纳米孔装置和用于核酸分析的方法

专利名称：纳米孔装置和用于核酸分析的方法
技术领域：
本发明涉及确定来自例如遗传物质(诸如DNA)的核酸材料的信息的领域。特别地， 本发明涉及借助纳米孔装置的快速核酸分析的领域。特别是，本发明涉及一种布置成与遗传物质样品协作的纳米孔装置，该纳米孔装 置包括
-用于容纳核酸样品的输入室； -利用第一纳米孔连接到输入室的第一室；
-在第一纳米孔两端施加电势差的装置，该电势布置成通过第一纳米孔汲取遗传物质 样品的第一片段；
-能够在电势差影响下流动通过第一纳米孔的电解溶液，该流动作为第一离子电流可 被检测到，第一离子电流的变化表示由第一纳米孔检测到第一靶分子。
背景技术：
包括遗传物质的核酸材料的结构和组成，特别是基因定序以及与特定疾病关联的 基因标记的鉴定，变得越来越重要。在生物医学和制药工业以及关联研究中，正更加重视精 确且迅速的信息收集。特别是，为了向定点照护应用提供遗传信息，应快速地获悉与疾病关 联的遗传方式或者对药物治疗的反应。正在发展多种方法和装置来促进这一点。已经发现，生物传感器元件能够以单个碱基的分辨率来识别各个DNA链，碱基为 用于在DNA中编码信息的四种可能类型的分子(A、C、G或T)之一。特别是，利用了所谓的 纳米孔。这些纳米孔为薄层中以许多可能几何形状形成的典型地IOOnm或更小的开口。使 待定序的遗传物质片段经过或者强制通过该开口。样品形状或者样品分子与纳米孔分子的 临时结合导致各种碱基的特性在检测装置中的配准，从而促进定序。在来源上，纳米孔可以 是生物学的或合成的。每个纳米孔对于所期望的检测是特异的，且因此可以制成用于特定 基因序列(例如，与具体癌症突变关联)或者用于SNP (单核苷酸多态性)(例如与麻醉或化 疗中的药物反应关联)的检测器。与当前定序装置相比，纳米孔的使用允许快速的检测。美国专利申请2007/0054276讨论了多聚核苷酸分析系统和纳米孔分析的方法， 以及如何快速地确定核酸分子的序列以用于识别基因突变和多态性。它公开了以下纳米孔 定序的构思，该纳米孔定序基于物理检测各个核苷酸的属性，或者单个多聚核苷酸中的核 苷酸经过纳米孔开口时核苷酸环境的物理变化(例如电流)。使用纳米孔分析系统可以识别 SNP以测量改性的靶(target)多聚核苷酸的电子签名(例如离子电流或隧穿电流)，改性和 未改性分子的电子签名变得可区分。所使用的纳米孔检测系统包括电子设备，该电子设备 能够测量纳米孔检测系统的结构中的纳米孔开口与多聚核苷酸之间的相互作用的电子特 性。计算机系统控制电子测量并处理所产生的数据。每个单体的体积、形状或电荷会按特 有的方式影响电导。电压梯度施加到纳米孔装置从而将靶多聚核苷酸从开口的一侧汲取到 另一侧。来自同一申请人的美国专利申请2007/0048745进一步公开了用于聚合物的纳米孔分析的装置、系统和方法。J. Amer. Chem. Soc. 128 (2006) 1705和Nature Biotech 19 (2001) 636 中的 论文公开了利用经设计的(engineered)纳米孔而使用生物纳米孔来对单个DNA链进行序 列特定检测。DNA链分子与纳米孔中的分子的结合引起流过纳米孔的离子电流的变化。当前工作集中于用于特异基因序列的纳米孔检测和读出。装置对样品仅进行一种 特异测量。这些当前的装置和方法的问题在于，采集多于一种靶序列的信息是缓慢的，需要 进行重复的测量。因而，本发明的目的是提供一种改进的装置，该装置能够更快地提供更多的定序 fn息ο

发明内容
根据本发明，该目的通过下述设置来实现 -利用第二纳米孔连接到输入室的第二室，
-在该第二纳米孔两端施加的电势差与该第一纳米孔两端的电势差相等且相同 (equal to and common with),
-在该第二纳米孔两端的电势布置成通过该第二纳米孔汲取核酸样品的第二片段并 且影响该电解溶液使其流动通过该第二纳米孔，
-该流动作为第二离子电流可被检测到，该第二离子电流的变化表示由该第二纳米孔 检测到第二靶分子。本发明允许将第二室结合到该纳米孔装置中。这允许同时进行两种测量，因而更 快速地获得定序信息。本发明的附加优点在于，该第二纳米孔从与该第一纳米孔相同的输入室接收输入 片段，因此由第一和第二纳米孔处理的样品来自相同的源并且没有可能影响定序结果的老 化效应或其它处理差异。输入到装置的可能样品的实例为多聚核苷酸，诸如是DNA、RNA或 uRNA。在某些情形中，例如对于活检样品，如果样品必须分成两半从而进行两个不同的定序 检测则是非常不利的。存在这样的可能性，样品的不同成分在这两个半份之间可能没有适 当地分布。用于两种测量的单一样品输入消除了这种不精确性。然而，核酸样品不限于天 然核酸。合成或人造的核酸也可以用作样品。本发明的又一个优势在于，在第一和第二纳米孔两端施加的电势差相同。这种一 致性提高了装置的功能性以及所获得的测量结果的可靠性。经过每个纳米孔的片段受到相 同的力，并且电解溶液在具有相似属性的电场下以相同速率通过纳米孔汲取。可以从相同的电压源或者不同的电压源施加该电势差。电压源可以在装置内部或 外部。结合第一和第二室描述了本发明，但本发明不限于两个室，因为可存在经由第三、 第四、第五或第η个纳米孔(所有的纳米孔均受到相同的电势)连接到输入室的第三、第四、 第五或第η个室。纳米孔可以是生物学的或者合成的。每个纳米孔按照定义设计成检测特定靶分 子。(例如 Howorka、Cheley 和 Bayley 在 Nature Biotech 19 (2001) 636 中的论文讨论了如何通过单独DNA寡核苷酸的α溶血素孔的腔内的共价连接实现单链DNA(ssDNA)分子与 拴系(tethered) DNA链的结合)。纳米孔的活性检测成分例如可以是天然或人造核酸。然 而，在本发明中，取决于所使用纳米孔装置的应用情况，在各种室中使用的纳米孔可以彼此 相同、彼此完全不同或者针对多种测量特定纳米孔具有加权分布。生物纳米孔和合成纳米孔以不同方式协作从而改变离子电流的流动，离子电流的 变化记录(register) 了检测到样品片段中存在靶分子。由于样品片段和纳米孔检测分子 之间的结合，生物纳米孔在检测到靶分子时临时地闭合(close)。该结合阻止电解溶液流过 纳米孔，由此停止电荷流动并因此停止离子电流。合成纳米孔典型地由诸如硅的衬底中的 经刻蚀形成的孔洞而形成，所述孔洞由于附连分子的物理存在而闭塞，该附连分子仅在检 测到靶分子时存在。对于大范围的实验，已经证明生物孔是有用的，但是其表现出例如尺寸 固定和稳定性有限的一些缺点。诸如温度和应力的外部因素可能触发这种不稳定性。从固 态材料制作纳米孔允许对纳米孔的直径和通道长度以及表面属性有着更大的控制。输入室和第一室之间的连接在上文中被描述为单一纳米孔，但是应理解，通过多 个纳米孔(所有纳米孔同等地接入输入室样品片段)并行地形成的连接不应被排除。根据本发明的纳米孔装置布置成与核酸样品协作。然而，纳米孔装置也能够与其 它材料的样品协作，所述其它材料包括但不限于蛋白质、肽、糖、糖脂、脂类以及合成聚合物 或分子。在本发明的上下文中，“样品”可以来自生物来源。涵盖生物流体，诸如淋巴液、尿 cerebral fluid)、Bronco Leverage Fluid (BAL)、ifiU夜、(
液。还涵盖组织，诸如上皮组织、结缔组织、骨头、诸如内脏或平滑肌以及骨骼肌的肌肉组 织、神经组织、骨髓、软骨、皮肤、黏膜或毛发。在本发明的上下文中，“样品”也可以是取自环境来源的样品，诸如植物样品、水样 品、土壤样品，或者可以取自家庭或工业来源或者也可以是食物或饮料样品。在本发明的上下文中，“样品”也可以源于生物化学或化学反应的样品，或者源于 制药、化学或者生物化学组成的样品。样品的数量优选地为ΙΟΟΟμΙ或更少，更优选地500μ1或更少，甚至更优选地100μ1 或更少，最优选地50μ1或更少。在适当情况下，例如对于固体样品或粘稠悬浮液的情形，在本发明中使用之前，样 品可能需要用溶剂溶解、均质化或萃取从而获得液体样品。液体样品因此可以是溶液或悬 浮液。在本发明中使用之前，液体样品可以进行一种或多种预处理。这种预处理包括但 不限于稀释、过滤、离心处理、预浓缩、沉淀、透析、溶菌、洗脱、萃取和析出。预处理也可以包括将例如下述化学或生物化学物质添加到溶液酸、碱、缓冲剂、 盐、溶剂、反应性染料、清洁剂、乳化剂、螯合剂、酶、离液剂。纳米孔检测装置可以应用于许多环境，不过尤其用于
-已知序列的定量检测，所谓的“无PCR”检测(PCR为聚合酶链反应)，其中感兴趣的数 据是所存在的某种核苷酸序列或基因的数量并且纳米孔设置成检测该特定序列。- SNP (单一核苷酸多态性)检测，其中纳米孔布置成检测序列中的突变。-定序，其中最终目标是确定核酸的碱基对序列。
在本发明另一实施例中，纳米孔装置进一步包括利用第三纳米孔连接到该输入室 的第三室，在该第三纳米孔两端施加的电势差与在该第一纳米孔两端施加的电势差相等且 相同，在该第三纳米孔两端施加的电势布置成通过该第三纳米孔汲取该核酸样品的第三片 段并且影响该电解溶液使其流动通过该第三纳米孔，该流动作为第三离子电流可被电流检 测器检测到，该第三离子电流的变化表示检测到用于验证装置测量的控制靶分子。对于某些类型的样品片段，某些序列或者总是存在或者总不存在。为了测量这种 序列或者确认它们的存在，给出正或负指示剂以支持对样品片段进行其它测量。这提高了 整体测量结果的质量。在本发明另一实施例中，关联装置布置成关联由至少两个离子电流的变化表示的 检测。每个离子电流代表检测到特定靶分子。纳米孔装置可以布置成利用不同纳米孔来 检测若干不同靶分子。然而，如果这些检测与另一分子的检测相关联地发生，则单独分子的 检测会更有意义或更感兴趣。因而通过关联离子电流的变化，可以提取额外的信息。其实例为，随时间将第一和第二离子电流之间的变化关联以确定与正常基因序列 相比突变出现的频率。例如在肿瘤学领域，这将是有意义的。关联装置也可用于将正或负指示剂的检测(例如第三离子电流)与样品检测(例如 第一和/或第二离子电流)进行比较，从而确定有效装置功能性。在本发明另一实施例中，该第一靶分子为选定的野生型基因序列并且该第二靶分 子为同一基因序列中的特异突变，用于突变的统计学出现的相对检测。这是该装置的具体实施例，其涉及研究两种类型的DNA，这对于在癌症治疗中发展 新策略是重要的。待分析的基本样品包括野生及突变的至少两种类型DNA。突变样品可包 括诸如核苷酸的SNP (单一核苷酸多态性)、删除或插入之类的突变。本发明的装置可用于 对这些物质在样品中出现的平衡进行简单的定量检测。可以分析特异突变基因(例如肿瘤 抑制基因或致癌基因)在癌细胞群落中出现的范围。这在确定治疗决策中将是非常重要的 诊断工具，并允许个性化处理——例如突变基因可以是经过验证的药物靶，或者在手术中 无癌细胞的切除边缘将被确定。特别地，当与第一和第二靶分子(分别为野生和突变DNA)的检测的关联相组合时， 野生型样品片段的10个结合事件可以仅对应于突变样品片段的3个结合事件。通过在例 如1小时的时间段上关联所述检测来研究该信息，随后将促成这样的结论所研究样品的 3/13或大约23%含有缺陷的突变材料。该数字对于临床决策将是有意义的。在本发明另一实施例中，至少一个纳米孔为生物纳米孔。
在本发明另一实施例中，生物纳米孔布置成与脂双层协作。根据本发明的一种基于生物纳米孔的方法将可应用于小型定序装置，尤其用以在 定点照护进行简单、快速且不昂贵的突变检测。在本发明另一方面中，提供了一种制造纳米孔装置的方法，该方法包括下述步 骤
一提供用于容纳核酸样品的输入室；
一提供利用第一纳米孔连接到该输入室的第一室；
一提供在电势差影响下能够流动通过该第一纳米孔的电解溶液；一提供在该第一纳米孔两端施加电势差的装置； 一提供借助第二纳米孔连接到该输入室的第二室，以及
一布置所述装置，以在该第二纳米孔两端施加与在该第一纳米孔两端的电势相等且相 同的电势差。本发明允许将第二室结合到纳米孔装置中。这允许同时进行两个测量，由此更快 地获得定序信息。本发明的优点在于，在第一和第二纳米孔两端施加的电势差相同。这种一致性提 高了装置的功能性以及所获得的测量结果的可靠性。经过每个纳米孔的片段受到相同的 力，并且电解溶液在具有相似属性的电场下以相同速率通过纳米孔汲取。可以从相同的电压源或者不同的电压源施加该电势差。电压源可以在装置内部或 外部。结合第一和第二室描述本发明，但本发明不限于两个室，因为可存在经由第三、第 四、第五或第η个纳米孔(所有的纳米孔均受到相同的电势)连接到输入室的第三、第四、第 五或第η个室。纳米孔可以是生物学的或者合成的。每个纳米孔按照定义设计成检测特定靶分 子。纳米孔的活性检测成分例如可以是天然或人造核酸。然而，在本发明中，取决于纳米孔 装置所使用的应用情况，在各种室中使用的纳米孔可以彼此相同、彼此完全不同或者针对 多种测量的特定纳米孔具有加权分布。对于大范围的实验，已经证明生物孔是有用的，但是其表现出例如尺寸固定和稳 定性有限的一些缺点。诸如温度和应力的外部因素可能触发这种不稳定性。从固态材料制 作纳米孔允许对纳米孔的直径和通道长度以及表面属性有着更大的控制。输入室和第一室之间的连接在上文中被描述为单一纳米孔，但是应理解，通过多 个纳米孔(所有纳米孔同等地接入输入室样品片段)并行地形成的连接不应被排除。在本发明另一方面中，提供了一种使用纳米孔装置的方法，其中借助该第一纳米 孔检测野生基因序列并且借助该第二纳米孔检测所述基因序列的特异突变。这是该装置的具体实施例，其涉及研究两种类型的DNA，这对于在癌症治疗中发展 新策略是重要的。待分析的基本样品包括野生及突变的两种类型DNA，且本发明的装置可以 用于对这些物质在样品中出现的平衡进行简单的定量检测。可以分析特异突变基因(例如 肿瘤抑制基因或致癌基因)在癌细胞群落中出现的范围。这在确定治疗决策中将是非常重 要的诊断工具，并允许个性化处理——例如突变基因可以是经过验证的药物靶，或者在手 术中无癌细胞的切除边缘将被确定。在本发明的另一方面中，提供了一种方法，其关联由第一或第二离子电流以及第 三离子电流至少之一的变化表示的检测以产生表示有效装置测量的信号。关联装置也可用于将正或负指示剂的检测(例如第三离子电流)与样品检测(例如 第一和/或第二离子电流)进行比较，从而确定有效装置功能。对于某些类型的样品片段，某些序列或者总是存在或者总不存在。为了测量这种 序列或者确认它们的存在，给出正或负指示剂以支持对样品片段进行其它测量。这提高了 整体测量结果的质量。在本发明另一方面中，提供了一种方法，其关联由至少两个离子电流的变化表示的检测以产生离子电流之间的比较关系。这样的实例为，随时间将第一和第二离子电流之间的变化关联以确定与正常基因 序列相比突变出现的频率。例如在肿瘤学领域，这将是有意义的。举例而言，当与第一和第二靶分子(分别为野生和突变DNA)的检测的关联相组合 时，野生型样品片段的10个结合事件可以仅对应于突变样品片段的3个结合事件。通过在 例如1小时的时间段上关联所述检测来研究该信息，随后将促成这样的结论所研究样品 的3/13或大约23%含有缺陷的突变材料。该数字对于临床决策将是有意义的。


现在将参考附图进一步阐述本发明。图1说明根据本发明的纳米孔装置。图2说明包括对装置测量的有效性进行控制的装置的本发明另一实施例。图3说明包括多个室的本发明另一实施例。图4说明其中多个室布置成阵列形式的本发明另一实施例。图5说明制造根据本发明的纳米孔装置的方法。图6说明使用根据本发明的纳米孔装置的方法。对于附图之间一致的特征，附图标记的编号保持一致。
具体实施例方式图1描绘根据本发明的纳米孔装置100。该装置包括用于将核酸材料的样品(未 示出)输入到输入室120的样品输入110，该核酸材料的样品诸如是DNA、RNA或uRNA，其被 制备成小片段(未示出)。对于DNA，这些小片段具有负电荷。输入室120布置成经由第一 纳米孔135连接到第一样品室130且经由第二纳米孔145连接到第二样品室140。纳米孔 135、145进一步包括特异检测分子(未示出)，该特异检测分子针对纳米孔的所需要的检测 功能被定制。电解溶液(未示出)存在于室120、130、140中且包括带电颗粒。施加电势差的 装置150布置成使得纳米孔135、145 二者的两端存在电势差。(施加电势差的这个装置在 此处被示为位于纳米孔装置100内部，但是这不应解读为是限制性的，因为如果需要，也可 以使用外部装置)。第二纳米孔145两端的电势差与第一纳米孔135两端的电势差相等且 相同。电势差的效果是通过纳米孔135、145汲取电解溶液的离子，且也单独地通过纳米孔 135、145汲取样品的小片段。通常，对于DNA，样品片段带负电荷，这导致施加电势的装置以 这样的方式布置纳米孔135、145的输入室120侧处于地电势且纳米孔的第一室130和第 二室140侧处于正电势，从而在正确方向上(此处由箭头160和165指示)通过纳米孔135、 145汲取带电样品。(然而，这只是施加电势的装置的可能布置的一种实例。将理解，可以按 其它方式实现负到正电压降，这取决于待分析的样品，反向电势会是合适的)。当通过每一 个纳米孔135和145汲取电解溶液时，产生离子电流。因而通过第一纳米孔135的流动形 成第一离子电流，通过第二纳米孔145的流动形成第二离子电流。利用纳米孔135、145对 靶分子的检测引起该离子电流的变化。对于DNA定序的当前实例，生物纳米孔在检测时将 临时闭合，由此阻断电解溶液的流动且临时停止离子电流。该离子电流和流动停止由一种 用于电流检测的装置(未示出)来检测。
样品输入室120的共同性允许在同一时间段内对同一样品进行不同的测量和检 测。这对于测量结果的一致性是有益的，并且避免了分离样品的问题，分离样品会影响靶分 子在样品中的统计分布。此外，相同电势差的施加确保了由不同纳米孔进行的不同测量是 在相同外部条件下进行的。这有助于通过纳米孔装置确定的数据的可靠性和精确性。注意，输入室120以及第一室130和第二室140在图1中示为在布局上是线性和 二维的且在形状上呈方形。这不应解读为是限制性的，因为取决于纳米孔装置100的要求， 本发明允许任意形状的室120、130、140且还允许室以三维布置。图2示出包括纳米孔装置200的本发明另一实施例。该装置为纳米孔装置100的 延伸且包括与该装置相同的特征。然而，通过添加第三室210来增大纳米孔装置200，第三 室210利用第三纳米孔220连接到输入室120。该纳米孔允许沿箭头230的方向的电解溶 液(未示出)的流动以及样品片段(未示出)的通过。(同样，这是针对如图1中所描述特定样 品的方向，并且对于纳米孔装置200，不应解读为是限制性的)。纳米孔220按与前述纳米孔 135、145相同的方式操作，并且形成用于检测的第三离子电流。在此实施例中，第三纳米孔220包括检测分子或机制以检测总是存在于样品片段 中而与基因突变无关的特定序列。因而该纳米孔记录了经过该纳米孔的每个样品片段通过 的检测。这给出正结果，该正结果可以用作纳米孔装置200的功能的有效性检查。该结果 可以被输入到关联装置(未示出)，用于与来自其它纳米孔135、145的检测进行计算比较。这种使用第三室设置的有效性检查不局限于正测量结果。取决于纳米孔装置200 的应用，第三纳米孔220也可以被设计以检测其中预期是负检测结果的序列。同样，室130、140、210的形状不限于所说明的形状和设计，并且布局可以以二维 或三维形式布置。图3说明本发明的另一可能实施例，其中纳米孔装置300包括在中央输入室320 周围的多个室 311、312、313、314、315、316、317、318。每个室 311、312、313、314、315、316、 317、318独立于其它室，但是每个室利用纳米孔连接到输入室320，分别为每个室提供了单 一纳米孔341、342、343、344、345、346、347、348。(本发明不应解读为限制于此处或在任何其 它实施例中示出的单一纳米孔，而是可以布置成具有并行的多个纳米孔开孔以将每个室连 接到输入室)。纳米孔341、342、343、344、345、346、347、348受到相同的电势差，并且布置成 以相同方式操作，如前文所述。(施加电势差的装置未示出)。经由流过纳米孔(未示出)的 电解溶液，对于每个纳米孔产生离子电流，该离子电流被检测，并且这些电流的变化表示检 测到样品中的靶分子(未示出)。图4描绘纳米孔装置400包括阵列405的本发明的另一实施例，其中阵列405包 括各个室 410、411、412、413、414、415、416、417、418，每个室分别经由纳米孔 420、421、422、 423、424、425、426、427、428而远程连接到具有样品输入440的输入室430。相同的电势差布 置成从施加电势的相同装置(未示出)施加于纳米孔420、421、422、423、424、425、426、427、 428两端。纳米孔装置400进一步包括连接装置以将样品从输入室分别引导至各个室410、 411、412、413、414、415、416、417、418，该连接装置在此处示为各个导管 450、451、452、453、 454、455、456、457、458、459，但是不限于此特定实施例。纳米孔的操作以及与该操作(例如 离子电流检测)关联的装置如先前所描述。阵列405可以被支持在衬底(未示出)上，该阵 列也可包括引导输入430和室410、411、412、413、414、415、416、417、418之间的样品流动的装置(未示出)。图5说明一种用于制造根据本发明的纳米孔装置的方法。该方法涉及提供用于 容纳核酸样品的输入室510，提供利用第一纳米孔连接到输入室的第一室520，提供在电势 差影响下能够流动通过第一纳米孔的电解溶液530，提供在第一纳米孔两端施加电势差的 装置M0，提供借助第二纳米孔连接到输入室的第二室550，以及布置所述装置，以在该第 二纳米孔两端施加与在该第一纳米孔两端的电势相等且相同的电势差560。图6说明根据本发明的纳米孔装置的方法。该方法涉及借助该第一纳米孔检测野 生基因序列610以及借助该第二纳米孔检测所述基因序列的特异突变620。这种方法对于确定样品中突变基因的定额是尤为重要的，该定额可以表示具体癌 症疾病的进展或者表示个性化护理的最佳处理。附图标记列表 100纳米孔装置 110样品输入
120输入室
130第一室
135第一纳米孔
140第二室
145第二纳米孔
150施加电势差的装置
160表示在电势差影响下第一样品片段移动通过第一纳米孔的方向的箭头 165表示在电势差影响下第二样品片段移动通过第二纳米孔的方向的箭头 200纳米孔装置 210第三室 220第三纳米孔
230表示在电势差影响下第三样品片段移动通过第三纳米孔的方向的箭头
300纳米孔装置
311…318第一至第八室
320输入室
330样品输入
341…348第一至第八纳米孔 400纳米孔装置 405阵列
410…418第一至第九室
420至428第一至第九纳米孔
430输入室
440样品输入
450第一至第九导管
510方法步骤
520方法步骤530方法步骤540方法步骤550方法步骤560方法步骤610方法步骤620方法步骤。
权利要求
1.一种纳米孔装置(100)，布置成与核酸样品协作，该纳米孔装置包括 -用于容纳该核酸样品的输入室(120);-利用第一纳米孔(135)连接到该输入室的第一室(130)；-在该第一纳米孔(135)两端施加电势差的装置(150)，该电势布置成通过该第一纳 米孔(135)汲取(160)该核酸样品的第一片段；-能够在该电势差影响下流动通过该第一纳米孔(135)的电解溶液，该流动作为第一 离子电流可被检测到，该第一离子电流的变化表示由该第一纳米孔(135)检测到第一靶分 子；其特征在于，该纳米孔装置进一步包括 -利用第二纳米孔(145)连接到该输入室的第二室(140)；-在该第二纳米孔(145)两端施加的电势差与该第一纳米孔(135)两端的电势差相等 且相同；-在该第二纳米孔(145)两端的电势布置成通过该第二纳米孔(145)汲取(165)该核 酸样品的第二片段并且影响该电解溶液使其流动通过该第二纳米孔(145)；-该流动作为第二离子电流可被检测到，该第二离子电流的变化表示由该第二纳米孔 (145)检测到第二靶分子。
2.如权利要求1所述的纳米孔装置(200)，进一步包括利用第三纳米孔(220)连接到 该输入室(120)的第三室(210)，在该第三纳米孔(220)两端施加的电势差与在该第一纳米 孔(135 )两端施加的电势差相等且相同，在该第三纳米孔(220 )两端施加的电势布置成通 过该第三纳米孔(220)汲取(230)该核酸样品的第三片段并且影响该电解溶液使其流动通 过该第三纳米孔(220)，该流动作为第三离子电流可被电流检测器检测到，该第三离子电流 的变化表示检测到用于验证装置测量的控制靶分子。
3.如权利要求1或2所述的纳米孔装置(100)，进一步包括关联装置，该关联装置布置 成关联由至少两个离子电流的变化表示的检测。
4.如上述权利要求中任意一项所述的纳米孔装置(100)，其中该第一靶分子为选定的 野生基因序列并且该第二靶分子为同一基因序列中的特异突变，用于突变的统计学出现的 相对检测。
5.如上述权利要求中任意一项所述的纳米孔装置(100)，其中至少一个纳米孔为生物 纳米孔。
6.如权利要求5所述的纳米孔装置，其中该生物纳米孔布置成与脂双层协作。
7.一种制造纳米孔装置的方法，包括下述步骤 提供用于容纳核酸样品的输入室(510)；提供利用第一纳米孔连接到该输入室的第一室(520)；提供在电势差影响下能够流动通过该第一纳米孔的电解溶液(530)；提供在该第一纳米孔两端施加电势差的装置(540)；其特征在于该方法进一步包括下述步骤提供借助第二纳米孔连接到该输入室的第二室(550)，以及布置所述装置，以在该第二纳米孔两端施加与在该第一纳米孔两端的电势相等且相同 的电势差(560)。
8.一种使用如权利要求1所述的纳米孔装置的方法，包括下述步骤 借助该第一纳米孔检测野生基因序列(610)；借助该第二纳米孔检测所述基因序列的特异突变(620)。
9.一种使用如权利要求2所述的纳米孔装置的方法，包括下述步骤关联由该第一或第二离子电流以及该第三离子电流至少之一的变化表示的检测以产 生表示有效装置测量的信号。
10.一种使用如权利要求1或2所述的纳米孔装置的方法，包括下述步骤关联由至少两个离子电流的变化表示的检测以产生离子电流之间的比较关系。
全文摘要
描述了一种纳米孔装置，其中提供了样品输入(110)、输入室(120)以及经由第一和第二纳米孔(135、145)连接到输入室(120)的第一和第二样品室(130、140)。
文档编号G01N15/12GK102099668SQ200980127789
公开日2011年6月15日 申请日期2009年2月17日 优先权日2008年7月17日
发明者范德斯托尔佩 A., J. A. 范万鲁伊 E., 麦克库 E., J. 范德扎格 P. 申请人:皇家飞利浦电子股份有限公司