专利名称：一种广谱、耐高温的高比活植酸酶及其编码基因和表达的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种植酸酶及其编码基因。本发明还涉及含有改植酸酶的表达载体和含有该表达载体的重组酵母细胞。
目前在单胃动物如鸡、猪等饲料中是添加无机磷如磷酸氢钙来满足动物对磷的需求。但是在主要以植物性饲料为主的动物日粮中本身就含有丰富的磷，只不过是因为它们主要以动物不能利用的植酸磷的形式存在而已。
植酸磷是谷物、豆类和油料等作物籽实中磷和肌醇的基本贮存形式，含量高达1-5％(Lolas M.Et al.Food Sci.421094-1097，1977).它占植物中总磷的60-80％(Nelson T.S.Poultry Sci.47862-871，1967).但是以植酸磷形式存在的磷却因单胃动物体内缺乏能分解植酸的酶而难以被利用(Cromwell G.L.Biotechnology in the Feed Industry，Lyons T.P.ed.AlltechTechnical Publication，Nicholasville，KY，133-145)，其利用率仅在0-40％。
植酸磷不能被单胃动物有效利用，从而在饲喂过程中造成了许多问题，第一、造成磷源浪费。一方面饲料中的磷源不能得到有效利用，另一方面为了满足动物对磷的需求，又必须在饲料中额外添加无机磷，提高了饲料成本。在实际生产中，添加无机磷时还常因无机磷中残留有氟、重金属等元素而造成动物中毒。第二、形成高磷粪便而污染环境。饲料中85％左右的植酸磷会被动物直接排出体外，粪便中大量的磷使水和土壤受到严重污染。目前许多欧洲国家如荷兰等已因此问题开始限制畜禽的养殖数量。我国是畜牧生产大国，单胃动物占畜禽总数的比例远高于西方国家，因此，防止磷对环境的污染在我国更具有特殊的意义。第三、植酸磷还是一种抗营养因子，它在动物肠胃道的消化吸收过程中会与多种金属离子Zn2+、Ca2+、Cu2+、Fe2+等以及蛋白质螯合成相应的不溶性复合物，从而降低了动物对这些营养元素的有效利用(Sharma C.B.et al.,Phytochemistry.17201-204，1978).
植酸酶(EC.3.1.3.8)是一种能水解植酸的酶类。它能将植酸磷降解为肌醇和磷酸。植酸酶广泛存在于微生物中，如枯草芽孢杆菌(Paver，V.K.J.，Bacteriol.1511102-1108，1982)，假单孢杆菌(Cosgrove D.J.，Austral.J.Biol.Sci.231207-1220，1970)，乳酸杆菌(Shirai K.，Letters Appl.Biol.Sci.19366-369，1994)，大肠杆菌(Greiner R.，Arch Biochem.Biophys.303107-113，1993)，酵母(Nayini N.R.et al.Lebensm Wiss.Technol.1724-26，1984)，曲霉(Yamada K.et al.Agric.Biol.Chem.321275-1282，1986；Van Gorcom R.F.M.et al.，US Patent No.5436156，1995)。其中来源于A.ficuum NRRL3135(A.niger var.awamori)的植酸酶(Van Gorcom R.F.M.et al.，US Patent No.5436156，1995)具有较好的耐热性，在酸性条件下有较高的酶活性，被认为是目前最有应用前景的饲用植酸酶，它的最适pH值为2.5和5.5，最适温度为55℃，特异比酶活性为1×105U/mg酶蛋白。
植酸酶的饲喂效果已在世界范围内得到了确证(Ware J.H.et al.，USPatent No.3297548，1967；Nelson T.S.et al.，J.Nutrition 1011289-1294，1971；Nelson T.S.et al.，Poult Sci.471842-1848，1968)。它可使植物性饲料中磷的利用率提高60％，粪便中磷排泄量减少40％，还可降低植酸磷的抗营养作用。因此对提高畜牧业生产效益及降低植酸磷对环境的污染有重要意义。
随着饲料工业的发展，植酸酶已经成为饲料添加剂和酶制剂研究的热点。重点的研究方向之一就是解决在天然微生物中植酸酶的表达量太低，不能大量获得廉价的植酸酶产品，难以满足饲料工业发展的需求(Han，1989)。随着生物技术、基因工程等高新技术的发展，人们意识到通过基因工程的手段，利用生物反应器来高效表达植酸酶基因可望达到大幅度提高植酸酶产量、降低生产成本的目的(Conneely et al.，1992)。
植酸酶基因表达的研究主要集中在来源于A.niger(ficuum)的酸性植酸酶基因phyA和phyB上。如1993年在A.niger ALK02268中表达了源于A.niger var.awamori的植酸酶基因phyA，其表达量比原菌株提高了几倍(Piddington C.S.，1993；)。同年，将来源于A.ficumm NRRL3135的phyA基因导回原菌株，使phyA基因的拷贝数增加到15个以上，从而使植酸酶的表达量提高到7600U/mL(Van Hartingsveldt W.et al.，1993)。Moore E.等在A.oryzae中表达来源于酵母Saccharomyces cerevisiae的植酸酶基因和来源于A.niger762的phyB基因，其结果也是使表达量分别提高到840U/mL和750U/mL(Moore E.et al.，1995)。以上的这些表达研究，从总体上看，其表达水平还较低，但却证实了利用基因工程手段来提高植酸酶的表达、生产量这一途径的有效性。
1995年Van Gorcomd等(Van Gorcom R.F.M.et al.，1995)将酸性植酸酶基因phyA重组到黑曲霉中，使植酸酶在重组菌株中的表达量达到了2.8×105U/mL，与天然植酸酶产生菌株相比有了大幅度的提高，大大降低了植酸酶的生产成本。这是目前国外报道的植酸酶最高表达水平，也是国外目前植酸酶工业生产所采用的菌株。
1997年本实验室的“863”项目研究小组构建的基因工程酵母在小试水平上其酸性植酸酶的表达量达到5×105U/mL(相当于每毫升发酵液中表达5mg植酸酶蛋白)(Bin Y et al.，1998；姚斌等，1998；姚斌等，中国发明专利97121731.9，2000)，中试水平上将表达量提高到8×105U/mL发酵液，比原始的天然菌株Aspergillus niger963中的植酸酶表达量高3000倍，比国外正在用于商品化生产酸性植酸酶的基因工程曲霉(Van Gorcom R.F.M.et al.，1995)高一倍以上。目前已开始工业化生产。
植酸酶的热稳定性是其能在饲料中广泛应用的关键因素之一。在饲料生产上，饲料加工都需经过一个制粒工艺，在制粒过程中有一个持续时间为数分钟的高温，温度一般在75～93℃，饲料用酶制剂在此高温下活性大幅度地不可逆丧失。但另一方面，饲料用酶又必须在常温下具有较高的酶活性，因为饲料用酶最终的作用场所又是动物正常体温(37℃左右)的肠胃道中，这与工业上所使用的一些高温酶不同。目前，虽已报道从嗜温微生物中分离到几种高温植酸酶，如Myceliophthora thermophila、Aspergillus terreus等中植酸酶，其最适温度在70～80℃，具有很好的耐温性，但它在37℃下的酶活性极低，在饲料中没有使用价值，而相反，来源于A.niger等的植酸酶在37℃下具有高酶活性，但它又不能经受制粒时的高温。目前还未曾报道过同时具备了耐短暂的制粒高温、又能在动物正常体温下具有高酶活性这双重性质的优良植酸酶。目前生产上使用的植酸酶均是来源于A.niger的不耐热的植酸酶，在70℃以上制粒时，绝大部分酶活性不可逆地丧失，因而它只能应用于不需制粒的粉料饲料中而不能应用于颗粒饲料中。
以往的研究主要集中在用于单胃畜禽动物饲料中的植酸酶，如来源于酵母Saccharomyces cerevisiae(Bajwa et al.，1984；Meyhack et al.，1982)、Aspergillus niger(MacRae，1988)、A.terreus和Myceliophthorathermophila(Van Loon，1995)、A.niger(ficuum)(Van Hartimgsveldt et al.，1993；Ehlich et al.，1993；Bin Y et al.，1998)、A.niger var.awamori(Piddington et al.，1993)、Talaromyces thermophilus(Pasamontes Let al.，1997)、Talaromyces lanuginosus(Berka R M et al.，1998)、Emericellanidulans(Pasamontes L et al.1997)、Schwanniomyces occidentalis(Mochizuki，1998)等的植酸酶。而这些植酸酶在pH6.5以上基本没有酶活性。
单胃畜禽和淡水鱼类饲料中都需要使用植酸酶，但它们对植酸酶的性质有不同的要求。对单胃畜禽而言，植酸酶的主要作用场所是单胃动物酸性的胃中，因而要求植酸酶在酸性条件下要有较高的酶活性，即酶反应的最适pH值为酸性的植酸酶，如国外目前商品化生产的来源于A.ficuum NRRL3135(A.niger var.awamori)的植酸酶PHYA(Van Gorcom etal.，1995)，它的最适pH值为2.5和5.5。我国用基因工程酵母生产的植酸酶PHYA2最适pH值为1.8和5.5(姚斌等，中国发明专利97121731.9，2000)。
而对于淡水养殖的主要鱼类—鲤科鱼类来说，它无胃，只有pH值呈中性(pH6.5～8.0)的肠道，因而在鱼类饲料中必需使用在中性pH值条件下有高活性的植酸酶。目前商品化生产的用于单胃畜禽的植酸酶在中性pH值环境下基本没有酶活性，因而不能用于鲤科鱼类饲料。1998年Kerovuo等曾报道筛选到一株产植酸酶的芽孢杆菌，并克隆了其编码基因。这一植酸酶最适pH为7.5，基因全长1203bp，编码400个氨基酸。此植酸酶的酶活性必需严格依赖高浓度Ca2+的存在，使其应用前景受到限制。同时，它在pH6.0以下基本没有活性，不能应用于单胃动物饲料中。到目前为至，还未有在酸性和中性环境下均具有高酶活性的广谱pH植酸酶的报道。
本发明的另一个目的是提供一种编码本发明的植酸酶的DNA分子。所述的DNA分子可以具有SEQ ID NO1的核苷酸序列。
本发明筛选到一种天然菌株，它所产生的植酸酶具有好的热稳定性，同时它在常温下又具有高酶活性，即耐高温的中温型植酸酶(酶反应的最适温度在中温)。本发明筛选到天然菌株是一株曲霉Aspergillus sp.，它所产生的植酸酶PHYA3的最适温度为55℃，为中温型植酸酶，同时，此酶在80～90℃下处理30分钟后冷却到常温，能够可逆性地恢复其酶活性的85％以上，具有很好的耐热性。这种性质使其具备了既能耐受饲料制粒的高温又能在动物体内常温的环境下维持高的酶活性这双重性质，这种性质的植酸酶还未曾有过报道。如国外目前商品化生产的来源于A.ficuumNRRL3135(A.niger var.awamori)的植酸酶PHYA(Van Gorcom etal.，1995)、我国用基因工程酵母生产的植酸酶PHYA2(姚斌等，中国发明专利97121731.9，2000)等的最适温度虽在55℃左右，但70℃以上处理后酶活性不可逆地丧失。而报道的来源于Myceliophthora thermophila、Aspergillus terreus等中的植酸酶，虽具有较好的耐热性，但其最适温度在70～80℃，在常温下的酶活性极低，在饲料中没有使用价值。
本发明筛选到的曲霉Aspergillus sp.所产生的植酸酶PHYA3的最适pH峰较宽且平，为5.5～7.5，同时在pH3～8的范围内均具有高的酶活性。这种性质使其具备了既能应用于单胃动物饲料有能应用于淡水鱼类饲料中，这种广谱的植酸酶还未曾有过报道。例如，国外目前商品化生产的来源于A.ficuum NRRL3135(A.niger var.awamori)的植酸酶PHYA(VanGorcom et al.，1995)的最适pH为5.5和2.5，在pH6以上基本没有活性，只能应用于单胃动物饲料中而不能用于淡水鱼类饲料中，而报道的来源于芽孢杆菌的植酸酶(Kerovuo，1998)是唯一一个其最适pH在中性(7.5)的植酸酶，但它又不能用于单胃动物饲料中。
本发明筛选到的曲霉Aspergillus sp.所产生的植酸酶PHYA3的比活性达到了310000U/mg酶蛋白，比国外目前商品化生产的来源于A.ficuumNRRL3135(A.niger var.awamori)的植酸酶PHYA(Van Gorcom etal.，1995)、我国用基因工程酵母生产的植酸酶PHYA2(中国发明专利97121731.9，2000)等的比活性高2～3倍。
本发明通过PCR的方法分离克隆了这一植酸酶基因phyA3，DNA全序列分析结果表明，phyA3结构基因全长1455个核苷酸，其中+48～+104的57个核苷酸序列是一典型的真菌内含子序列。phyA3基因编码465个氨基酸，N端的25个氨基酸为信号肽。从氨基酸推断出的理论分子量约为60kDa。来源于曲霉的中性植酸酶是一糖基化蛋白，在phyA3编码的氨基酸序列上，发现了7个潜在的N-糖基化位点(Asn-X-Ser/Thr，X为任意氨基酸)。通过对氨基酸序列进行分析，推断出植酸酶的活性位点序列(Active-site sequence)为CRITLVQVLSRHGARYPTSSKSK，它位于氨基酸序列的+70～+92。RHGERYPS是不同微生物来源的植酸酶活性位点中最保守的序列(Ullah，1993)，其中核心序列RHGRYPT高度保守。
此植酸酶蛋白与来源于丝状真菌的植酸酶在氨基酸序列上有一定的同源性，与曲霉来源的植酸酶同源性较高，其中与来源于Aspergillusniger(ficuum)的PHYA(Van Gorcom R F M et al.，1995)同源性最高，为66％。与细菌来源的植酸酶无同源性。
本发明的植酸酶可通过PCR技术、定点突变技术、基因设计后化学合成等技术来改造，使用表达系统进行表达。可选择的表达系统包括低等真核表达系统如酵母、丝状真菌等；原核表达系统大肠杆菌、芽孢杆菌、乳酸杆菌、杆状病毒等；高等真核表达系统如玉米、大豆、水稻、猪、鸡、鸭及各种鱼类和昆虫等。本发明中，为了使植酸酶基因能在毕赤酵母中高效表达，我们通过PCR的方法将植酸酶基因phyyA3原有的信号肽序列和内含子除掉，改造后的植酸酶基因插入到带有α-因子信号肽序列的酵母表达载体上，经转化酵母细胞后，稳定整合到酵母染色体上，此重组酵母经发酵培养后，表达的植酸酶蛋白在信号肽的引导下分泌到培养基中。经测定，植酸酶表达量达到520000U/mL，其表达水平是原始菌株A.sp.高4000倍，也比国际表达水平最高的专利(Van Gorcom R.F.M.et al.，Patent No.US 5436156，1995)所报道的高近一倍。
本发明提供了使改造后的植酸酶基因在表达系统中高效表达的具体方法。包括整套重组表达载体的构建、受体菌的遗传转化方法、重组子的筛选与分子鉴定方法以及重组子中植酸酶的表达方法。本发明采用毕赤酵母(P.pastoris)做为植酸酶基因的表达受体，是因为与Van Gorcom R.F.M.等的专利(Patent No.US 5436156，1995)所采用的宿主菌霉菌相比，毕赤酵母具有很多方面的优势，第一，霉菌的生长繁殖周期比毕赤酵母长很多，生物体生长周期长是生物工程的大忌；第二，霉菌的营养生长是通过菌丝体尖端的伸长生长实现的，这种生长特性尤其适合固体培养，而并不适合现代发酵工艺所常用的液态发酵，一般而言固体发酵工效低，周期长，成本高，由此使获得大量发酵产品的成本比之液态发酵要增加很多。相比之下，毕赤酵母是通过裂殖而增加营养体的，这种繁殖特性十分适合液态发酵；第三，霉菌营养体在生长发育期间需要提供足够的较复杂的碳氮有机养分，这也会增加发酵成本，毕赤酵母营养体的生长发育主要利用廉价的简单养分如甲醇、葡萄糖和氨水等，获得同等量的营养体毕赤酵母比霉菌消耗的养分要便宜得多。酵母的高细胞密度、低成本发酵方法已经建立(Siegel R.S.，Biotechnol.Bioeng，34403-404，1989)，发酵培养基中所使用的碳源、氮源、盐、微量元素和生物素等都很便宜；第四，霉菌特有的霉味会降低牲畜的适口性，而毕赤酵母发酵产生的一种酱香味具有良好的诱食作用；第五，毕赤酵母含有多种大量的促进生长的有机化合物，如低聚糖、核苷酸、各种氨基酸、短肽等，这些优势都是霉菌比不上的或所不具有的；第六，在真核生物表达系统中，酵母，包括毕赤酵母在内无疑是研究得最为详透的，在进行分子生物学操作时，酵母比霉菌更为容易、方便和有效。到目前为止，我们还未见到有利用酵母表达、生产植酸酶的报道，但酵母作为一种良好的真核表达系统已成功地高效表达出许多具有生物活性的外源基因产物，如1989年报道的在酵母中表达了具有全部生物性活性的溶菌酶(Diyan M.E.，Bio/Tech.7160-164，1989)，其表达量达到了550mg/L发酵液。又如，鼠表皮生长因子也在酵母中得到了高效表达，其表达量达到450mg/L。第七、毕赤酵母本身具有很好的安全性，曾作为单细胞蛋白广泛应用，酵母培养基中不含有毒物质和致热源，所以重组酵母表达的植酸酶就可以不用分离纯化而能直接以酵母培养物的形式添加到饲料中，可降低植酸酶的生产成本；第八、表达的植酸酶在信号肽的引导下会分泌到培养基中，这使植酸酶直接暴露出来而无需破碎酵母菌体，也为把包含植酸酶的酵母培养物直接作为饲料添加剂提供了可能；以上这些优势都是利用黑曲霉做为植酸酶表达受体(Van Gorcom R.F.M.et al.，Patent No.US 5436156，1995)所不具备的，它为利用重组酵母工业化大规模、低成本发酵生产植酸酶奠定了基础。
本发明还提供了重组的植酸酶基因工程菌株的高密度发酵、植酸酶蛋白大量产生的方法，为植酸酶工业化发酵生产奠定基础。本发明提供的以葡萄糖为碳源、氨水为氮源、葡萄糖—甲醇(均为廉价的工业原料)混合饲喂的菌体高密度发酵方法，使用通用的发酵装置即可，与国外以曲霉为生产菌株的发酵方法(Van Gorcom R.F.M.et al.，Patent No.US5436156，1995)相比，在发酵原料、发酵时间及最终的发酵产物植酸酶的量上均有所不同(表2)，在发酵原料的成本上，本发明全为较廉价的工业原料，而曲霉发酵时还需有甘露-葡聚糖、酵母提取物、水解酪蛋白等天然有机提取物，因而本项目的原料成本将比曲霉发酵低得多；发酵时间本项目为108-132小时，曲霉发酵为140-200个小时，在发酵过程中的能源消耗上本发明也有优势。而发酵的植酸酶产量(指单位体积发酵液中植酸酶产量)本项目要高出约一倍左右。再加上本发明生产的植酸酶无需纯化而可以直接以酵母培养物的形势做为添加剂，因而总的来说，本发明要比国外用基因工程曲霉来生产植酸酶(Van Gorcom R.F.M.et al.，USPatent No.5436156，1995)更有优势。
本发明分离了一种比活性高、耐热性好而在常温下具有高酶活性、同时适合于在单胃动物和淡水鱼类饲料中使用的新的植酸酶，并进一步克隆了其编码基因。提供了一种在真核表达系统中高效表达植酸酶基因的方法。提供了一种利用重组表达系统廉价发酵生产植酸酶的方法。
图8phyA3中信号肽编码序列的和内含子序列的去除过程图9重组酵母表达载体pFY02的物理图谱
图10重组酵母的Sourthern blotting分析1.受体酵母P.pastoris GS115；2，3，4，5分别为重组子P.Pastoris pFY02-8，44，95，147(Sal I酶切)，分别出现1、2、2、1条特异性杂交带6，7，8，9分别为酵母重组子P.pastoris pFY02-8，44，95，147(EcoRI酶切)，均在1.3kb处出现一条特异性杂交带特异性杂交带；图11重组酵母的Northern blotting分析1.受体酵母P.pastoris GS115；2，3，4.分别为酵母重组子P.pastorispFY02-44，95，147，在约2.0kb处出现一条图12在摇床水平上重组酵母植酸酶表达量与诱导培养时间的关系图13在5L发酵罐中3批次高细胞密度发酵时表达产物植酸酶的积累与诱导时间的关系图14.在5L发酵罐中不同诱导时间所积累的植酸酶的SDS-PAGE1-7分别为诱导后12、24、36、48、60、72、96小时；8为标准蛋白分子量
2.酶与试剂盒限制性内切酶、连接酶、Taq酶、Mung bean酶为Boehringer公司产品。T7DNA sequence kit购于Pharmacia公司。In vitromutagenesis systems Kit、随机引物标记Kit和PCR Kit均购于Promega公司。
3.生化试剂DNA合成试剂为Milipore公司产品。引物合成用ABI公司Cyclone DNA合成仪。IPTG、X-Gal、SDS及植酸钠为Sigma公司产品。TEMED、过硫酸铵、丙烯酰胺及甲叉双丙烯酰胺为Promega公司产品。
4.培养基黑曲霉生长培养基为PDA(20％马铃薯、2％蔗糖、2％琼脂)；黑曲霉产酶筛选培养基为AS(0.1％植酸钙、3％葡萄糖、0.5％NH4NO3、0.05％KCl、0.05％MgSO4.7H2O、0.03％MnSO4.4H2O、0.03％FeSO4.7H2O、1.5％琼脂，pH5.7)；黑曲霉产酶培养基为AP(1.5％葡萄糖、0.3％蛋白胨、0.2％(NH4)2SO4、0.05％MgSO4.7H2O、0.05％KCl、0.003％FeSO4.7H2O、0.003％MnSO4.4H2O，pH5.7)。大肠杆菌培养基为LB(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl，pH7.0)。酵母完全培养基为YPD(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％葡萄糖)；酵母转化培养基为RDB[18.6％山梨醇、2％葡萄糖、1.34％Yeast Nitrogen Base W/O aminoacids(YNB)、0.00004％Biotin、0.005％谷氨酸、0.005％甲硫氨酸、0.005％赖氨酸、0.005％亮氨酸、0.005％异亮氨酸、2％琼脂糖)]；酵母选择培养基为MM(1.34％YNB、0.00004％Biotin、0.5％甲醇、1.5％琼脂糖)和MD(1.34％YNB、0.00004％Biotin、2％葡萄糖、1.5％琼脂糖)；酵母诱导培养基BMGY[1％酵母提取物、2％蛋白胨、1.34％YNB、0.00004％Biotin、1％甘油(V/V)]和BMMY(除以0.5％甲醇代替甘油，其余成份相与BMGY相同)。重组酵母发酵培养基为10×Basal Salts(2.67％磷酸、0.093％硫酸钙、1.82％硫酸钾、1.49％硫酸镁、0.413％氢氧化钾、4％甘油或葡萄糖)；发酵中所用的微量盐溶液PTM1(0.6％硫酸铜、0.008％碘化钠、0.3％硫酸锰、0.02％钼酸钠、0.002％硼酸、0.05％氯化钴、2％氯化锌、6.5％硫酸亚铁、0.025％生物素、0.5％硫酸)。
实验二本实验说明产生植酸酶的天然菌株的筛选程序。
土样按常规稀释后涂布于PDA平板上，28℃培养3～5天，待菌落出现后，挑取菌落转接到筛选平板AS上，28℃培养3天。能产生并分泌植酸酶的菌株将会分解筛选平板中的不溶性植酸钙，形成透明消解圈(图1)。挑取产生透明消解圈的菌株接种于5mL液体产酶培养基AP中，28℃摇振培养2天，按1％接种量转接到50mL产酶培养基中继续培养3天。滤去菌体，上清液用来进行酶活测定。测定方法为0.2mL的酶稀释液加入0.8mL 1.25mmol/L的植酸钠，37℃保温30min，加入1mL 10％TCA终止酶活反应，然后加入2mL硫酸亚铁-钼酸铵显色液，700nm测定无机磷含量。对照为先在0.2mL的酶稀释液中加入1mL 10％TCA使酶灭活，再加入同体积的底物保温。一个酶活性单位(U)定义为在一定条件下，每分钟释放出1nmol无机磷所需酶量为一个酶活性单位。筛选到的菌株经初步鉴定为曲霉，定名为Aspergillus sp.98。
实验三本实验说明植酸酶的纯化程序。
含植酸酶的培养液离心去除菌体后用85％硫酸胺沉淀浓缩，纯化用KTA FPLC快速液相色谱仪(Pharmacia公司)纯化。含酶的浓缩液首先用HiPrep_26/10_Desalting柱脱盐，缓冲液为20mmol/L HAc-NaAc(pH5.0)，流速为5mL/min，收集洗脱峰，接着用离子交换柱Hitrip_SP_Sepharose_XL(5mL)分离，A泵为20mmol/L HAc-NaAc(pH5.0)，B泵为1mol/L NaCl、20mmol/L HAc-NaAc(pH5.0)高盐缓冲液，流速为2mL/min，高盐缓冲液从0～100％梯度洗脱10个柱床，分部收集洗脱峰，通过酶活性测定后的洗脱峰进一步用凝胶柱Superdex 75 HR 10/30纯化，缓冲液同样为20mmol/L HAc-NaAc(pH5.0)，流速为0.5mL/min，收集洗脱峰得到纯蛋白。通过FPLC快速液相色谱仪纯化后的植酸酶蛋白样品在SDS-PAGE上为一单一条带，其N端的氨基酸序列测定为S-K-S-C-D-T-V-D-L…。
实验四本实验说明植酸酶的酶学性质研究程序。
通过FPLC快速液相色谱仪纯化后的植酸酶蛋白用来进行详细的酶学性质研究。
最适pH的测定为底物植酸钠用一系列不同pH值的缓冲液(pH2.0、2.5、3.0、3.5的HCl-Gly缓冲液；pH4.0、4.4、5.0、5.5、5.8的HAc-NaAc缓冲液；pH6.0、6.5的咪唑-HCl；pH7.0、7.5、8.0、9.0的Tris-HCl缓冲液)配制，37℃下在这些不同的缓冲体系中进行酶促反应，测定酶活性。结果(图2)表明，其最适pH峰较宽且平，5.5～7.5的较大的范围内均有80％以上的酶活性。另外在pH3～8的范围内，植酸酶均具有约50％以上的酶活性。
植酸酶的酸碱稳定性测定为植酸酶蛋白在一系列不同pH值的缓冲液中37℃保温30分钟后，稀释后再在37℃、pH6.5的标准缓冲体系中进行酶促反应。结果(图3)表明，在pH2～9的范围内，植酸酶具有很好的酸碱稳定性。
酶促反应在pH6.5、不同温度下保温所测定的植酸酶PHYA3的最适温度(图4)表明，它的最适温度为55℃。
植酸酶的热稳定性测定是将酶在80℃、90℃下保温不同时间再在37℃、pH6.5下测定其酶活性，结果(图5)表明，80℃、90℃下处理5分钟后，植酸酶的剩余酶活性分别为原酶活性的88％和86％，处理30分钟，剩余酶活性还有85％和81.8％，再延长处理时间至60分钟，80℃处理的酶活性变化不大，还在80％以上，90℃处理的也还在60％以上，具有很好的热稳定性。
取定量纯化后的植酸酶蛋白，进行酶活性测定，计算出酶的比活性为310000U/mg。
以上结果表明，植酸酶PHYA3在酸性和中性较宽的pH范围内均具有高酶活性，并且具有很好的耐热性而最适反应温度又在55℃的中温，具有适合于在单胃动物和淡水鱼类饲料中使用的优良特性，同时，它的比活性高达310000U实验五本实验说明从Aspergillus sp.98中克隆植酸酶基因phyA3的程序。
菌株Aspergillus sp.98总DNA的提取采用中性裂解法，及菌株培养5天后收集菌丝，用液氮冷冻菌丝并研磨成粉状，10mg菌丝中加入10mLSDS-TE缓冲液(4％SDS、10mmol/LTris、0.1mmol/LEDTA，pH8.0)在室温下裂解5min，用等体积的酚、酚—氯仿、氯仿依次抽提，乙醇沉淀。
对已报道的来源于曲霉的不同植酸酶基因序列(Kenneth，1993；Piddington，1993；)进行比较，设计合成克隆植酸酶基因所需的PCR引物P1和P2P15’TCGAATTCAACCCTAATTGTCGGTATC 3’P25’CTGAATTCCTATTGGAGTATAGCATAA 3’这两段引物序列都设计在植酸酶结构基因序列之外，引物上设计的酶切位点均为EcoRI。以Aspergillus sp.98的基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增出的约1.5kb的DNA片断用EcoRI酶切后通过琼脂糖凝胶电泳回收纯化，与经EcoRI酶切的载体pUC18于15℃连接过夜，转化大肠杆菌E.coli DH5a，LB培养基上涂板后挑选阳性重组子，提取质粒进行酶切鉴定，得到重组质粒pYB-1(图6)。
通过DNA全序列分析，测定了植酸酶基因的完整DNA序列(图7)。phyA3结构基因全长1455个核苷酸，其中+48～+104的57个核苷酸序列是一典型的真菌内含子序列，其上有真菌内含子的特征保守序列Donor序列、Lariat序列及Acceptor序列(Rambosek，1987)。phyA3基因编码465个氨基酸，根据信号肽序列的结构规则(Von Heijne，1986)推断，N端的25个氨基酸为信号肽，信号肽的切割位点在+25位的Gly之后，这与我们测定的植酸酶成熟蛋白的N端序列相一致。这同时也从一个侧面说明克隆到的这个基因是我们拟分离的目的基因。
来源于曲霉的植酸酶是一糖基化蛋白，在phyA3编码的氨基酸序列上，发现了7个潜在的N-糖基化位点(Asn-X-Ser/Thr，X为任意氨基酸)。从氨基酸推断出的理论分子量约为60kDa。通过对氨基酸序列进行分析，推断出植酸酶的活性位点序列(Active-site sequence)为CRITLVQVLSRHGARYPTSSKSK，它位于氨基酸序列的+70～+92。RHGERYPS是不同微生物来源的植酸酶活性位点中最保守的序列(Ullah，1993)，其中核心序列RHGARYPT高度保守。
植酸酶基因phyA3中G+C含量达到56％，密码子第三位碱基的G+C含量更高达70.6％，在密码子第三位碱基上高频使用G和C碱基是曲霉中高表达蛋白编码序列所具有的特征之一(Lloyd，1991)。
植酸酶蛋白与来源于丝状真菌的酸性植酸酶在氨基酸序列上有一定的同源性，与曲霉来源的酸性植酸酶同源性较高，其中与来源于Aspergillus niger(ficuum)的PHYA(Van Gorcom R F M et al.，1995)同源性最高，为66％。与细菌来源的植酸酶无同源性。
实验六本实验说明植酸酶基因phyA3的改造程序。
为了使phyA3能在酵母中顺利异源表达，本研究去掉了phyA3中信号肽编码序列和内含子序列，具体方法为，参照信号肽编码序列之后的核苷酸序列合成一个23个碱基的寡聚核苷酸片断P3(5’GCGAATTCATGTCCAAGTCCTGC 3’)作为PCR引物，另一引物(5’TCGAATTCTCAACTAAAGCACTC 3’)参照phyA3的3’端序列合成。由于内含子序列是包含在信号肽编码序列之中，所以用这对引物通过PCR的方法扩增到的phyA3基因就是除去信号肽编码序列和内含子序列的完整的植酸酶结构基因编码序列。扩增出的DNA片断用引物上设计的EcoRI酶切后插入到载体pUC18的EcoRI位点上，转化大肠杆菌后筛选阳性重组子。这样就将无信号肽编码序列和内含子序列的phyA3基因克隆到了pUC18上，得到重组质粒pYB-2，通过序列测定证实其序列的正确性(图8)。
实验七本实验说明phyA3在酵母表达载体上的构建程序。
用于构建酵母表达载体的质粒是pFY01(带有α-因子分泌信号)。首先将植酸酶基因插入到上述表达载体的信号肽序列的下游，与信号肽形成正确的阅读框架，然后通过载体与酵母P.pastoris染色体基因组之间的同源重组事件使目的基因稳定整合到酵母染色体上。具体的过程是将去除内含子和信号肽编码序列的植酸酶基因phyA3用EcoRI从质粒pYB-2上酶切下后，电泳回收约1.3Kb的DNA片段，再将它们插入到载体pFY01上的EcoRI位点，得到了用于酵母转化的重组表达载体—pFY02(图9)。这样就将带有α-因子分泌信号的植酸酶基因克隆到了AOX1启动子(Cregg，1988；Tschopp，1987)下游。
实验八本实验是说明酵母转化及筛选重组酵母株系的程序。
质粒pFY02的DNA经DraI酶切后电击转化酵母细胞后，通过体内重组，目的基因将整合到受体酵母基因组中。在外源诱导物甲醇存在的条件下，AOX1启动子可以启动其下游基因的表达，并且信号肽可以指导表达产物进入酵母的分泌途径，经过切割，外源蛋白产物最终分泌至胞外，所产生的植酸酶PHYA3氨基酸序列按设计应与天然存在的成熟植酸酶完全相同。外源蛋白经过这样的代谢途径，可以进行翻译后修饰，例如糖基化等，从而得到具有生物活性的蛋白产物。
首先用2～3倍过量的内切酶DraI消化质粒pFY02的DNA，使之线性化，电泳检测酶切是否完全。用酚抽提，乙醇沉淀，70％乙醇洗两次，冷冻干燥，无菌水溶解，取1～5μgDNA转化毕赤酵母细胞，在RDB固体培养基上涂板，每板涂0.1mL，30℃下将培养皿倒置培养至转化子出现。
转化子可在基本培养基RDB(不含His)上生长，而非转化子不能生长，这是因为受体菌GS115为组氨酸缺陷型，而载体上虽然带有his4基因，但没有酵母复制子，所以载体上的his4基因必须整合进酵母基因组中才能表达。另外，由于重组的酵母细胞中AOX1基因受到破坏，所以它就不能再利用甲醇作为碳源。这样，在以甲醇作为唯一碳源的培养基上转化子就不会生长(或者生长极缓慢)，表现为甲醇利用缺陷型(mut-)。
用无菌牙签从转化平板RDB上挑取his+重组子，首先接种到MM固体培养基上，再接种到MD固体培养基上，如此挑取his+重组子，30℃培养2天。筛选在MD平板上生长正常但在MM平板上有一点生长或完全不生长的克隆子(his+mut-)即为阳性克隆子。
为了筛选得到高表达的重组酵母菌株，直接检测诱导培养基中植酸酶的表达情况。将his+mut-转化子首先在BMGY培养基中培养，待其生长至饱和状态，离心弃BMGY，换入诱导培养基BMMY，在诱导培养36h后取上清液进行植酸酶酶活性分析。通过表达植酸酶的酶活性测定，从200株重组酵母中初步筛选到42株表达植酸酶的重组子，其中表达量最高的4株重组子，分别定名为P.pastoris pFY02-8，44，95，147。
实验九本实施例是说明在分子水平上证实植酸酶基因在酵母中的重组、转录的方法。
重组酵母菌株的甲醇利用缺陷型说明外源基因已经准确整合到酵母基因组中AOX1基因位点，从而破坏了该基因的功能。通过分子检测也证实了这一点。通过酶解的方法破坏酵母的细胞壁，再用SDS破坏细胞膜从而释放出染色体DNA，再经过进一步的纯化处理得到较纯的酵母基因组DNA。
取5μg重组酵母基因组DNA分别进行EcoRI和SalI全酶解，酶解产物进行琼脂糖凝胶电泳，将凝胶中的DNA转移到尼龙膜上进行Southenblotting分析。杂交所用探针为用从重组质粒pYB-2上切下的长约1.0Kb的EcoRI+SalI植酸酶基因片断。探针酶切后电泳回收，用随机引物标记Kit标记探针。结果(图10)表明，不同的重组子(P.pastoris pPIC9A-8，44，95)DNA用phyA3基因两端的EcoRI酶切后，在1.3kb处有一phyA3基因特异杂交带，这证明phyA3基因已整合到酵母基因组中。用SalI酶切phyA3基因内的单一SalI酶切点后进行Southern blotting分析，外源基因整合到酵母基因组中的不同位点会出现不同的杂交带，结果表明，4个重组酵母P.pastoris pFY02-8，44，95，147中，植酸酶基因的拷贝数分别为1、2、2、1个。
破碎经诱导培养的重组酵母细胞提取酵母mRNA，取5μg mRNA进行甲醛变性凝胶电泳，将凝胶上的mRNA吸印到尼龙膜上进行Northernblotting分析。所用探针与Southen blotting分析使用的探针相同。结果(图11)表明，重组酵母中的植酸酶基因均得到了正常的转录。
实验十本实验是说明在摇床水平上重组酵母中植酸酶的表达研究程序重组酵母于30℃下诱导培养36h后，在37℃、pH6.5的条件下，对含表达产物的培养液进行植酸酶酶活性测定，结果表明，不同的转化子所表达的酶量有所差异，其中表达量最高的4个重组子P.pastoris pFY02-8，44，95，147的酶活性分别为23488U/mL、28656U/mL、29636U/mL、22456U/mL。重组酵母表达的植酸酶的性质研究表明，在最适pH、最适温度、酸碱稳定性和热稳定性等酶学性质方面均基本一致。
为了研究重组酵母中植酸酶的表达量与诱导培养时间的关系，酵母重组子P.pastoris FY02-44从诱导培养时起每隔12h取1mL培养液测定植酸酶活性，研究表明(图12)，在诱导培养48h之内，表达的植酸酶随诱导时间的延长而增加，48h之后，再增加诱导表达时间，植酸酶的表达量仅缓慢增加。
实验十一本实施例是说明重组酵母在5升发酵罐中高密度发酵生产植酸酶的程序。
优化后的重组酵母发酵方法如下5％接种Basal Salts培养基C源4％葡萄糖菌体生长阶段N源氨水无机盐↓24h流加25％葡萄糖流量36mL/h/L碳源饲喂阶段↓4h流加25％葡萄糖∶甲醇(8∶1)，碳源—诱导剂流量9ml/h/L混合饲喂阶段↓4h甲醇诱导(维持终浓度为0.3％左右)诱导表达阶段发酵过程分为四个阶段。具体如下1)菌株培养阶段。发酵培养基10×Basal Salts接种前先加入28％氨水使培养基的pH达到5.0(氨水同时也做为菌株生长的氮源)，再按每升培养基加入4.37mL PTM1，5-10％接种种子液，通气搅拌培养18～24h，在培养过程中随着菌株的生长，培养基中的溶氧量由100％逐渐降低，当碳源消耗完后溶氧量将再度升高至80％以上，此时菌体湿重达到90～110g/L。2)碳源饲喂阶段。流加25％葡萄糖(每升中含12mL PTM1)，流加量为36mL/h/L，培养4h。调整通气量使溶氧量始终大于20％。此步结束时菌体湿重达到180～220g/L。3)碳源-甲醇混合饲喂阶段。流加50％葡萄糖∶甲醇(8∶1)培养4h，流加量为9mL/h/L，控制溶氧量始终大于20％。4)诱导表达阶段。加入诱导剂甲醇(每升中含12mL PTM1)，使甲醇终浓度维持在0.3％，溶氧量始终大于20％。在诱导过程中每12h取样一次测定表达的植酸酶的积累量并进行表达蛋白的SDS-PAGE。
从连续3批次的诱导时间与表达产物积累量的关系(图13)来看，随着诱导时间的增加，单位体积发酵液中的植酸酶的活性随之增加，直到直到诱导120小时左右达到高峰，此时酶活性达到5.0～6.0×105U/mL发酵液，随后产物积累量不再随诱导时间的增加而显著增加。三批次发酵之间，表达产物随时间积累的曲线基本一致，说明植酸酶的表达具有很好的稳定性和可重复性。随诱导时间增加发酵液中表达积累的植酸酶的SDS-PAGE分析见图14。结果表明，表达的植酸酶分子量大小约为70kD，比植酸酶的理论分子量大10kDa左右，这证明植酸酶基因不仅得到了表达、有效分泌，而且表达产物还能进行蛋白翻译后修饰—糖基化，而糖基化修饰是植酸酶具备正常酶活性所必需的。
在重组P.pastoris生长、诱导表达的一个发酵周期结束后，直接取这种经诱导表达后的菌液做为种子液(接种量为1％)进行下一轮的发酵过程，累计共进行5轮，在每轮中均对菌株生长的生物量和植酸酶表达量进行测定。另外，取每轮发酵完的菌体铺完全培养基平板，挑取10个单菌落提取基因组DNA进行phyA3的PCR检测。结果表明(表1)，菌株生长的生物量、速度及植酸酶的表达量在各轮中基本保持稳定。PCR的结果也证明，经过5轮的连续培养，phyA3依然稳定整合在P.pastoris基因组中，这些结果证明重组P.pastoris不仅具有良好的遗传稳定性而且具有良好的植酸酶表达的稳定性。
表1.重组毕赤酵母(P.pastoris pPFY02-44)的遗传稳定性及植酸酶基因表达的稳定性传种代数 PCR阳性生长24h的生物量诱导120h植酸酶表达量(菌体湿重g/L)(U/mL)1 100％ 98.2 5.2×1052 100％ 110.1 5.7×1053 100％ 107.5 5.2×1054 100％ 104.0 5.1×1055 100％ 115.3 5.5×105
序列表<110> 中国农业科学院饲料研究所中国农业科学院生物技术研究所<120>一种广谱、耐高温的高比活植酸酶以及编码该酶的基因<130>I2001243<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1455<212>DNA<213>Aspergillus<220><221>CDS<222>(1)..(47)<223><220><221>Intron<222>(48)..(104)<223><220><221>mat_peptide<222>(136)..()<223><220><221>CDS<222>(105)..(1452)<223><400>1atg gtg act ctg act ttc ctg ctt tcg gcg gcg tat ctg ctt tct gg47Met Val Thr Leu Thr Phe Leu Leu Ser Ala Ala Tyr Leu Leu Ser Gly-25 -20 -15gtgagtggct tggatctatt gctcggatag ggctgtggtg ctgattctga aacggag t 105aga gtg tct gcg gca cct agt tct gct ggc tcc aag tcc tgc gat acg 153Arg Val Ser Ala Ala Pro Ser Ser Ala Gly Ser Lys Ser Cys Asp Thr-10 -5 -1 1 5gta gac ctc ggg tac cag tgc tcc cct gcg act tct cat cta tgg ggc 201Val Asp Leu Gly Tyr Gln Cys Ser Pro Ala Thr Ser His Leu Trp Gly10 15 20cag tac tcg cca ttc ttt tcg ctc gag gac gag ctg tcc gtg tcg agt 249Gln Tyr Ser Pro Phe Phe Ser Leu Glu Asp Glu Leu Ser Val Ser Ser25 30 35aag ctt ccc aag gat tgc aga atc acc ttg gta cag gtg cta tcg cgc 297Lys Leu 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23<210>6<211>23<212>DNA<213>Artificial Sequence<220><223>Primer<400>6tcgaattctc aactaaagca ctc 2权利要求
1.一种植酸酶，它具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
2.一种编码权利要求1所述的植酸酶的基因。
3.按照权利要求2所述的基因，它具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
4.一种表达载体，它含有权利要求2或3所述的基因。
5.一种转化的酵母细胞，它含有权利要求4所述的表达载体。
6.按照权利要求5所述的转化的酵母细胞，其中所述的酵母细胞是毕赤酵母细胞。
7.一种饲料，它含有权利要求5所述的酵母细胞。
全文摘要
本发明提供了一种高比活、耐高温、可同时适用于单胃动物和淡水鱼类饲料的广谱植酸酶及其编码基因。本发明还提供了含有本发明的植酸酶基因的表达载体和含有该表达载体的重组酵母细胞。本发明的重组酵母中植酸酶的表达量可达到520000U/mL发酵液。高效表达植酸酶的重组酵母可用来大规模工业化廉价生产饲料用植酸酶。
文档编号C12N1/19GK1405303SQ0114216
公开日2003年3月26日 申请日期2001年9月14日 优先权日2001年9月14日
发明者姚斌, 范云六, 王亚茹, 操时树, 袁铁铮, 史秀云 申请人:中国农业科学院饲料研究所, 中国农业科学院生物技术研究所