TGCCTAGTATATTTCCC-3' 阳170] b)用于T355A:
[0171] 5' -ACAGGGAAATATGCTAGGATGAGGGGCGCC-3'和
[0172] 5, -GGCGCCCCTCATCCTAGCATATTTCCCTGT-3， 阳17引C)用于Q357M:
[0174] 5,-GGGAAATATACTAGGATGAGGGGCGCCCACACAAATGAC-3,和 阳 1 巧]5, -GTCATTTGTGTGGGCGCCCCTCATCCTAGTATATTTCCC-3' 阳 176]d)用于E478Q:
[0177] 5' -CCAATCAAAAGGCTCAATTAATGGCAG-3' 和
[0178] 5> -CTGCCATTMTTGAGCCTTTTGATTGG-3'
[01巧]e)引入变化T69S，并插入Ser-Gly:
[0180] 5 ^ -GCTATAAAAAAGAAAGATAGTAGTTCCGGGAAGTGGAGAAAGCTGGTAGAC-3 ^
[0181] 日'-GTCTACCAGCTTTCTCCACTTCCCGGAACTACTATCTTTCTTTTTTATAGC-3 '
[0182] 按照之前所述，使用编码"野生型"HIV-1 0组p66的序列的质粒载体作为模 板，用于引入K358R/A359G/S360A(A1 矿化辉etal.JMolBiol2009;392:872-884;专利 W02010130864)。将突变T355A和E478Q、W及突变T69S(与插入SG有关）分别引入至 K358R/A359G/S360A的质粒载体中，从而得到突变体：T355A/K358R/A359G/S360A,K358R/ A359G/S360A/E478Q和T69SSG/K358R/A359G/S360A。最后，在变化T355A/K358R/A359G/ S360A的表达质粒载体中引入变化Q357M，从而得到突变体T355A/Q357M/K358R/A359G/ S360A。在所有情况下，在诱变后，检查运些质粒中编码p66的区域的序列是正确的，并且仅 包含引入的突变。 。化引 突巧对货转录巧麻偶联PCR扩蜡的效力的影响
[0184] 在不同的溫度下实施逆转录反应，然后在标准的条件下通过PCR来扩增反应产物 (cDNA)(Al规巧zetal.JMolBiol 2009;392:872-884)。通常，在20μl体积（4μl 250mMTris-肥 1 缓冲液（pH8. 3,在 25°C下），其包含 375mMKC1, 15mMMgClz和 50mM二硫苏糖醇； 由小鼠肝脏分离得到的1μ1总RNA(1μg/μ1);4μ14种dNTP的混合物（每种2. 5mM); 1μ1寡（dT)ie(lOOμΜ) ;0. 5μ1核糖核酸酶抑制剂（40单位/μ1);大致浓度为150nM的 RT;剩余部分用水补至20μ1)下实施逆转录反应。开始时，将RNA和寡dT在68°C下溫育 3min。然后加入其它的反应成分（包括RT)，并在所需的溫度下溫育1小时，从而得到cDNA。 最后，通过在92°C下溫育lOmin将酶灭活来终止反应。在标准的条件下，使用Taq聚合酶或 其他类似的酶（例如ExpandHi曲FidelityDNA聚合酶），通过PCR来扩增cDNA。 。化引连时PCR 阳186] 在不同的溫度（37, 50, 68, 75和78°C)下通过实时PCR来测定RT的逆转录的效率。 为了实现此目的，在各试验中实施3个独立的反应。所有的反应均是在20μ1体积巧OmM Tris-肥1缓冲液（pH8. 3)，其包含75mMKC1，3mMMgClz，lOmM二硫苏糖醇；1U/μ1核糖核 酸酶抑制剂（RN化ir成Plus,Promega) ;500μΜ各种dNTP;5μΜ寡（dT)ie;50ng/μ1 小鼠肝 脏的总RNA(Stratagene)W及相应的150nM的RT)下实施的。在上文部分中所述的条件下 进行模板RNA与寡（dT)le的杂交W及cDNA的合成反应。
[0187] 通过定量PCR(qPCR)来测定逆转录的效率，从而计算由β-肌动蛋白和甘油醒 3-憐酸脱氨酶（GAPDH)的信使RNA所生产的cDNA的相对量。为了实现此目的，寡核巧 酸 5' -CTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3' 和 5' -ACCAGAGGCATACAGGGACA-3' 用于肌动蛋白，而 5，-CTCCCACTCTTCCACCTTCG-3'和 5'-CATACCAGGAAATGAGCTTGACAA-3'用于GAPDH。在 10μ1 的最终体积中一式Ξ份进行PCR反应的扩增，其中cDNA的量约等于5ng的总RNA，250ηΜ 的各寡居核巧酸广引物"）和5μ1的化werSybrGreenPCRMasterMix(Applied BiosystemsPN4367659)，化werSybrGreenPCRMasterMix包含AmpliTaq热沁機'DM聚 合酶，dNTPs和其他实施PCR反应所必需的其他试剂。在95°C(lOmin)的最初的变性期后， 使样品经历40个扩增循环（在95°C下，15s;加上在60°C締，Imin)。在该程序结束时包括 60至95°C的变性曲线（2%斜率），从而证明PCR的特异性。在ABI7900HT定量PCR仪器 (AppliedBiosystems)中，在60°C及变性下在所述的步骤中测量巧光。在所有的板中均包 括阴性对照W及基因扩增效率控制曲线。
[0188]使用SDS2. 2. 1程序（AppliedBiosystems)进行数据分析。针对各种样品来计 算ΔCt值：ACt=Ct-Ctfcf，其中Ct为其中观察到明显扩增的周期，为Ctfw由BH10克隆 的WTRT所获得的Ct值的平均值。按照来计算所获得的cDNA的相对量，并将其值表 示为平均值+各试验中所计算的3个值的标准偏差。 。化W复制保真麼的檢测
[0190]通过错配延伸动力学检测来测定RT的复制保真度，所有的测定均是在前稳 态条件下实施的，从而测定各种RT延伸正确或错误配对的模板-引物复合物的能力 (Matamorosetal.J.Mol.Biol. 2008 ；375:1234-1248；Barrioluengoetal.BiochemJ 2011 :436:599-607)。此外，在M13mp2隧菌体的情况下，根据lacZa基因的表达来进行 基因检测度ebenekandKunkel.MethodsEnzymol. 1995 ;262:217-232sBarrioluengoet al.BiochemJ2011 :436:599-607)。
【主权项】
1. 编码具有逆转录酶活性的、由HIV-?ο组分离得到的蛋白质的多肽，其中所述的蛋白 质在高温下具有较高的稳定性；在超过75°C的温度下具有高于亲代酶的活性，从而保持了 复制保真度；并且特征在于其氨基酸序列与亲代序列SEQIDNO1具有至少50%的一致 性，并且其至少包含以下的氨基酸变化： -在与SEQIDNO1的位置358同源的位置处，使用氨基酸精氨酸（R)替代原始氨基酸 赖氨酸（K)(突变K358R); -在与SEQIDNO1的位置359同源的位置处，使用氨基酸甘氨酸（G)替代原始氨基酸 丙氨酸（A)(突变A359G);以及 -在与SEQIDNO1的位置360同源的位置处，使用氨基酸丙氨酸（A)替代原始氨基酸 丝氨酸（S)(突变S360A)。2. 权利要求1所述的多肽，其中所述的氨基酸序列还具有以下其他突变的至少一种或 者它们的组合： a) 在与SEQIDNO1的位置69同源的位置处，通过插入2个氨基酸丝氨酸和甘氨酸 (SSG)来替代代原氨基酸苏氨酸（T)(突变T69SSG); b) 在与SEQIDNO1的位置355同源的位置处，通过氨基酸丙氨酸（A)替代氨代原基 酸苏氨酸（T)(突变T355A); c) 在与SEQIDNO1的位置357同源的位置处，通过氨基酸蛋氨酸（M)替代原始氨基 酸谷氨酰胺（Q)(突变Q357M); d) 在与SEQIDNO1的位置478同源的位置处，通过氨基酸谷氨酰胺（Q)替代代原氨 基酸谷氨酸（E) (E478Q)。3. 权利要求1所述的多肽，其特征在于其序列相当于SEQIDNO3。4. 权利要求1和2所述的多肽，其特征在于其序列相当于SEQIDNO5。5. 权利要求1和2所述的多肽，其特征在于其序列相当于SEQIDNO7。6. 权利要求1和2所述的多肽，其特征在于其序列相当于SEQIDNO9。7. 权利要求1至6所述的多肽，其另外具有位于N-末端的丽S侧翼序列以及位于C-末 端的组氨酸尾部，所述的多肽特征在于其序列相当于以下的任意一种：SEQIDNO13,SEQ IDNO15,SEQIDNO17,SEQIDNO19〇8. 编码具有逆转录酶活性的、由HIV-10组分离得到的多肽的多核苷酸，其中所述的多 肽在高温下具有较高的稳定性；在超过75°C的温度下具有高于亲代酶的活性，从而保持了 复制保真度；并且特征在于其编码了权利要求1至7所述的任意一种核苷酸序列。9. 权利要求8所述的多核苷酸，其特征在于其序列相当于以下的任意一种：SEQID NO4,SEQIDNO6,SEQIDNO8,SEQIDNO10,SEQIDNO14,SEQIDNO16,SEQIDNO 18,SEQIDNO20〇10. 载体，其特征在于其包含权利要求8和9所述的多核苷酸。11. 宿主细胞，其特征在于其包含权利要求8和9所述的多核苷酸或者权利要求10所 述的载体，并且能够生产权利要求1至7所述的多肽。12. 权利要求11所述的宿主细胞，其特征在于其为细菌。13. 权利要求12所述的宿主细胞，其特征在于其为大肠杆菌。14. 用于获得权利要求1至7所述的多肽的方法，其特征在于其包括以下步骤： a) 将权利要求10所述的载体引入至合适的宿主细胞中； b) 在所述的合适的培养基中培养所述的宿主细胞；以及 c) 纯化所述的具有逆转录酶活性的多肽。15. 权利要求8和9所述的多核苷酸用于获得权利要求1至7所述的多肽的用途。16. 权利要求11至13所述的宿主细胞用于获得权利要求1至7所述的多肽的用途。17. 权利要求1至7所述的多肽用于逆转录模板核酸的用途。18. 权利要求1至7所述的多肽用于扩增模板核酸的用途。19. 权利要求1至7所述的多肽用于对模板核酸进行测序的用途。20. 权利要求17至19所述的多肽的用途，其中所述的模板核酸为mRNA或miRNA。21. 逆转录模板核酸的方法，其包括： a) 将所述的模板核酸与权利要求1至7所述的多肽混合； b) 在能够合成DNA的条件下温育步骤（a)所述的混合物，其中所述的DNA与所述的模 板核酸互补。22. 扩增模板核酸的方法，其包括： a) 将所述的核酸与权利要求1至7所述的多肽以及至少一种DNA依赖的DNA聚合酶混 合；以及 b) 在能够扩增DNA的条件下温育步骤（a)所述的混合物，其中所述的DNA与所述的模 板核酸互补。23. 核酸的测序方法，其包括： a) 使所述的核酸与权利要求1至7所述的多肽相接触； b) 在能够合成大量DNA分子的条件下温育所述的混合物，其中所述的DNA分子与所述 的模板核酸互补；以及 c) 分离这种大量的互补DNA分子，从而测定所述的核苷酸序列。24. 权利要求21至23所述的方法，其中所述的模板核酸为mRNA或miRNA。25. 试剂盒，其包含用于实施权利要求21至24所述的方法的必需成分，所述的试剂盒 包含： a) 权利要求1至7所述的多肽；以及 b) 列表中的至少一种成分，包括： i) 缓冲液； ii) 引物； iii)DNA依赖的DNA聚合酶；以及 iv) 核苷酸。26. 权利要求25所述的试剂盒用于实施权利要求21至24所述的方法的用途。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域。更具体而言，本发明涉及逆转录酶，其在细菌中表达并纯化，并且具有人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)O组的逆转录酶的氨基酸序列，其中在位置358,359和360处具有修饰；并且本发明涉及该酶的变体，该变体在位置355和357、或者在478处或者在位置69处(在这种情况下伴有插入2个氨基酸)包含其他的变化。这些聚合酶在高温(高于60℃)下具有比未突变的酶更高的活性。此外，它们在高于70℃的温度下保持了DNA合成的能力。此外，这些酶的复制保真度明与未突变的逆转录不具有明显的差异。
【IPC分类】C12N9/12, C12Q1/68
【公开号】CN105339491
【申请号】CN201480037516
【发明人】L·梅嫩德斯阿里亚斯, T·马塔莫罗斯格兰德, D·阿比亚奥尔加多, V·巴瑞奥卢恩戈费尔南德斯
【申请人】西班牙高等科研理事会
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2014年5月8日
【公告号】EP2998394A1, US20160090580, WO2014184409A1