[0048] 实施例2四元纳米颗粒的凝胶电泳
[0049] 称取0. 3g的琼脂糖粉末，倒入锥形瓶中，将30mllXTAE缓冲液加入至锥形瓶中， 在加热的条件下将其充分溶解，待温度降到65°C后，加入Gelred in warter 3 μ L，迅速倒 入制胶槽中，插入样品梳，在室温下放置〇. 5-lh等待胶变为凝固态。接着将样品梳拔出，再 将TAE缓冲液倒入样品槽中使其浸没凝胶。制备不同比例的四元纳米颗粒10yL，将6X上 样缓冲液2 μ L与四元纳米颗粒混勾，上样10 μ L，同时上样10 μ L naked PGL3质粒作为对 照。随后在IlOmV电压下电泳45min，关掉电泳，取出凝胶置于紫外凝胶成像系统观察并记 录电泳图像。结果如图1，条带从左向右依次为：
[0050] Maker，Naked DNA,样品（I)-(IO);其中，四元纳米颗粒样品的质量比分别为 H:L:P1:D = 15:l:4:l(l)、H:L:Pa:D = 15:l:4:l(2)、H:L:Pl:Pa:D = 15:1:1:3:1(3)、 H:L:Pl:Pa:D = 15:l:2:2:l(4)、H:L:Pl:Pa:D = 15:1:3:1:1(5)、H:L:P1:D = 15:l:4:l(6)、H:L:Pb:D = 15:l:4:l(7)、H:L:Pl:Pb:D = 15:l:l:3:l(8)、H:L:Pl:Pb:D = 15:1:2:2:1 (9)、H: L:Pl:Pb:D = 15:1:3:1:1 (10)。从电泳图中我们可以观察到复合物的位 置都停在起点，说明我们的载体完全包裹了 DNA，从而有效保护DNA，避免DNA在细胞吞噬前 被降解。
[0051] 实施例3四元纳米颗粒的Zeta申〖位
[0052] 四元纳米颗粒的粒径和电位使用粒度分析仪测定。采用zetasizer 2000测定四 元纳米颗粒的表面电荷，样品测定时间设置为自动，每个样品测定3次，取平均值作图。四 元纳米颗粒的ζ电位测定结果如图3所示。从图中可见这9个不同的四元纳米颗粒的ζ 电位比较稳定：HPLD带负电荷，其电荷的绝对值大于30mV，说明它们形成的分散体系也相 对稳定。
[0053] 实施例4四元纳米颗粒的粒径
[0054] 室温条件下，用Malvern Nano ZS激光粒度仪测定Q-complexes的水化半径，折射 介质设置为水，折射率为1. 33,粘度为0. 8872cP，每个样品测定3次，取平均值作图。制备 不同比例的四元纳米颗粒400 μ L。首先，在室温下预热粒度分析仪30min，在微量样品池中 加入四元纳米颗粒溶液，用超纯水稀释至500 μ L，将微量样品池插入粒度分析仪的测试槽 中，每个样品记录三次测试结果，观察并记录样品粒径的平均值，同时也要注意样品的分散 性（PDI)。从图4中可见这几个不同的四元纳米颗粒的粒径都比较稳定，基本上在150~ 200nm左右，其大小有利于细胞内吞。
[0055] 实施例5肝癌细朐HeoG2内吞实验
[0056] 在24孔板内种6X IO4个HepG2细胞，培养24小时后将四元纳米颗粒加入到细胞 中（lyg DNA/孔）利用异硫氰酸荧光素（FITC)标记多肽药物。将24孔板转移至细胞培 养箱中进行转染，转染时间为4h。待4h转染结束后，取出24孔板，进行流式细胞仪所需的 细胞处理。采用BD FACSCalibur流式细胞仪进行检测。未加样品组（untreated组）的样 品为基准调节流式分析的各项参数设置。因为本实验选用了异硫氰酸荧光素（FITC)共价 连接多肽药物的方法来检测多肽药物是否能够进入细胞内。由图5可见，随着多肽药物的 量的增加，相应地多肽药物被靶细胞内吞的数量在逐渐增加。
[0057] 实施例6肝癌细朐HeDG2的帝光素酶转染活件实验
[0058] 将培养好的细胞接种于96孔板中，每孔细胞数为2 X IO4个，将其置于细胞培养箱 中培养24h。加入不同的四元纳米颗粒：每孔加入的DNA的质量是250ng，每孔加入200 μ L 的四元纳米颗粒溶液，并平行3个复孔，稀释介质为10 %胎牛血清的DMEM/f 12培养基，并以 商业化转染试剂Lipofectamine 2000与DNA的复合物作为对照组。孵育24h后，取出96 孔板弃去培养液，每孔加入200 μ L的四元纳米颗粒溶液，置于细胞培养箱中培养24h。取 出96孔板，吸去培养液，每孔加入200 μ L I X PBS缓冲溶液冲洗一遍，吸去PBS，每孔加入 30 μ L裂解液，于4°C冰箱放置30min，置于-80°C放置过夜。
[0059] 检测瞬时发光强度：取出96孔板，从每个孔中吸出20 μ L裂解液至对应的流式管 中，打开照度计，预热20min，测试时每个流式管中加入20 μ L荧光素酶底物，快速吹打均 匀，检测其瞬时发光强度（RLU)。
[0060] 检测蛋白总量：采用Micro BCA测定法来确定裂解液中的蛋白总量。通过样品 的相对发光强度除以样品的总蛋白浓度后所得数（RLU/mg protein)来衡量细胞转染效率 (即荧光素酶蛋白的表达量），每个样品平行测3次，取平均值作图。
[0061] 由图6可以看出，加入Pl的四元纳米复合物与未加入Pl的组相比可以明显提高 细胞转染效率。
[0062] 实施例7肝癌细朐HepG2的细朐毒件实验
[0063] 米用 CCK_8Cell Proliferation and Cytotoxicity Assay Kit 考察包裹 DNA 的 纳米颗粒复合物对滑膜细胞的毒性。毒性实验开始前，先将细胞接种到96孔中，每孔的细 胞数为IX IO4个，接种24h后，取出96孔板弃去培养液，每孔给不同比例的200 μ L的复合 物溶液，每个样品平行3个复孔，置于细胞培养箱中培养24h后，向96孔板每孔细胞中加入 CCK-8试剂10 μ L，避光在细胞培养箱中培养2-4h，用多功能酶标仪测定样品在450nm处的 吸光度OD值。细胞存活率（百分比）是以待测样品的吸光度相比正常细胞的吸光度值来 表示。由图7可以看出，四元纳米颗粒的毒性大于不含透明质酸的三元纳米颗粒的毒性，由 此分析，四元纳米颗粒中具有抑制肿瘤细胞生长的多肽药物起到了抑制肿瘤生长的作用。
[0064] 以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述 特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影 响本发明的实质内容。
【主权项】
1. 一种联合输送核酸与多肽的纳米制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤： A、 将多肽与阳离子脂质体混合； B、 将步骤A的混合液加入到核酸药物中孵育制备得到三元纳米颗粒； C、 向所述三元纳米颗粒中加入透明质酸钠，混合得四元纳米颗粒，即所述纳米制剂。2. 根据权利要求1所述的联合输送核酸与多肽的纳米制剂的制备方法，其特征在于， 步骤A中，所述阳离子脂质体通过以下步骤制得：将质量比为0. 5~2:1的阳离子脂质与中 性脂质的氯仿溶液，旋转蒸发掉溶剂，然后水合过夜，超声30-60分钟。3. 根据权利要求2所述的联合输送核酸与多肽的纳米制剂的制备方法，其特征在于， 所述阳离子脂质为2, 3-二油酰基-丙基-三甲胺、2, 3-二油酰氧丙基-1-溴化三甲胺，或 其它合成的两亲性阳离子脂质；所述中性脂质为二油酰磷脂酰乙醇胺或其它合成的两亲性 具有融膜作用的中性脂质。4. 根据权利要求1所述的联合输送核酸与多肽的纳米制剂的制备方法，其特征在于， 步骤A中，所述多肽包括通过步骤A1制备得到的其中一种或多种多肽和通过步骤A2制备 得到的其中一种或多种多肽的混合物： A1、将多肽药物与阳离子多肽通过可降解键连接起来获得； A2、先将靶向多肽或肿瘤细胞穿透肽与阳离子多肽通过不同的间隔肽序列来制备多功 能多肽。5. 根据权利要求1所述的联合输送核酸与多肽的纳米制剂的制备方法，其特征在于， 所述阳离子脂质体、多肽和核酸药物的质量比为（〇. 5~2) : (2~7) : 1进行混合。6. 根据权利要求1所述的联合输送核酸与多肽的纳米制剂的制备方法，其特征在于， 步骤B中，所述核酸药物是指DNA，siRNA，shRNA，以及microRNA。7. 根据权利要求1所述的联合输送核酸与多肽的纳米制剂的制备方法，其特征在于， 步骤B中，所述孵育为常温下孵育25-35分钟。8. -种根据权利要求1所述的制备方法制备得到的纳米制剂。9. 一种根据权利要求8所述的联合输送核酸与多肽的纳米制剂在治疗疾病中的用途。
【专利摘要】本发明针对生物大分子核酸与多肽药物在体内易降解和难以到达靶细胞的缺点，提供了一种联合输送核酸与多肽的纳米制剂及制备方法。所述纳米制剂采用对人体安全的多功能阳离子多肽和阳离子脂质体/核酸非病毒载体同时包裹多肽药物与核酸药物形成纳米颗粒，制备出可以利用多肽与核酸联合治疗疾病的生物大分子药物载体。将阳离子脂质体与多肽进行混合，然后通过静电作用与核酸药物组装成表面带正电的纳米颗粒，并进一步通过静电作用和氢键覆盖透明质酸进一步形成表面带负电荷的纳米靶向颗粒。其优势是同时装载多肽药物与核酸药物，通过多肽药物与聚精氨酸之间可降解的键的断裂来实现多肽药物的不断释放，通过载体的解组装实现核酸的有效释放。
【IPC分类】A61K9/14, A61P35/00, A61K47/36, A61K31/7088, A61K47/48, A61K38/08
【公开号】CN105327358
【申请号】CN201510791797
【发明人】杜子秀, 徐宇虹, 梁瑶瑶
【申请人】上海交通大学
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2015年11月17日