在高温下具有活性的hiv-1型o组的逆转录酶的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明为生物技术领域。更具体而言，本发明设及逆转录酶，该逆转录酶在细菌中 表达并纯化，并且具有在多个位置发生修饰的人类免疫缺陷病毒-1型0组化IV-1)的逆转 录酶的氨基酸序列。运些聚合酶在升高的溫度（高于60°c)下比未突变的酶具有更高的活 性。此外，它们在超过70°C的溫度下还保持DNA合成。运些酶的复制保真度与未突变的逆 转录酶不具有显著的差异。
【背景技术】
[0002] 在逆转录病毒中，逆转录酶（RT)为负责复制病毒基因组的酶。RT将单链RNA基因 组转化成能够整合至宿主细胞基因组中的双链DNA中[在LeGrice.JBiol化em，2012; 287:40850-40857中综述]。正是运种聚合酶可W使用RNA或DM作为模板来合成DM。此 夕F，RT还具有核酸内切酶活性（核糖核酸酶H)，运种活性使得RT能够在RNA依赖的DNA合 成过程中降解RNA模板。 阳00引逆转录病毒RT为用于由信使RNA(mRNA)或微RNA(miRNA)得到互补DNA(cDNA)的 有用的酶，当通过传统技术（例如PCR)扩增互补DNA时，其可W用于检测基因在有机体或 组织中的表达。RT的效率在许多生物技术的应用中是重要的。例如用于mRNA的检测，通过 实时PCR的定量，使用"微阵列"的基因表达的研究W及使用大规模测序技术的转录组研究 中。但是，RNA中存在二级结构可W降低运些技术的有效性。在升高的溫度下能够合成DNA 的RT得到利用可W用于改良扩增过程中的产率。
[0004] 由方法学的观点来看，在商业上扩增反应中最常用的RT为禽成髓细胞性白血病 病毒（AMV)、Moloney鼠白血病病毒（MLV) (Cot6andRoth.VirusRes2008 ;1：34:186-202) 的那些，W及人类免疫缺陷病毒1型化IV-1)的RT的变体（在化ziandHersc化orn. VirusRes2008;134:203-220中综述）。AMV和MLVRT是RT-PCR检测中最常用的，但是 AMV的RT在42°C至52°C的溫度范围内具有更好的热稳定性（Gerardetal.NucleicAcids Res. 2002;30:3118-3129)。存在MLVRT的变体，例如AffinityScript(Agilent)或Super ScriptIII(Invitrogen)，它们是市场上出售的在较高的溫度下具有活性的酶（Areziand Hogrefe.NucleicAcidsRes. 2009;37:473-481)。 阳〇化]使用HIV-IRT(分类属于Μ组度亚型））进行的研究证明运些酶比MLVRT具 有更高的活性和热稳定性，但是它们被由系统发生不同且分类属于0组的HIV-1衍生 得到的"野生型"RT变体超越（Aivarczetal.JMolBiol2009;392:872-884;patent W02010130864 (Al))。在用于微管蛋白信使RNA表达中的RT-PCR检测中，MLVRT在超过52°C 的溫度下不能扩增，但是0组或B亚型的"野生型"RT在高达64°C的溫度下是具有活性的， 而且是唯一的首先在 66-68°C下扩增的（A!、arezetal.JMolBiol2009;392:872-884)。 HIV-IRT为由2个亚基组成的异源二聚体，其中一个亚基为560个氨基酸（称为p66)而 另一个亚基为440个氨基酸（称为p51)。p51的序列与p66的氨基酸1-440的序列一致。 HIV-1 0组RT表征为当与B亚型的"野生型"原型比较时，显示出大约20%的氨基酸序列 的差异（Q姐妨瓶如Μ泌euetal.Virology1997 ;236:364-373)。ο组的多种RT表征为比 "野生型"RT具有更高的复制保真度，例如突变V75I，K65R和K65R/V75I的载体。运些RT 在升高的溫度下具有与"野生型"RT所示的相似的热稳定性和催化效率度arrioluengoet al.BiochemJ2011;436:599-607;专利W02012080541(A1))。
[0006] 发明概述
[0007] 本发明设及由人类免疫缺陷病毒1型0组化iv-1)分离得到的并且在一个或多个 位置处修饰的逆转录酶，该逆转录酶比原始的酶具有更高的热稳定性，从而保持了复制保 真度；W及本发明设及所述的逆转录酶用于实施核酸模板的逆转录、扩增或测序的用途。
[0008] 本发明的第一个目的设及多肤，该多肤编码了由HIV-1 0组分离得到的具有RT活 性的蛋白质；在高溫下具有较高的稳定性；在超过75°C的溫度下具有比WT酶更高的活性， 从而保持了复制保真度；W及表征为W下氨基酸序列，其与亲代序列SEQIDNO1具有至少 50%-致性并且在其氨基酸序列中在W下的位置处包含多种改变（例如取代、删除和/或 插入）：
[0009] -与所述的亲代序列的位置358同源的位置，其使用氨基酸精氨酸（时替代原始氨 基酸赖氨酸化）（突变K358R);
[0010] -与所述的亲代序列的位置359同源的位置，其使用氨基酸甘氨酸（G)替代原始氨 基酸丙氨酸（A)(突变A359G);
[0011] -与所述的亲代序列的位置360同源的位置，其使用氨基酸丙氨酸（A)替代原始氨 基酸丝氨酸（S)(突变S360A)。
[0012] 此外，还描述了其他逆转录酶变体，其包含另外变化成组合K358R/A359G/ S360A(通常全部改变），改良了WTRT的热稳定性，W及在升高的溫度下使用RNA作为模板 合成DNA的能力。运些氨基酸变化和插入属于（例如但未限定本发明的范围）W下几组：
[0013] a)在与SEQIDNO1的位置69同源的位置处，通过插入2个氨基酸丝氨酸和甘氨 酸（SSG)来替代氨基酸苏氨酸灯）（突变T69SSG);
[0014] b)在与SEQIDNO1的位置355同源的位置处，通过氨基酸丙氨酸（A)替代氨基 酸苏氨酸灯）（突变T355A);
[0015] C)在与SEQIDNO1的位置357同源的位置处，通过氨基酸蛋氨酸（M)替代氨基 酸谷氨酷胺怕）（突变Q357M);
[0016] d)在与SEQIDNO1的位置478同源的位置处，通过氨基酸谷氨酷胺佩替代氨 基酸谷氨酸巧）（E478曲。
[0017] 作为本发明的具体目的，本发明包括多种HIV-1 0组逆转录酶的变体，该变体被 用作起点并具有上文所述的突变，并且其中具体的多肤序列相当于SEQIDNO3,SEQID NO5,沈QIDNO7和沈QIDNO9 及它们相应的核巧酸序列（SEQIDNO4,沈QIDNO 6,沈QIDNO8,沈QIDNO10)。
[0018] 本发明的另一个目的为载体，其包含编码本发明的逆转录酶的多核巧酸。
[0019] 本发明的另一个目的是包含多核巧酸的细胞，其中所述的多核巧酸编码本发明的 逆转录酶。优选地，所述的细胞为细菌，还要更优选地，为大肠杆菌巧scherichiacoli)。
[0020] 本发明的另一个目的是获得本发明的多肤的方法，该方法包括W下步骤： 阳021] 1)将本发明的载体引入至合适的宿主细胞（本发明的宿主细胞）中；
[0022] 2)在合适的培养基中培养本发明的宿主细胞；W及
[0023] 3)纯化具有RT活性的本发明的多肤。
[0024] 本发明的另一个目的设及本发明的多核巧酸用于获得具有逆转录酶活性的本发 明的多肤的用途。
[00巧]本发明的另一个目的设及本发明的宿主细胞用于获得本发明的多肤的用途。
[00%] 本发明的另一个目的是本发明的多肤在核酸的逆转录、扩增和测序方法中的用 途。其中所述的核酸优选为mRNA。
[0027] 本发明的另一个目的设及包含用于实施本发明所述的各种方法的必需成分的试 剂盒，并且该试剂盒优选地包含： 阳0測 a)本发明的RT;W及
[0029] b)列表中的至少一种成分，包括：
[0030]U缓冲液； 阳03UU)引物； 阳03引 iii)DNA依赖的DNA聚合酶拟及 阳〇3引iv)核巧酸。
[0034] 附图简述
[00对图1.通过RT-PCR扩增RNA片段，其中所述的片段编码由小鼠肝脏的总RNA得到的 肌动蛋白（大约500至950个碱基对）。使用W下所示的酶来进行扩增：(A)HIV-1 0组"野生 型"的RT(RT0_WT*)(孔 7)，W及突变体K358R/A359G/S360A(RT0_3M*)(孔 1)，T355A/Q357M/ K358R/A359G/S360A(RT0_5M*)(孔 2)，K65R/K358R/A359G/S360A(孔 3)，K65R/V75I/K358R/ A359G/S360A(孔 4)，K358R/A359G/S360A/E478Q(RT0_E478Q_3M*)(孔 5)和K65R/K358R/ A359G/S360A/E478Q(孔 6);度)HIV-1 0 组RT的突变体：K358R/A359G/S360A(RT0_3M*)(孔 1)，T69SSG/K358R/A359G/S360A(RT0_T69SSG_3M*)(孔 2)，V148I/K358R/A359G/S360A(孔 3)和F61A/K358R/A359G/S360A(孔4)。所示的溫度是指DNA复制合成反应。孔m和C分 别示出低分子量标记（使用化ndIII消化的地i29隧菌体的DNA)和阴性对照（不具有 cDNA)。在RT0_WT序列中，引入了所示的所有突变。
[0036] 图2.示出了通过实时PCR对野生型RT(由HIV-1M组B亚型BH10度化0)和0组 (RT0_WT*，在图中示为RT0)分离得到）W及突变体（其为本专利的目的RT0_3M* (3M)，RT0_ 64789_31*(3曲和^0_了69556_31*66))^及参照突变体（其携带31变化特征^及1(65尺 和V75I〇(65R/V75I/K358R/A359G/S360A，KV)) -起估计的逆转录效率。（ACTB)表示肌动蛋 白信使RNA的扩增，而（GAPDH)表示甘油醒3-憐酸脱氨酶的信使RNA的扩增。实施逆转录 反应的溫度恰好在各柱状体的上方显示。
[0037]图 3.示出了与RT0_WT* (0_WT)相比，突变体RTRT0_3M* (3M)，RT0_5M* 巧M)，RT0_ T69SSG_3M*(SG)和RT0_E478Q_3M*(3曲的错配末端（G:T，G:G和G:A)的延伸效率。
[00測发明详述
[0039] 逆转录病毒的逆转录酶（RT)为有用的酶，例如其用于由信使RNA获得互补DNA，当 该DNA在扩增时，可W克隆于载体中。理想的是用于该目的的RT具有较高的热稳定性，因为 在运种条件下，RNA中的二级结构的水平被降低，并且运改良了扩增过程。但是，RT为缺乏 校正核酸外切酶活性的酶，因此具有相对高的错误率；因此，对于用于所述目的的RT而言， 理想的是复制保真度提高。 W40] 由HIV-1M组B亚型（例如BH10或HXB。的RT与0组的RT之间存在序列同源性 开始，本发明根据保存在theProteinDataBank(作为文件IRTD(www.pdb.org))中的晶 体学结构，构建了与模板-引物复合物结合的0组RT的分子模型。该结构为唯一一个可 利用的，其中HIV-U在毒株HXB2的情况下）的RT显示与双链DNA(模板-引物）化及靠 近的核巧酸（在运种情况下为dlT巧形成了Ξ元复合物。此外，运是完整的结构并具有良 好分辨率。由基于序列同源性的分子模式开始，在模板-引物与2种酶的相互作用中识别 了重要的位置。该信息用于设计对核酸具有较高的亲和性的0组RT(RTO)的变体。因此， 通过定点诱变，本发明人得到HIV-1 0组RT的4种新的变体，命名为RT0_3M，RT0_5M，RT0_ T69SSG_3M,RT0_E478Q_3M，它们分别包含突变K358R/A359G/S360A,T355A/Q357M/K358R/ A359G/S360A,T69SSG/K358R/A359G/S360A和K358R/A359G/S360A/E478Q。
[0041] 根据与在W02010130864中所述的相似的程序，运些酶可W在大肠杆菌中表达，并 纯化用于随后的表征。观察到与0组的"野生型"RT(RT0_WT)相比，所述的4种酶在通过 RT-PCR的RNA扩增反应（定量（图1)检测和定性（图2)检测）中，在超过75°C的溫度下 都具有较高的DNA聚合酶活性。使用运些酶实施的保真度检测证明它们保持了相对于RT0_ WT的复制保真度（表2和3,图3)。
[0042] 本发明设及由人类免疫缺陷病毒1型0组化IV-1)分离得到的且在一个或多个位 置具有修饰的RT，该RT比WT酶具有更高的热稳定性，从而保持了复制保真度；W及本发明 设及该RT实施模板核酸的逆转录、扩