽制备的软组织分离制剂填充于胃肠道黏膜下层，类弹性蛋白多肽相变为凝胶状，使胃肠黏膜与固有肌层充分分离。
[0013]使用时，利用消化内镜进镜，到达操作部位，在内镜下通过注射针，于黏膜下层注射类弹性蛋白多肽制备的软组织分离制剂，待黏膜与固有肌层充分分离，进行病变黏膜剥离切除。
[0014]本发明的有益效果是:在内镜治疗操作中，应用类弹性蛋白多肽制备的软组织分离制剂注射于胃肠道黏膜下层，使黏膜与固有肌层充分的分离，以利于完全切除病变组织。该软组织分离制剂在体温下，由注射时的液相流动状态变相为类凝胶状态，使注射后的软组织分离距离显著增加，且保留时间延长，而不需多次注射，为手术提供良好视野和操作空间，从而提高成功率和减少手术时间，大大减低了内镜治疗并发症如穿孔、出血的发生；该软组织分离制剂具有良好的生物相容性，无毒副作用；其可降解特性更消除了异物残留的担忧。由于本发明适用于消化内镜下治疗中的软组织分离，以便切除病变组织，使操作更安全有效。
【附图说明】
[0015]图1是不同黏膜下注射剂对SD大鼠胃黏膜厚度随时间变化的影响；
图2是每一时间点各组间黏膜厚度变化的对比图；
图3是30min时不同注射液维持黏膜厚度的组织学表现；
图4是黏膜切除后20min出血量对比图；
图5是注射ELPs内镜下黏膜剥离术标记图；
图6是黏膜下注射ELP后黏膜的隆起；
图7黏膜剥离边缘图；
图8是黏膜切除图；
图9是黏膜剥离形成的人工溃疡图；
图10是黏膜剥尚术后人工溃疡2周图；
图11是黏膜剥尚术后人工溃疡4周图；
图12是黏膜剥尚术后溃疡愈合图。
【具体实施方式】
[0016]下面结合附图及实施例对本发明进行详细的说明。
[0017]本发明所述的类弹性蛋白多肽为ELP120_Tyr7，含有7个酪氨酸，其分子量为50KDa，纯度为大于99%，应用浓度为500 uM，相变温度为37°C (500uM)。
[0018]一.类弹性蛋白多肽的制备 1.类弹性蛋白多肽的制备方法:
①将表达类弹性蛋白多肽的载体转入到大肠杆菌表达菌株中；
②含有pET-22b-ELPS重组质粒的BL21工程菌按1: 100的接种量接种到含100Ug/mL氨苄青霉素的TB培养基中(每升TB培养基中含12 g蛋白胨，24 g酵母浸提物，2.31 g磷酸氢二钾，12.54 g磷酸二氢钾，4 mL甘油)，37°C下250 r/min培养24 h ；
③在4°C, 4 000 r/min离心15 min，收获菌体，用预冷的PBS缓冲液(137 mmol/LNaCl, 2.7 mmol/L KCl，4.2 mmol/L NaH2P04，1.4 mmol/LKH2P04,pH 为 7.3)重悬菌体，然后置冰浴中超声破碎(超声2s,间隔3s，共5min)；
④类弹性蛋白多肽s纯化采用可逆相变循环(Inversetransit1n cycling，ITC)，即在大肠杆菌破碎液，向其加入聚乙烯亚胺(终浓度为0.5%)以去除核酸；4 °C, 13 000r/min离心15min，取上清；向上清液中添加NaCl至终浓度为2 mol/L, 37 °C水浴15 min后，13 000 r/min，离心15 min去上清向沉淀中加入预冷的PBS溶解沉淀，冰浴15 min后，4°C、13 000 r/min，离心15 min ;向上清液中再添加NaCl至终浓度为2 mol/L，37°C水浴15 min后，13 000 r/min，离心15 min去上清；向沉淀中加入预冷的PBS溶解沉淀，冰浴15 min, 4 °C、13 000 r/min，离心15 min，收集上清液，以上过程为两轮ITC。
[0019]2.类弹性蛋白多肽纯度和分子量测定:聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测类弹性蛋白多肽纯度。应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALD1-MS)方法检测的类弹性蛋白多肽分子量。
[0020]3.类弹性蛋白多肽相变温度测定:测定类弹性蛋白多肽相变温度(A thermallyresponsive b1polymer for intra-articular drug delivery.Journal of ControlledRelease 2006，115:175 - 182)，即:测定10°C到95°C类弹性蛋白多肽s的PBS溶液，在波长为350 nm处，类弹性蛋白多肽溶液的浓度用温度控制的UV-Vis分光光度计测定，升温速率为1°C /min。相变温度定义为在0D350的最大值的一半所对应的温度。
[0021]4.类弹性蛋白多肽凝胶黏度测定:将试样倒入带恒温夹套的样品筒中.待恒温至所需温度(37°C)后，测定试样的黏度。每个实验数据均为3次以上测定结果的平均值。对不同条件下(不同氨基酸组成，温度，浓度，反应时间等的)类弹性蛋白多肽所形成的溶胶或凝胶，通过流变曲线将不同转子及转速下的测定值换算成同一转子和转速下的相当值，以便比较。用黏度评价不同条件下的类弹性蛋白多肽凝固和交联速度和稳固性，探讨最佳的氨基