聚阳离子核酸复合物纳米颗粒及制备方法、应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及治疗血管增生药物的【技术领域】，特别涉及一种治疗血管增生的聚阳离子核酸复合物及制备方法、应用。本发明的治疗血管增生的聚阳离子核酸复合物纳米颗粒，所述纳米颗粒包含聚阳离子核酸材料和基因物质，所述聚阳离子核酸材料与基因物质的质量比为1～100：1。治疗血管增生的聚阳离子核酸复合物纳米颗粒包含聚阳离子核酸材料和基因物质。与现有技术相比，本发明的纳米颗粒可有效抑制血管增生，可实现基因物质的输送，并且，不存在体内毒性和体内免疫原性的问题，由于纳米颗粒不带电荷，还可避免体内非靶组织的粘附，实现体内病变细胞靶向，从而有效提高靶向效果，且不影响体内病变细胞的内吞。
【专利说明】聚阳离子核酸复合物纳米颗粒及制备方法、应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及治疗血管增生药物的【技术领域】，特别涉及一种治疗血管增生的聚阳离 子核酸复合物及制备方法、应用。
【背景技术】
[0002] 新生血管可伴发于创伤修复、肿瘤生长、眼内缺血性病变等多种情况。新生血管 的生成是一个相当复杂的生物学过程，目前的大量研究表明，血管内皮生长因子（vascular endothelialgrowth factor, VEGF)及其家族成员能特异性地促进内皮细胞分裂、增殖及迁 移，在新生血管形成过程中起重要作用。
[0003] VEGF是一类糖蛋白，广泛分布于人和动物体内的脑、肾、肝、脾、肺、骨骼等组织。 人类成熟的 VEGF 以五种亚型存在-VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189、VEGF206,均 系通过不同的剪接方式来自同一基因。除VEGF外，VEGF家族主要还包括胎盘生长因子 (placenta growth factor，PlGF)、VEGF- B、VEGF- C、VEGF- D、VEGF- E，该些家族成员与 VEGF具有相似的结构、功能及分布。
[0004] 由于在新生血管生成中的重要作用，VEGF家族与新生血管生成相关性疾病及某些 生理过程关系密切。VEGF家族在肿瘤新生血管的生成中起重要作用。
[0005] 关于VEGF家族和眼内新生血管的研究表明，VEGF家族中VEGF在与缺氧有关的眼 内新生血管化过程中起关键作用。在眼内新生血管活动眼中（糖尿病视网膜病变、视网膜 中央静脉阻塞等），玻璃体内VEGF含量明显增加。而在玻璃体内注射VEGF亦可诱导视网膜 新生血管化。另外，临床实验发现抗VEGF疗法可观显抑制眼内新生血管反应。
[0006] VEGF家族和胚胎血管生成VEGF在胚胎血管生成中起主导作用。现已证明，在人3 个月孕早期和足月的胎盘中VEGF mRNA即已存在。在动物实验中发现，只要缺乏VEGF两个 等位基因中的任何1个，胚胎均最终死亡，原因是心血管系统形成失败。
[0007] 由于VEGF家族能明显促进新生血管生成，故可从不同层次抑制其功能，来预防和 治疗新生血管相关性疾病。目前，抑制剂主要针对VEGF。
[0008] 现有的抗VEGF抑制策略包括：
[0009] 1)蛋白抗体可直接中和VEGF蛋白，从而抑制VEGF的生物效应。
[0010] 2)可溶性VEGF受体能特异地结合VEGF，间接阻断VEGF与其受体作用。
[0011] 3) VEGF受体阻断剂与VEGF受体结合，进而阻止其与VEGF作用，也起到了抑制 VEGF的作用。
[0012] 4)反义VEGF -组特异的核苷酸序列，能与VEGF mRNA结合，干扰VEGFmRNA的翻译 和VEGF蛋白的生成。
[0013] 5) VEGF信号传导阻断剂与VEGF受体结合后将产生受体自磷酸化等一系列信号传 导，通过阻断传导途径，达到抑制VEGF作用的目的。
[0014] 可特异性结合VEGF165的制剂哌加他尼钠（Pegaptanib，商品名Macugen)是最早 获批用于眼科的抗VEGF类药物；此后，能广泛结合VEGF165及其他所有VEGF-A异构体的 雷珠单抗（Ranibizumab，商品名Lucentis)相继上市。这些抗VEGF制剂为治疗新生血管 及血管性疾病导致的黄斑水肿带来革命性的改变。如果Ranibizumab的显著疗效是由于其 广泛结合所有VEGF-A异构体而非仅仅结合VEGF165,那么广谱结合VEGF家族所有成员的 药物则有望获得更好疗效。能广谱作用于VEGF家族成员的新一代抗VEGF药物阿柏西普 (Aflibercept，眼用制剂VEGF Trap-Eye,商品名Eylea)已于2011年11月上市。
[0015] 虽然单抗药物已经取得一系列临床治疗作用，但仍存在不少问题，比如单抗的靶 点单一，目前仅针对VEGF165,对于其他VEGF亚型缺乏针对性。且单抗的研发成本高，周期 长，制备成本高。
[0016] siRNA是一段21 - 25个碱基对的RNA分子，发现于单细胞生物抵御病毒侵袭的机 制。单细胞生物针对入侵病毒的mRNA序列合成出一段与之互补的siRNA，主动结合mRNA， 从而阻断病毒的复制。siRNA因其独特的靶点特异性、结构可设计性和代谢安全性，成为科 研界普遍看好的新的治疗药物。然而，在过去的20年里，研究人员设计了一系列的载体用 于siRNA的体内输送，但仅有极少数进入临床阶段，迄今，仍未有一个载体得到FDA认证，一 个有效载体的缺位，导致核酸物质体内输送仍然处于临床瓶颈期。
[0017] 将核酸物质输送到靶细胞的胞浆或细胞核内，需要克服一系列的体内输送屏障， 因此，核酸载体是否高效，是其能否用于临床治疗的关键所在。核酸物质输送的载体一般为 以下两类：（1)病毒载体：病毒载体（如慢病毒载体、腺病毒载体）作为基因的输送载体， 虽然有较高的体外转染活性，然而，其免疫原性与易导致突变的缺点为临床试验带来了巨 大的安全问题，使得其应用受限。（2)非病毒载体：非病毒载体的优势主要在于，在保证预 期的转染活性的条件下，可以大大降低病毒载体所带来的免疫原性与诸多炎症反应，其一 般为以下两种载体设计：(a)阳离子脂质体；(b)聚阳离子基因载体。而目前研究更多的主 要集中于聚阳离子基因载体与阳离子脂质体的修饰，使之适用于基因物质的靶向输送。阳 离子脂质体具有较高的体内外转染活性，然而，由于表面的正电荷影响其体内的正常分布， 同时，由于选用阳离子脂质，免疫原性与炎症反应在动物试验中也成为不可避免的缺点之 一 (Gao, K. &Huang, L. Nonviral methods for siRNA delivery. Molecular pharmaceutics 6, 651-658(2008).)。
[0018]由于siRNA序列与沉默对象蛋白的高度特异性，以及当前siRNA合成的 低成本，使siRNA序列可实现低成本的开发，并可同时实现多靶点蛋白的沉默， 从而可生成低成本、高效、高安全性的产品。目前，已有大量文献报道构建靶序 列 5, -GGAGUACCCUGAUGAGAUC-3'（Takei Y，et al. A small interfering RNA targeting vascular endothelial growth factor as cancer therapeutics.Cancer research2004;64(10):3365-70.)#&5，-AUGUGAAUGCAGACCAAAGAA-3'（FilleurS，et al. SiRNA-mediated inhibition of vascular endothelial growth factor severely limits tumor resistance to antiangiogenic thrombospondin-land slows tumor vascularization and growth. Cancer research 2003 ;63 (14): 3919-22.)可有效抑制人 体VEGF的表达。
【发明内容】
[0019] 本发明目的在于提供一种治疗血管增生的聚阳离子核酸复合物纳米颗粒，以解决 现有的抑制血管增生的抗VEGF药物存在的上述技术问题。
[0020] 本发明的另一目的在于提供上述的治疗血管增生的聚阳离子核酸复合物纳米颗 粒的制备方法，以解决现有的抑制血管增生的抗VEGF药物存在的上述技术问题。
[0021] 本发明的再一目的在于提供上述的聚阳离子核酸复合物纳米颗粒在制备治疗血 管增生的药物中的应用。
[0022] 本发明目的通过以下的技术方案实现：
[0023] -种治疗血管增生的聚阳离子核酸复合物纳米颗粒，所述纳米颗粒包含聚阳离子 核酸材料和基因物质，所述聚阳离子核酸材料与基因物质的质量比为1?1〇〇 :1。
[0024] 优选地，所述聚阳离子核酸材料由低分子量的聚乙烯亚胺（PEI)与含二甲醛的链 接剂以亚胺键构成，所述聚阳离子核酸材料的结构式为：
[0025]
【权利要求】
1. 一种治疗血管增生的聚阳离子核酸复合物纳米颗粒，其特征在于，所述纳米颗粒包 含聚阳离子核酸材料和基因物质，所述聚阳离子核酸材料与基因物质的质量比为1?100 : Io
2. 如权利要求1所述的纳米颗粒，其特征在于，所述聚阳离子核酸材料由低分子量的 聚己帰亚胺（PEI)与含二甲酵的链接剂W亚胺键构成，所述聚阳离子核酸材料的结构式 为：
其中，X为含二甲酵的链接剂衍生的基团。
3. 如权利要求2所述的纳米颗粒，其特征在于，所述聚己帰亚胺的分子量低于2000。
4. 如权利要求2所述的纳米颗粒，其特征在于，所述聚己帰亚胺选自直链聚己帰亚胺 或支链聚己帰亚胺。
5. 如权利要求2所述的纳米颗粒，其特征在于，所述链接剂选自戊二酵、对苯二甲酵、 间苯二甲酵、邻苯二甲酵、2, 5-咪哇二甲酵、2, 4-化巧二甲酵、2, 5-化巧二甲酵、2, 6-化巧 二甲酵、2, 5-化嗦二甲酵或2, 6-化嗦二甲酵的其中一种。
6. 如权利要求1所述的纳米颗粒，其特征在于，所述基因物质选自RNA或DNA，所述RNA 包括 5, -GGAGUACCCUGAUGAGAUC-3' 或 5, -AUGUGAAUGCAGACCAAAGAA-3,；所述 DNA 为构建的 质粒DNA，所述质粒DNA包括功能基因序列、启动子序列和抗性基因，所述质粒DNA的功能基 因序列包括 5' -GGAGUACCCUGAUGAGAUC-3'或 5' -AUGUGAAUGCAGACCAAAGAA-3'。
7. 如权利要求6所述的纳米颗粒，其特征在于，所述RNA的分子量为19-2化P。
8. 如权利要求1所述的纳米颗粒，其特征在于，所述聚阳离子核酸材料与基因物质的 质量比为优选为5?50 ;1，更优选为10?30:1。
9. 权利要求1所述的治疗血管增生的聚阳离子核酸复合物纳米颗粒的制备方法，其特 征在于，包括W下步骤： 聚阳离子核酸材料的水溶液和基因物质的水溶液混合，在室温静置20-60分钟即可制 成所述纳米颗粒。
10. 权利要求1所述的聚阳离子核酸复合物纳米颗粒在制备治疗血管增生的药物中的 应用。
【文档编号】C08J3/24GK104257630SQ201410504891
【公开日】2015年1月7日 申请日期:2014年9月26日 优先权日:2014年9月26日
【发明者】袁伟恩, 陈顺, 车俊怡, 原明璐 申请人:上海交通大学