专利名称：一种用蚕生产抗肿瘤治疗药物的方法
技术领域：
本发明涉及到通过家蚕杆状病毒表达系统用蚕幼虫和蛹制备人内皮抑素的方法，本发明还涉及用蚕幼虫和蛹生产人内皮抑素制备抗肿瘤治疗药物的方法。
本发明提供了含有人内皮抑素的大肠杆菌质粒pUC-Endo，以人肝脏组织mRNA为模板，通过RT-PCR扩增，在5’端引物引进BamHI酶切位点，在3’端引入XbaI位点，PCR产物经Klenow酶补平克隆进入pUC19的SmaI位点(宝灵曼公司)，构建质粒pUC-Endo。
本发明还提供了含人内皮抑素基因的杆状病毒转移质粒pBac-Endo。从pUC-Endo质粒用BamHI和XbaI酶切，将目的片段连在同样被BamHI和XbaI酶切的pBacPAK8上(CLONTECH公司)，构建含人内皮抑素基因的杆状病毒转移质粒pBac-Endo(
图1)。
本发明还提供了含人内皮抑素基因的重组家蚕杆状病毒BmBacEndo。将转移质粒pBac-Endo与家蚕核型多角体病毒DNA进行共转染家蚕(Bombyx mori)细胞BmN，进行10轮空斑和Southern点杂交筛选筛选出含人内皮抑素基因的重组昆虫杆状病毒BmBacEndo，该病毒已提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，地址在北京中关村，保藏日期为2001年7月2日，保藏编号为GMCC NO0592。
本发明还提供了人内皮抑素基因在家蚕五龄幼虫和蛹中的表达产物。将重组杆状病毒BmBacEndo感染BmN家蚕细胞进行病毒扩增，然后将扩增后的重组杆状病毒BmBacEndo注射至五龄家蚕幼虫和蛹体内，分别取24、48、72、96、120小时的家蚕幼虫和蛹淋巴血，经5000rpm5分钟离心后取上清，稀释10倍后加等体积的2×蛋白上样缓冲液，取20ul进行12％的SDS-PAGE分析。用考马斯亮蓝R250染色，结果见图2。从SDS-PAGE和Wersten印迹(图3)结果可以看出，人内皮抑素基因在家蚕幼虫和蛹中的表达产物为20kD，与天然产物大小一致。
本发明还对人内皮抑素的的表达产物进行了生物活性的鉴定。病毒感染细胞的抽提物1-5天的细胞表达产物均表现出不同程度的抑制活性，到第三天达到抑制率达90.1％。取BmBacEndo注射家蚕幼虫和蛹体表达产物血淋巴(第五天)2ul倍比稀释后，加入96孔板中(每孔铺有1×104内皮细胞)，测定表达产物对内皮细胞的抑制活性，结果发现最高的抑制率达87.3％。
本发明还提供了在家蚕幼虫表达的人内皮抑素进行纯化。发病5天后收集蚕血清先经离心和硫酸铵沉淀后上Sephadex G150柱和MonoQ柱分离，每次收集样品均经测活，确定其活性存在，进一步用HPLC阳离子交换柱和阴离子交换柱纯化，获得纯度为95％的重组蛋白。
本发明还将家蚕幼虫和蛹体表达人内皮抑素制成口服药物。在家蚕幼虫和蛹体表达人内皮抑素，经过过滤(100KD超滤)，30000rmp离心后经冷冻干燥后，以家蚕幼虫和家蚕蛹为填充料配制成口服药物。
本发明还对用家蚕幼虫蚕蛹表达的人内皮抑素进行动物试验。将C57小鼠荷瘤部位切开(购自浙江大学医学院)，取出肿瘤，切成2mm3的均匀碎片，植入正常C57小鼠皮下，随机分成5组。口服给药剂量分别为30mg/kg和10mg/kg，每天给药，连续30天。注射给药剂量为3mg/kg和1mg/kg，隔天给药，连续30天，另一阴性对照，以相同体积喂水。结果如表1，在肿瘤大小给药组和对照组有明显差异，肿瘤抑制效果显著，表明口服和注射药物均具有明确的抗肿瘤作用。
综合所述，本发明的优点如下用蚕高效表达人内皮抑素，可以避免直接从动物体内纯化存在的操作烦琐、产率底、生产成本高等缺点，不会造成公害；家蚕是可以无菌大规模饲养经济昆虫，可以低成本地大规模饲养；蚕体中有多种天然蛋白质保护剂，对表达产物有保护作用，使基因表达产物十分稳定；家蚕生产的蛋白可以口服药物，为患者解除了注射的痛苦和被感染的威胁。
权利要求
1.一种用蚕生产抗肿瘤治疗药物的方法，其特征在于通过基因工程方法获得重组的带人内皮抑素基因的家蚕(Bombyx mori)重组杆状病毒，该病毒已提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，地址在北京中关村，保藏日期为2001年7月2日，保藏编号为CGMCC NO.0592，并用该病毒接种家蚕幼虫和蛹进行表达人内皮抑素。
2.根据权利要求1所述的一种用蚕生产抗肿瘤治疗药物的方法其特征在于还包括分离，纯化家蚕表达的人内皮抑素的步骤。
3.根据权利要求2所述的一种用蚕生产抗肿瘤治疗药物的方法，其特征在于还包括冷冻干燥家蚕表达的人内皮抑素的步骤。。
4.根据权利要求3所述的一种用蚕生产抗肿瘤治疗药物的方法其特征在于还包括以家蚕为填充剂制备口服药物的步骤。
5.根据权利要求1所述的一种用蚕生产抗肿瘤治疗药物的方法，其特征在于所述的通过基因工程方法获得重组的带人内皮抑素基因的家蚕(Bombyx mori)重组杆状病毒包括人内皮抑素基因的杆状病毒转移质粒pBac-Endo的构建是通过RT-PCR方法合成的人内皮抑素基因片段，克隆进入经SmaI酶切的pUC19位点，将人内皮抑素基因片段克隆进入转移载体pBacPAK-8中，获得的重组转移载体质粒pBac-Endo。
6.根据权利要求1所述的一种用蚕生产抗肿瘤治疗药物的方法，其特征在于所述的通过基因工程方法获得重组的带人内皮抑素基因的家蚕(Bombyx mori)重组杆状病毒包括人内皮抑素基因的重组家蚕杆状病毒BmBacEndo的构建是通过重组转移载体pBac-Endo DNA与家蚕核型多角体病毒DNA进行共转染家蚕细胞经10轮空斑筛选和Southern杂交斑筛选获得重组病毒BmBacEndo。
7.根据权利要求1所述的一种用蚕生产抗肿瘤治疗药物的方法，其特征在于所述的人内皮抑素基因在家蚕幼虫和蛹中的表达产物是通过重组杆状病毒BmBacEndo注射至五龄家蚕幼虫和蛹体内表达产生。
全文摘要
本发明公开了一种用蚕生产抗肿瘤治疗药物的方法，该方法属于生物技术制药工程中的基因工程生产多肽类药物技术领域。通过家蚕杆状病毒表达系统(Bombyx mori Nuclear polyhedrosis Virus)重组带有人内皮抑素基因，获得重组病毒，该病毒已提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保存，地址在北京中关村，保藏日期为2001年7月2日，保藏编号为CGMCC NO.0592，将该重组病毒接种家蚕幼虫、蛹进行表达，经分离纯化，冷冻干燥，制成注射和口服药物，经动物试验，对小鼠具有明显的抑制肿瘤生长的作用，成为一种制备抗肿瘤的治疗药物的新型方法。与现有技术相比，原料易得，生产成本低，治疗效果良好。
文档编号C12N15/63GK1408430SQ0114214
公开日2003年4月9日 申请日期2001年9月14日 优先权日2001年9月14日
发明者张耀洲, 金勇丰, 吴祥甫 申请人:浙江中奇生物药业股份有限公司